第五章蛋白質(zhì)化學(xué)共頁課件

1、第五章 蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)是生命活動的物質(zhì)基礎(chǔ)生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)是除水以外，機體組織中最多的組分，占人體干重的45%，占細菌干重的5070% 。1 概述一. 蛋白質(zhì)的生物學(xué)意義是一切生物體中普遍存在的生物大分子，是生物功能的主要載體。生物遺傳形狀（存在于信息大分子DNA中）是通過蛋白質(zhì)來表現(xiàn)的。 酶、調(diào)節(jié)蛋白、轉(zhuǎn)運蛋白、貯存蛋白等 蛋白質(zhì)種類繁多、各具一定的相對分子量（一般在一萬到一百萬，甚至高達數(shù)百萬）、復(fù)雜的分子結(jié)構(gòu)和特定的生物功能。二、蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能1.作為生物催化劑：在體內(nèi)催化各種物質(zhì)代謝反應(yīng)的酶幾乎都是蛋白質(zhì)。2.調(diào)節(jié)代謝反應(yīng)：一些激素是蛋白質(zhì)或肽，如胰島素、生長素。3.運輸載體：如紅細

2、胞中運輸O2、CO2要靠Hb(Hemoglobin血紅蛋白)、運輸脂類物質(zhì)的是載脂蛋白、運鐵蛋白等轉(zhuǎn)運蛋白或叫載體蛋白。4.參與機體的運動：如心跳、胃腸蠕動等，依靠與肌肉收縮有關(guān)的蛋白質(zhì)來實現(xiàn)，如肌球蛋白、肌動蛋白。5.參與機體的防御： 機體抵抗外來侵害的防御機能，靠抗體，抗體也稱免疫球蛋白，是蛋白質(zhì)。6.接受傳遞信息：如口腔中的味覺蛋白、視網(wǎng)膜中的視覺蛋白。7.調(diào)節(jié)或控制細胞的生長、分化、遺傳信息的表達。8.其它：如雞蛋清蛋白、牛奶中的酪蛋白是營養(yǎng)和儲存蛋白；膠原蛋白、纖維蛋白等屬于結(jié)構(gòu)蛋白。還有甜味蛋白、毒素蛋白等都具有特異的生物學(xué)功能。 所以，我們不難理解，為什么說沒有蛋白質(zhì)就沒有生命。

3、三、蛋白質(zhì)的分類1.根據(jù)分子形狀分：球狀蛋白質(zhì)、纖維狀蛋白質(zhì)2.根據(jù)功能分：活性蛋白質(zhì)、結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)。3.根據(jù)組成分：（1）簡單蛋白質(zhì)：清蛋白、球蛋白、谷蛋白、醇溶谷蛋白、組蛋白、精蛋白、硬蛋白。（2）結(jié)合蛋白質(zhì)：色素蛋白、金屬蛋白、磷蛋白、核蛋白、脂蛋白、糖蛋白。四. 蛋白質(zhì)的水解完全水解：用濃酸、堿將蛋白質(zhì)完全水解為氨基酸。 酸水解：無消旋作用，產(chǎn)物為L-氨基酸。 堿水解：多數(shù)氨基酸被破壞，有消旋現(xiàn)象。部分水解： 一般用酶或稀酸在較溫和條件下，將蛋白質(zhì)分子切斷，產(chǎn)物為分子大小不等的肽段和氨基酸。蛋白酶：(內(nèi)切酶、內(nèi)肽酶）胰蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶等。1.酸水解 條件：510倍的20%的鹽酸

4、煮沸回流1624小時，或加壓于120水解2小時。 優(yōu)點：可蒸發(fā)除去鹽酸，水解徹底，終產(chǎn)物為L-氨基酸，產(chǎn)物單一，無消旋現(xiàn)象。 缺點：色氨酸破壞，并產(chǎn)生一種黑色的物質(zhì)：腐黑質(zhì)，水解液呈黑色。2. 堿水解條件：4mol/L Ba(OH)2或6mol/L NaOH煮沸6小時。優(yōu)點：水解徹底，色氨酸不被破壞，水解液清亮。缺點：產(chǎn)生消旋產(chǎn)物，破壞的氨基酸多，一般很少使用。3. 蛋白酶水解條件：蛋白酶如胰蛋白酶、糜蛋白酶，常溫3740， pH值58 。優(yōu)點：氨基酸不被破壞，不發(fā)生消旋現(xiàn)象。缺點：水解不完全，中間產(chǎn)物多。 蛋白質(zhì)酸堿水解常用于蛋白質(zhì)的組成分析，而酶水解用于制備蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物。一. 蛋白質(zhì)的元

5、素組成 蛋白質(zhì)是有機化合物，離不開C、H、O三種元素，還含有N、P、S、金屬元素等。 含量% ： 5055 67 2023 1517 0.33 微量或無 元素組成 ： C H O N S 其它 蛋白質(zhì)中N是特征元素，且含量恒定，為16%左右 ，即16克氮/100克蛋白質(zhì)，故可以用定氮法測量蛋白質(zhì)含量，即：每100克蛋白質(zhì)含氮16克，100/16=6.25克蛋白質(zhì)含氮1克。所以，每克樣品含氮量6.25100=100克樣品蛋白質(zhì)含量（克%）。 有些蛋白質(zhì)含有其他微量元素：P、Fe、Cu、Mn、Zn、Co、Mo、I 等。 2 蛋白質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)氨基酸二、蛋白質(zhì)分子的基本組成單位氨基酸（一）氨基酸的結(jié)構(gòu)

6、通式：不同氨基酸在于R不同，除了R為H的甘氨酸外，其他氨基酸a碳原子都有手性，具旋光異構(gòu)，存在D和L型 ，構(gòu)成天然蛋白質(zhì)的氨基酸均為L型蛋白質(zhì)氨基酸： 蛋白質(zhì)中常見的20種氨基酸稀有的蛋白質(zhì)氨基酸：蛋白質(zhì)組成中，除上述20種常見氨基酸外，從少數(shù)蛋白質(zhì)中還分離出一些稀有氨基酸，它們都是相應(yīng)常見氨基酸的衍生物。如4-羥脯氨酸、5-羥賴氨酸等。非蛋白質(zhì)氨基酸：生物體內(nèi)呈游離或結(jié)合態(tài)的氨基酸。生物體內(nèi)常見氨基酸的分類（二）氨基酸的結(jié)構(gòu)與分類二十種常見蛋白質(zhì)氨基酸的分類、結(jié)構(gòu)及三字符號據(jù)營養(yǎng)學(xué)分類 必需非必需據(jù)R基團化學(xué)結(jié)構(gòu)分類 脂肪族A （中性、含羥基或巰基、酸性、堿性）芳香族A(Phe、Tyr、Tr

7、p)雜環(huán)(His、Pro)據(jù)R基團極性分類極性R基團AA非極性R基團AA（種）不帶電荷（種）據(jù)氨基、羧基數(shù)分類一氨基一羧基一氨基二羧基(Glu、Asp)二氨基一羧基(Lys、His、Arg)人的必需氨基酸LysTrpPheValMetLeuIleThrArg、His帶電荷：正電荷（種）負電荷（種）1、按氨基酸分子中羧基與氨基的數(shù)目分： （1）酸性氨基酸：一氨基二羧基氨基酸，有：天冬氨酸、谷氨酸、（2）堿性氨基酸：二氨基一羧基氨基酸 ，有：賴氨酸、精氨酸、組氨酸（3）中性氨基酸：一氨基一羧基氨基酸，有：甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、脯氨酸

8、、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸。酸性氨基酸及酰胺天冬氨酸 （Asp,D）谷氨酸 （Glu,E）天冬酰胺 （Asn,N）谷氨酰胺 （Gln,Q）堿性氨基酸賴氨酸 （Lys,K）精氨酸 （Arg,R）組氨酸 （His,H）雜 環(huán)氨基酸2、按側(cè)基R基的結(jié)構(gòu)特點分： （1）脂肪族氨基酸（2）芳香族氨基酸：苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸（3）雜環(huán)氨基酸：脯氨酸、組氨酸雜環(huán)氨基酸組氨酸 （His,H）脯氨酸 （Pro,P）芳香族氨基酸苯丙氨酸 （Phe,F）酪氨酸 （Tyr,Y）色氨酸 （Trp,W）甘氨酸 （Gly,G）丙氨酸 （Ala,A）纈氨酸 （Val,V）亮氨酸 （Leu,L）異亮氨酸 （Ile

9、,I）中性脂肪族氨基酸含羥基或硫脂肪族氨基酸絲氨酸 （Ser,S）蘇氨酸 （Thr,T）半胱氨酸 （Cys,C）甲硫氨酸 （Met,M）3、按側(cè)基R基與水的關(guān)系分： （1）非極性氨基酸：有甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、脯氨酸。（2）極性不帶電氨基酸：天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸。（3）極性帶電氨基酸：天冬氨酸、谷氨酸、賴氨酸、精氨酸、組氨酸。4、按氨基酸是否能在人體內(nèi)合成分： （1）必需氨基酸：指人體內(nèi)不能合成的氨基酸，必須從食物中攝取，有八種：賴氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、蘇氨酸。（2）非必需氨基

10、酸：指人體內(nèi)可以合成的氨基酸。有十種。（3）半必需氨基酸：指人體內(nèi)可以合成但合成量不能滿足人體需要（特別是嬰幼兒時期）的氨基酸，有兩種：組氨酸、精氨酸。 二十種氨基酸的名稱和結(jié)構(gòu)如圖所示:注：二十種氨基酸的結(jié)構(gòu)特點支鏈氨基酸：纈氨酸、亮氨酸，異亮氨酸含羥基的氨基酸：絲氨酸、蘇氨酸含硫的氨基酸：半胱氨酸（含巰基）、 甲硫氨酸（含硫甲基）含苯環(huán)的氨基酸：苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸含胍基的氨基酸：精氨酸含咪唑基的氨基酸：組氨酸亞氨基酸：脯氨酸含酰胺的氨基酸：天冬酰胺、谷氨酰胺含吲哚基的氨基酸：色氨酸含-氨基的氨基酸：賴氨酸（三）蛋白質(zhì)中不常見的氨基酸羥-脯氨酸、羥-賴氨酸、r-羧基谷氨酸、6-氮-甲基

11、賴氨酸（四）非蛋白氨基酸 鳥氨酸、胍氨酸、高半胱氨酸、高絲氨酸、-丙氨酸、-氨基丁酸等三.氨基酸的理化性質(zhì)（一）物理性質(zhì)1.形態(tài)：均為白色結(jié)晶或粉末，不同氨基酸的晶型結(jié)構(gòu)不同。2.溶解性：一般都溶于水，不溶或微溶于醇，不溶于丙酮，在稀酸和稀堿中溶解性好。3.熔點：氨基酸的熔點一般都比較高，一般都大于200，超過熔點以上氨基酸分解產(chǎn)生胺和二氧化碳。 4.旋光性：除甘氨酸外的氨基酸均有旋光性。5.光吸收：氨基酸在可見光范圍內(nèi)無光吸收，在近紫外區(qū)含苯環(huán)氨基酸(PheThyTrp)有光的吸收。（二）化學(xué)性質(zhì)1.氨基酸的兩性電離及等電點： 氨基酸既含有氨基，可接受H+，又含有羧基，可電離出H+，所以氨基

12、酸具有酸堿兩性性質(zhì)。通常情況下，氨基酸以兩性離子的形式存在，如下圖所示： 從上圖可知：氨基酸在酸性環(huán)境中，主要以陽離子的形式存在，在堿性環(huán)境中，主要以陰離子的形式存在。在某一pH環(huán)境下，以兩性離子（兼性離子）的形式存在。該pH稱為該氨基酸的等電點。所以氨基酸的等電點可以定義為：氨基酸所帶正負電荷相等時的溶液pH。2.由-氨基參加的反應(yīng)： (1) 與亞硝酸反應(yīng)：放出氮氣，氮氣的一半來自氨基氮，一半來自亞硝酸，在通常情況下測定生成的氮氣的體積量可計算氨基酸的量，此反應(yīng)可用于測定蛋白質(zhì)的水解程度。（2）桑格反應(yīng)與2,4-二硝基氟苯(DNFB)的反應(yīng)NO2FO2N+ H2NCHCOOHRNO2O2NH

13、NCHCOOHR+ HF弱堿性DNP-氨基酸（黃色）（3）埃德曼反應(yīng)與異硫氰酸苯酯（PITC）的反應(yīng)N=C=S + NCHCOOHHHRPITCNCNCHCOOHHHRSPTC-氨基酸NCHRSNCCOPTH-氨基酸pH8.3無水HFEdman （苯異硫氰酸酯法）氨基酸順序分析法實際上也是一種N-端分析法。此法的特點是能夠不斷重復(fù)循環(huán)，將肽鏈N-端氨基酸殘基逐一進行標(biāo)記和解離。重復(fù)測定多肽鏈N端氨基酸排列順序，設(shè)計出“多肽順序自動分析儀” 3.-氨基與-羧基共同參加的反應(yīng)(1)與茚三酮的反應(yīng)：除脯氨酸與羥脯氨酸外，可與其它氨基酸生成藍紫色化合物。脯氨酸與羥脯氨酸為黃色化合物。 (2)成肽反應(yīng)：

14、3 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)具有多種結(jié)構(gòu)層次，包括一級結(jié)構(gòu)和空間結(jié)構(gòu)，空間結(jié)構(gòu)又稱為構(gòu)象。蛋白質(zhì)的構(gòu)象：指蛋白質(zhì)特有的空間結(jié)構(gòu)空間結(jié)構(gòu)包括二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)和四級結(jié)構(gòu)。在二級與三級之間還存在超二級結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)域這兩個結(jié)構(gòu)層次。一、蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu) 蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)（Primary structure）又稱為共價結(jié)構(gòu)或化學(xué)結(jié)構(gòu)。它是指蛋白質(zhì)中的氨基酸按照特定的排列順序通過肽鍵連接起來的多肽鏈結(jié)構(gòu)。 （一）肽鍵與肽鏈1.肽鍵：一個氨基酸的-COOH 和相鄰的另一個氨基酸的 -NH2脫水形成共價鍵。如下圖：肽鍵和肽的結(jié)構(gòu)2. 氨基酸借肽鍵連接起來叫肽，肽是一大類物質(zhì)，即： 1）兩個氨基酸組成的肽叫二肽

15、；2）三個氨基酸組成的肽叫三肽；3）多個氨基酸組成的肽叫多肽；4）氨基酸借肽鍵連成長鏈，稱為肽鏈，肽鏈兩端有 自由-NH2和-COOH，自由-NH2端稱為N-末端（氨基末端）， 自由-COOH端稱為C-末端（羧基末端）；5）構(gòu)成肽鏈的氨基酸已殘缺不全，稱為氨基酸殘基；6）肽鏈中的氨基酸的排列順序，一般-NH2端開始，由N指 向C，即多肽鏈有方向性，N端為頭，C端為尾。（二）天然活性肽自然界中有自由存在的活性肽，主要有：1. 谷胱甘肽（GSH）：三肽（Glu-Cys-Gly），廣泛存在于生物細胞中，含有自由的巰基，具有很強的還原性，可作為體內(nèi)重要的還原劑，保護某些蛋白質(zhì)或酶分子中的巰基免遭氧化，

16、使其處于活性狀態(tài)。 2.促甲狀腺素釋放激素：三肽（焦谷氨酰組氨酰脯氨酸），可促進甲狀腺素的釋放。 3.短桿菌素S：環(huán)十肽，含有D-苯丙氨酸、鳥氨酸，對革蘭氏陰性細菌有破壞作用，主要作用于細胞膜。 4.青霉素：含有D半胱氨酸和D纈氨酸的二肽衍生物 。主要破壞細菌的細胞壁粘肽的合成引起溶菌。 5.牛催產(chǎn)素與加壓素：均為九肽，分子中含有一對二硫鍵，兩者結(jié)構(gòu)類似。前者第九位為Gly或Lys或Phe，后者為Arg。前者可刺激子宮的收縮，促進分娩。后者可促進小動脈收縮，使血壓升高，也有抗利尿作用，參與水、鹽代謝的調(diào)節(jié)。 牛催產(chǎn)素 : S S CysTyrIleGlnAsnCysProLeuGly-NH2牛

17、加壓素 :7.腦啡肽：為五肽，具有鎮(zhèn)痛作用。 S S CysTyrPheGlnAsnCysProAryGly-NH26.舒緩激肽：促進血管舒張，促進水、鈉離子的排出。（三）蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)研究 一級結(jié)構(gòu)的研究包括：蛋白質(zhì)的氨基酸組成測定，肽鏈數(shù)目的確定，末端氨基酸種類測定，氨基酸的排列順序測定，二硫鍵位置的測定，酰胺位置的確定。大致步驟如下： 1.獲取一定量純的蛋白質(zhì)樣品，測其分子量，然后將樣品完全水解，確定該蛋白質(zhì)的氨基酸種類、數(shù)目及每種氨基酸的含量。2.進行末端測定，確定該蛋白質(zhì)的肽鏈數(shù)目，N-端和C-端是什么氨基酸。 N-末端測定法：常采用2，4二硝基氟苯法、Edman降解法、丹磺酰氯法

18、。 C-末端測定法：常采用羧肽酶法。3.肽鏈的拆分:經(jīng)末端的分析，若該蛋白質(zhì)含有兩條以上的肽鏈，而且肽鏈之間是通過非共價鍵連接，使用蛋白質(zhì)變性劑將其變性后分開；若蛋白質(zhì)肽鏈之間通過共價鍵相連，則可采取過甲酸氧化法或巰基乙醇還原法將其分開。4.各肽鏈中氨基酸排列順序的測定:使用兩種以上的方法將肽鏈部分水解成肽段，測各肽段的氨基酸順序，然后使用片段重疊法推測出完整肽鏈的氨基酸順序。5.確定二硫鍵和酰胺的位置 二、蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu) （一）構(gòu)型與構(gòu)象 構(gòu)型：指一個不對稱的化合物中不對稱中心上的幾個原子或基團的空間排布方式。如單糖的-、-構(gòu)型，氨基酸的D-、L-構(gòu)型。當(dāng)從一種構(gòu)型轉(zhuǎn)換成另一種構(gòu)型的時候，

19、會牽涉及共價鍵的形成或破壞。 構(gòu)象：指一個分子結(jié)構(gòu)中的一切原子繞共價單鍵旋轉(zhuǎn)時產(chǎn)生的不同空間排列方式。一種構(gòu)象變成另一種構(gòu)象不涉及共價鍵的形成或破壞。維持蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的作用力主要是氫鍵。蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)是指多肽鏈的主鏈骨架沿一維方向所形成的規(guī)則的周期性結(jié)構(gòu)，如-螺旋結(jié)構(gòu)、-折疊結(jié)構(gòu)等。(1) -螺旋結(jié)構(gòu)（-Helix ）(2) -折疊結(jié)構(gòu)（-sheet ）(3) -轉(zhuǎn)角（ - turn ）(4) 無規(guī)卷曲 (random coil)多肽鏈的二級結(jié)構(gòu)主要有以下幾種方式 螺旋有左右手之分（1）-螺旋結(jié)構(gòu)特點 1) 主鏈繞中心軸按右手螺旋方向盤旋，側(cè)鏈伸向螺旋外側(cè)。每3.6 個氨基酸殘基前進一圈，

20、每圈前進距離是0.54nm(螺距），每個氨基酸殘基占0.15nm。 2) 每個氨基酸殘基的亞氨基與它前面第四個氨基酸殘基的羰基氧原子形成氫鍵，氫鍵與螺旋軸近似平行。 -螺旋在許多蛋白中存在，如-角蛋白、血紅蛋白、肌紅蛋白等，主要由-螺旋結(jié)構(gòu)組成。 螺旋的結(jié)構(gòu)通常用“SN”來表示，S表示螺旋每旋轉(zhuǎn)一圈所含的殘基數(shù)，N表示形成氫鍵的C=O與H-N原子之間在主鏈上包含的原子數(shù)。 （2）、-折疊結(jié)構(gòu)(-片層結(jié)構(gòu)) -折疊(-pleated sheets)又稱-片層、-結(jié)構(gòu)，其結(jié)構(gòu)要點如下：多肽鏈呈鋸齒狀（或扇面狀）排列成比較伸展的結(jié)構(gòu)；相鄰兩個氨基酸殘基的軸心距離為0.35nm，側(cè)鏈R基團交替地分布在

21、片層平面的上下方，片層間有氫鍵相連；有平行式和反平行式兩種，平行式的折疊其=-119。，=+113。反平行折疊其=-139。，=+135。 這種片層在絲心蛋白里大量存在。（3）、-轉(zhuǎn)角蛋白質(zhì)分子的主鏈在盤曲折疊運行中，往往發(fā)生180度的急轉(zhuǎn)彎，這種回折部位的構(gòu)象，即所謂的-轉(zhuǎn)角。 -轉(zhuǎn)角是由4個連續(xù)的氨基酸殘基組成的，第一個氨基酸殘基的羰基氧原子與第四個氨基酸殘基的亞氨基連接來穩(wěn)定構(gòu)象。螺旋折疊片轉(zhuǎn)角無規(guī)卷曲（4）、無規(guī)卷曲它是多肽主鏈不規(guī)則、多向性隨機盤曲所形成的構(gòu)象。球蛋白分子中常見的一種主鏈構(gòu)象。(1)、球狀蛋白質(zhì)分子的三級結(jié)構(gòu) 球狀蛋白質(zhì)分子的二級結(jié)構(gòu)不是活性分子的結(jié)構(gòu)形式，需要在二級

22、結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上再盤曲折疊形成三級結(jié)構(gòu)。 蛋白質(zhì)分子的三級結(jié)構(gòu)是指蛋白質(zhì)分子在一、二級結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，借助于各種非共價鍵在三維空間盤曲、折疊成具有特定走向的緊密、近似球狀的構(gòu)象。 蛋白質(zhì)分子的三級結(jié)構(gòu)包括全部主鏈、側(cè)鏈在內(nèi)的所有原子的空間排部，但不包括肽鏈間的相互關(guān)系 球狀構(gòu)象給出最低的表面積和體積比，因而使蛋白質(zhì)與環(huán)境的相互作用降到最小，最穩(wěn)定。三、蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)3. 蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu) 一條多肽鏈內(nèi)二級結(jié)構(gòu)單元的彼此組合后的固定結(jié)構(gòu) 作用力來自側(cè)鏈基團 球狀蛋白質(zhì)分子三級結(jié)構(gòu)的構(gòu)象特征 (1)三級結(jié)構(gòu)的構(gòu)象近似球形。 (2)分子中的親水基團大多相對集中在球形分子的表面，疏水基團相對集中在分子內(nèi)部

23、。 (3)三級結(jié)構(gòu)構(gòu)象的穩(wěn)定性主要靠疏水的相互作用來維系。 (4)三級結(jié)構(gòu)形成后，蛋白質(zhì)分子的生物活性中心就形成了。在球形分子的表面往往有一個很深的裂隙，活性部位就在其中。三級結(jié)構(gòu)的典型例子是肌紅蛋白肌紅蛋白的三級結(jié)構(gòu)維系蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的化學(xué)鍵氫鍵(hydrogen bond)離子鍵(鹽鍵)(electrostatic interactions)疏水相互作用(hydrophobic interaction)范德華力(van der waals force)二硫鍵(disulfide bond)A.三級結(jié)構(gòu)中的作用力包括二硫鍵、氫鍵、離子鍵、疏水作用力、范德華力氫鍵(側(cè)鏈間形成)疏水作用“非極性

24、基團被極性水分子排擠相互聚攏”作用力。范德華力（分子間作用力，受彼此距離影響）離子鍵（或鹽鍵）二硫鍵肽鍵 二硫鍵離子鍵 氫鍵疏水鍵 范德華力 90kcal/mol3kcal/mol1kcal/mol1kcal/mol0.1kcal/mol 這四種鍵能遠小于共價鍵，稱次級鍵 次級鍵微弱但卻是維持蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)中主要的作用力,原因何在?數(shù)量巨大！鍵 能（2）、纖維蛋白分子的結(jié)構(gòu)在纖維蛋白分子中螺旋肽鏈一般為平行排列含大量的-螺旋，-折疊片，整個分子呈纖維狀角蛋白、絲心蛋白、膠原蛋白的結(jié)構(gòu)都是如此。廣泛分布于脊椎和無脊椎動物體內(nèi)，起支架和保護作用。三條右手-螺旋 一個原纖維 大原纖維 纖維角蛋白四、

25、球狀蛋白質(zhì)分子的四級結(jié)構(gòu) 有些球狀蛋白質(zhì)分子是由兩個或兩個以上的、具有獨立三級結(jié)構(gòu)的肽鏈單位締合而成的，這種蛋白質(zhì)通常稱為寡聚蛋白或多體蛋白（multimeric protein）。 寡聚蛋白分子中的每一個三級結(jié)構(gòu)單位稱為一個亞基(或亞單位subunit、單體monomer)。 所謂蛋白質(zhì)分子的四級結(jié)構(gòu)是指就是指寡聚蛋白分子中亞基與亞基之間的立體排布及相互作用關(guān)系。 亞基的數(shù)目和類型也是四級結(jié)構(gòu)研究的內(nèi)容。 四級結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定靠非共價鍵聯(lián)系：主要包括疏水作用（主要），其次還有離子鍵、氫鍵、范德華力來維系。血紅蛋白的四級結(jié)構(gòu)五、超二級結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)域1超二級結(jié)構(gòu) 超二級結(jié)構(gòu)（Super-secondar

26、y structure）的概念是M.Rossmann于1973年提出來的。蛋白質(zhì)分子中的多肽鏈在三維折疊中往往形成有規(guī)則的二級結(jié)構(gòu)聚集體，在球蛋白中充當(dāng)三級結(jié)構(gòu)的構(gòu)件。常見的有：、等。 2結(jié)構(gòu)域（structural domain） 在一些相對較大的蛋白質(zhì)分子中，在空間折疊時往往先分別折疊成幾個相對獨立的區(qū)域，再組裝成更復(fù)雜的球狀結(jié)構(gòu)，這種在二級或超二級結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上形成的特定區(qū)域（三級結(jié)構(gòu)的局部折疊區(qū)稱為）結(jié)構(gòu)域。它的結(jié)構(gòu)層次介于超二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)之間。如圖所示： （一）、多肽的一級結(jié)構(gòu)與功能生物體中存在多種活性肽，如：生長激素、加壓素、催產(chǎn)素等。4 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系一、蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)與

27、功能的關(guān)系 一級結(jié)構(gòu)是空間構(gòu)象的基礎(chǔ) 1、核糖核酸酶的可逆變性RNase是由124氨基酸殘基組成的單肽鏈，分子中 8 個Cys的-SH構(gòu)成4對二硫鍵，形成具有一定空間構(gòu)象的蛋白質(zhì)分子。在蛋白質(zhì)變性劑（如8mol/L的尿素）和一些還原劑（如巰基乙醇）存在下，酶分子中的二硫鍵全部被還原，酶的空間結(jié)構(gòu)破壞，肽鏈完全伸展，酶的催化活性完全喪失。當(dāng)用透析的方法除去變性劑和巰基乙醇后，發(fā)現(xiàn)酶大部分活性恢復(fù)，所有的二硫鍵準確無誤地恢復(fù)原來狀態(tài)。若用其他的方法改變分子中二硫鍵的配對方式，酶完全喪失活性。這個實驗表明，蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)決定它的空間結(jié)構(gòu)，而特定的空間結(jié)構(gòu)是蛋白質(zhì)具有生物活性的保證。如下圖：（二）、

28、蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)決定高級結(jié)構(gòu)牛核糖核酸酶的一級結(jié)構(gòu)二硫鍵 天然狀態(tài)，有催化活性尿素、-巰基乙醇 去除尿素、-巰基乙醇非折疊狀態(tài)，無活性2、蛋白質(zhì)前體的激活無活性的前提稱為“原”，如酶原、胰島素原 由108個氨基酸殘基構(gòu)成的前胰島素原(pre-proinsulin），在合成的時候完全沒有活性，當(dāng)切去N-端的24個氨基酸信號肽，形成84個氨基酸的胰島素原（proinsulin），胰島素原也沒活性，在包裝分泌時，A、B鏈之間的33個氨基酸殘基被切除，才形成具有活性的胰島素。如圖所示:胰島素：AB兩條鏈構(gòu)成，A鏈含21個氨基酸殘基，B鏈含 30 個氨基酸殘基，鏈間有兩對二硫鍵，A鏈上有一對二硫鍵。（切

29、除冗余及其它變化）前體蛋白（一級結(jié)構(gòu)冗余，高級結(jié)構(gòu)錯誤，因此無生物活性）活性蛋白（具有正確的一級結(jié)構(gòu)和高級結(jié)構(gòu)，因此具有生物活性）適合環(huán)境 現(xiàn)知幾乎所有遺傳病都與蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)改變有關(guān)，都稱之為分子病。例如鐮刀型貧血癥，它是由于血紅蛋白的-亞基上的第六位氨基酸由谷氨酸變成了纈氨酸，導(dǎo)致血紅蛋白的結(jié)構(gòu)和功能的改變，其運輸氧氣的能力大大地降低，并且紅細胞呈鐮刀狀。 3、分子病鐮刀狀貧血病：血液中大量出現(xiàn)鐮刀紅細胞，患者因此缺氧窒息正常細胞 鐮刀形細胞它是最早認識的一種分子病。它是由于遺傳基因突變導(dǎo)致血紅蛋白分子結(jié)構(gòu)的突變。這種由蛋白質(zhì)分子發(fā)生變異所導(dǎo)致的疾病，稱為“分子病”正常型 -Val-His

30、-Leu-Thr-Pro-Glu-Lys - 鏈 谷氨酸鐮刀型 -Val-His-Leu-Thr-Pro-Val-Lys - 鏈 纈氨酸 谷Aa（極性） 纈Aa（非極性）由于纈氨酸上的非極性基團與相鄰非極性基團間在疏水力作用下相互靠攏，并引發(fā)所在鏈扭曲為束狀，整個蛋白質(zhì)由球狀變?yōu)殓牭缎?，與氧結(jié)合功能喪失，導(dǎo)致病人窒息甚至死亡。 所以，蛋白質(zhì)一定的結(jié)構(gòu)執(zhí)行一定的功能。功能不同的蛋白質(zhì)總是有著不同的序列；比較種屬來源不同而功能相同的蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)，可能有某些差異，但與功能相關(guān)的結(jié)構(gòu)也總是相同。若一級結(jié)構(gòu)變化，蛋白質(zhì)的功能可能發(fā)生很大的變化。 同源蛋白質(zhì)有順序同源性： 比較不同來源的細胞色素C發(fā)現(xiàn)

31、，與功能密切相關(guān)的氨基酸殘基是高度保守的，這說明不同種屬具有同一功能的蛋白質(zhì)，在進化上來自相同的祖先，但存在種屬差異。不同種屬間的同源蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)上相對應(yīng)的氨基酸差別越大，其親緣關(guān)系愈遠，反之，其親緣關(guān)系愈近。二、蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系1、血紅蛋白的變構(gòu)效應(yīng)與運輸氧的功能(R)relaxed state(T) tense state 血中氧分子的運送：Lung氧分子HemoglobinMyoglobinMuscle靜脈動脈環(huán)境氧高時Hb 快速吸收氧分子環(huán)境氧低時Hb 迅速釋放氧分子釋放氧分子后Hb 變回 T state任何一個亞基接受氧分子后，會增進其它亞基吸附氧分子的能力 Hb由4條肽

32、鏈組成：2、2，功能是運載O2 。在去氧Hb亞基中有下列幾對離子鍵： 由于血紅蛋白亞基之間存在大量離子鍵，使其構(gòu)象呈緊張態(tài)，對氧的親和力很低，第一個亞基與O2結(jié)合時，離子鍵的破壞較難，所需要的能量較多。當(dāng)血紅蛋白的一個亞基結(jié)合氧之后引起它的構(gòu)象從緊張態(tài)變成松弛態(tài)，其它的離子鍵也依次破壞，此時破壞離子鍵所需要的能量也少，構(gòu)象的變化導(dǎo)致血紅蛋白對氧的親和力大大增強，因此第四個亞基結(jié)合氧的能力比第一個大幾百倍。 上述Hb與O2結(jié)合后，Hb的構(gòu)象發(fā)生變化，這類變化稱為變構(gòu)效應(yīng)，即通過構(gòu)象變化影響蛋白質(zhì)的功能。像血紅蛋白這種具有變構(gòu)效應(yīng)的蛋白質(zhì)稱為變構(gòu)蛋白（allosteric protein）。血紅蛋

33、白的這種變構(gòu)效應(yīng)能更有效地行使其運氧的生物學(xué)功能。2、蛋白質(zhì)變性一些物理或化學(xué)因素會破壞蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)生物活性喪失，同時引起某些物理性質(zhì)和化學(xué)性質(zhì)的變化，如溶解度降低、發(fā)生沉淀等現(xiàn)象稱為蛋白質(zhì)變性。天然蛋白質(zhì)和變性蛋白在一級結(jié)構(gòu)上相同，生物活性喪失。變性蛋白質(zhì)分子恢復(fù)其天然構(gòu)象，稱為復(fù)性。變性因素：加熱/加壓/射線/強酸/強堿/有機溶劑等 總之，各種蛋白質(zhì)都有特定的空間構(gòu)象，而特定的空間構(gòu)象又與它們特定的生物學(xué)功能相適應(yīng)，蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能是高度統(tǒng)一的。5、蛋白質(zhì)的性質(zhì)一、蛋白質(zhì)分子的大小和形狀1、高分子特性：2、形狀：纖維狀蛋白、球狀蛋白纖維蛋白：多結(jié)構(gòu)蛋白，難溶于水，構(gòu)成支架，

34、如膠原蛋白。球狀蛋白：多溶于水，酶/轉(zhuǎn)運蛋白/激素/免疫球蛋白等二、蛋白質(zhì)的兩性電離和等電點 蛋白質(zhì)與氨基酸相似，也具有兩性電離的性質(zhì)。蛋白質(zhì)的多肽鏈含有末端氨基和羧基，一些側(cè)鏈上含有可解離的基團，有的可以接受氫離子，有的可以電離出氫離子，因此蛋白質(zhì)具有酸堿兩性電離的性質(zhì)。它的兩性電離比氨基酸復(fù)雜。 對某一蛋白質(zhì)而言，在某一pH下，當(dāng)它所帶正負電荷相等的時候，該溶液的pH就稱為該蛋白質(zhì)的等電點。 蛋白質(zhì)的等電點的大小與蛋白質(zhì)的氨基酸組成有關(guān)。 蛋白質(zhì)中可解離酸性基團 Glu的-COOH Asp的-COOH Tyr的酚羥基 Cys的-SH堿性基團 Lys的-NH2 His的咪唑基 Arg的-胍基

35、蛋白質(zhì)分子的總解離蛋白質(zhì)的等電點 蛋白質(zhì)溶液在特定的pH下，其分子所帶的正、負電荷相等，凈電荷為零，這一pH稱為 (用PI表示)。蛋白質(zhì)純化方法等電點沉淀法蛋白質(zhì)電泳離子交換法蛋白質(zhì)兩性解離與等電點特性的應(yīng)用靜電排斥力的缺乏蛋白質(zhì)之間的聚集等電點沉淀幾種常見電泳等電聚焦紙電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳OFarrell的雙向電泳銀染結(jié)果考馬斯亮染色為藍色 蛋白質(zhì)溶液有許多高分子溶液的性質(zhì)，如：擴散慢、易沉降、 粘度大、不能透過半透膜，在水溶液中可形成親水的膠體。蛋白質(zhì)水溶液為親水膠體。不能通過半透膜；分子周圍有雙電子層和水化層，有利于穩(wěn)定pr膠體系統(tǒng)。超濾透析三、膠體性質(zhì)蛋白質(zhì)

36、的膜分離技術(shù)透析四、沉淀反應(yīng)機理：1）利用pr兩性電離性質(zhì)。 2）許多化學(xué)試劑可減少pr與水的親和力 鹽析、醇、酸、重金屬離子、生物堿等1、概念蛋白質(zhì)膠體溶液的穩(wěn)定性是有條件的、相對的，若改變環(huán)境條件，破壞其水化膜和表面電荷，蛋白質(zhì)親水膠體便失去穩(wěn)定性，發(fā)生絮凝沉淀的現(xiàn)象，就稱為蛋白質(zhì)的沉淀作用。2、沉淀的方法(1) 等電點沉淀法(2) 鹽溶與鹽析（分級鹽析）鹽溶在鹽濃度很低時，蛋白質(zhì)的溶解度隨著鹽濃度的增加而增加，這種現(xiàn)象稱為蛋白質(zhì)的鹽溶。 鹽析在蛋白質(zhì)溶液中加入高濃度的中性鹽后，它與蛋白質(zhì)膠體粒子競爭水份，使蛋白質(zhì)膠體粒子表面的水化層破壞而失去穩(wěn)定性，同時降低了蛋白質(zhì)與水的親和力而使蛋白質(zhì)

37、沉淀的現(xiàn)象。 不同的蛋白質(zhì)的帶電性質(zhì)、分子量不同，水膜厚度不同，故鹽析所需的鹽濃度也不同。等電點沉淀的蛋白質(zhì)溶液中加入NaCl后沉淀溶解鹽溶（Salting-in）鹽溶蛋白質(zhì)分子在等電點時，容易互相吸引，聚合沉淀；加入鹽離子會破壞這些靜電相互作用，使分子散開而溶于水鹽析向蛋白質(zhì)溶液中加入大量硫酸銨后蛋白質(zhì)會沉淀析出鹽析（Salting out）蛋白質(zhì)分子表面的疏水區(qū)域，聚集了許多水分子，鹽濃度高時，這些水分子被鹽抽出（水化層被破壞），暴露出的疏水區(qū)域，它們發(fā)生相互作用而沉淀。（NH4）2SO4一般來講，分子量越大的蛋白質(zhì)分子，越容易鹽析，所需鹽濃度也越低。因此，對于不同分子大小的蛋白質(zhì)，可采用

38、不同的鹽濃度進分級沉淀。常用的鹽是(NH4)2SO4 強電解質(zhì)鹽如硫酸胺、氯化鈉、硫酸鈉等。 鹽析的機理：破壞蛋白質(zhì)的水化膜，中和表面的凈電荷。 鹽析法是最常用的蛋白質(zhì)沉淀方法，該方法不會使蛋白質(zhì)產(chǎn)生變性。(3) 有機溶劑沉淀法在蛋白質(zhì)溶液中，加入能與水互溶的有機溶劑如乙醇、丙酮等，蛋白質(zhì)產(chǎn)生沉淀。有機溶劑沉淀法的機理：破壞蛋白質(zhì)的水化膜。有機溶液沉淀蛋白質(zhì)通常在低溫條件下進行，否則有機溶劑與水互溶產(chǎn)生的溶解熱會使蛋白質(zhì)產(chǎn)生變性。(4) 重金屬鹽沉淀法 （條件：pH 稍大于pI為宜）蛋白質(zhì)在堿性溶液中帶負電，可與重金屬離子如Zn+2、Cu+2、Hg+2、Pb+2、Fe+3等作用，產(chǎn)生重金屬蛋白

39、鹽沉淀。重金屬沉淀蛋白質(zhì)會使蛋白質(zhì)產(chǎn)生變性，長期從事重金屬作業(yè)的人應(yīng)多吃高蛋白食品，以防止重金屬離子被機體吸收后造成對機體的損害。(5) 熱變性沉淀法 加熱滅菌生物堿試劑沉淀法（條件：pH稍小于pI）生物堿是植物組織中具有顯著生理作用的一類含氮的堿性物質(zhì)。能夠沉淀生物堿的試劑稱為生物堿試劑。生物堿試劑一般為弱酸性物質(zhì)，如單寧酸、苦味酸、三氯乙酸等。生物堿試劑沉淀蛋白質(zhì)的機理：在酸性條件下，蛋白質(zhì)帶正電，可以與生物堿試劑的酸根離子結(jié)合而產(chǎn)生沉淀。 “柿石癥”的產(chǎn)生就是由于空腹吃了大量的柿子，柿子中含有大量的單寧酸，使腸胃中的蛋白質(zhì)凝固變性而成為不能被消化的“柿石”。(6) 生物堿試劑沉淀法五、蛋

40、白質(zhì)的變性作用1.蛋白質(zhì)變性的概念：天然蛋白質(zhì)受物理或化學(xué)因素的影響后，使其失去原有的生物活性，并伴隨著物理化學(xué)性質(zhì)的改變，這種作用稱為蛋白質(zhì)的變性。2.使蛋白質(zhì)變性的因素1）物理因素：高溫、高壓、射線等 2）化學(xué)因素：強酸、強堿、重金屬鹽等3.變性的本質(zhì)： 分子中各種次級鍵斷裂，使其空間構(gòu)象從緊密有序的 狀態(tài)變成松散無序的狀態(tài)，一級結(jié)構(gòu)不破壞。4.蛋白質(zhì)變性后的表現(xiàn)：1）生物學(xué)活性消失2）理化性質(zhì)改變：溶解度下降，粘度增加，紫外吸收增 加，側(cè)鏈反應(yīng)增強，對酶的作用敏感，易被水解。 六、蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng) 蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng)主要與其定性、定量測定有關(guān)： 1.茚三酮反應(yīng)：多肽與蛋白質(zhì)都能與之反應(yīng)生成

41、藍色化合物。2.雙縮脲反應(yīng)：多肽與蛋白質(zhì)都能和雙縮脲試劑反應(yīng)，隨著肽 鍵的數(shù)目越多，顏色依次為粉紅、紫紅、紫、藍。3.酚試劑反應(yīng)：多肽、蛋白質(zhì)與酚試劑生成藍色的化合物。堿性條件下，蛋白質(zhì)中的酪氨酸、色氨酸可與酚試劑(含磷鉬酸、磷鎢酸的化合物)反應(yīng)生成藍色化合物，藍色的強度和蛋白質(zhì)的量成正比。 可用于測定蛋白質(zhì)含量。但有缺陷七、蛋白質(zhì)的紫外吸收性質(zhì)一般蛋白質(zhì)在280nm波長具有最大吸收，這是由于蛋白質(zhì)分子中的Trp、Tyr和Phe存在共軛雙鍵的緣故。 蛋白質(zhì)溶液能在近紫外區(qū)（280nm處）有光吸收，主要是由帶芳香環(huán)的氨基酸決定的。6 蛋白質(zhì)的分離、純化一、分離純化蛋白質(zhì)的意義 研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能：要求純度高，不變性； 提取活性的酶或蛋白質(zhì)：必須保持天然活性狀態(tài)； 作為藥物或食品添加劑：純度要