生物化學(xué)·DNA的復(fù)制和修復(fù)課件

1、第十四章 DNA的復(fù)制和修復(fù) 本章重點介紹遺傳中心法則和DNA的半保留復(fù)制以及逆轉(zhuǎn)錄的過程和機理，對DNA的損傷和修復(fù)、突變和重組作一般介紹。思考 DNA是絕大多數(shù)生物體遺傳信息的載體，繼1953年Watson & Crick提出DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型后，1958年，Crick提出了“中心法則”(Central dogma)揭示了遺傳信息的傳遞規(guī)律。遺傳信息傳遞的中心法則蛋白質(zhì)翻譯轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄復(fù)制復(fù)制DNARNA生物的遺傳信息以密碼的形式儲存在DNA分子上，表現(xiàn)為特定的核苷酸排列順序。在細(xì)胞分裂的過程中，通過DNA復(fù)制把親代細(xì)胞所含的遺傳信息忠實地傳遞給兩個子代細(xì)胞。在子代細(xì)胞的生長發(fā)育過程中，這

2、些遺傳信息通過轉(zhuǎn)錄傳遞給RNA，再由RNA通過翻譯轉(zhuǎn)變成相應(yīng)的蛋白質(zhì)多肽鏈上的氨基酸排列順序，由蛋白質(zhì)執(zhí)行各種各樣的生物學(xué)功能，使后代表現(xiàn)出與親代相似的遺傳特征。后來人們又發(fā)現(xiàn)，在宿主細(xì)胞中一些RNA病毒能以自己的RNA為模板復(fù)制出新的病毒RNA；還有一些RNA病毒能以其RNA為模板合成DNA，稱為逆轉(zhuǎn)錄,這是中心法則的補充 中心法則總結(jié)了生物體內(nèi)遺傳信息的流動規(guī)律，揭示遺傳的分子基礎(chǔ)，不僅使人們對細(xì)胞的生長、發(fā)育、遺傳、變異等生命現(xiàn)象有了更深刻的認(rèn)識，而且以這方面的理論和技術(shù)為基礎(chǔ)發(fā)展了基因工程，給人類的生產(chǎn)和生活帶來了深刻的革命。概念復(fù)制(replication)： 以親代DNA分子為模板

3、合成出子代DNA分子的過程。轉(zhuǎn)錄(transcription)： 以DNA分子為模板合成出與其相對應(yīng)的RNA的過程。翻譯(translation)： 在RNA的控制下，根據(jù)核酸鏈上的三聯(lián)體密碼合成出具有特定氨基酸序列的蛋白質(zhì)多肽鏈的過程。反轉(zhuǎn)錄(reverse transcription)： 以RNA為模板將遺傳信息傳給DNA的過程。目 錄第一節(jié) DNA的復(fù)制（DNA指導(dǎo)下的DNA合成）第二節(jié) DNA的損傷與修復(fù)第三節(jié) DNA突變 第一節(jié) DNA的半保留復(fù)制一、概念和實驗依據(jù)二、DNA復(fù)制的起始點和方式三、 DNA聚合反應(yīng)有關(guān)的酶類四、DNA的半不連續(xù)復(fù)制五、原核細(xì)胞DNA復(fù)制過程六、DNA復(fù)

4、制的忠實性七、真核細(xì)胞DNA的復(fù)制八、真核和原核DNA細(xì)胞復(fù)制比較 DNA半保留復(fù)制 （semi-conservative replication） 半保留復(fù)制假說的提出： 1953年，Watson & Crick在DNA雙螺旋基礎(chǔ)上提出。DNA半保留復(fù)制概念 DNA在復(fù)制時，兩條鏈解開分別作為模板，在DNA聚合酶的催化下按堿基互補的原則合成兩條與模板鏈互補的新鏈，以組成新的DNA分子。這樣新形成的兩個DNA分子與親代DNA分子的堿基順序完全一樣。由于子代DNA分子中一條鏈來自親代，另一條鏈?zhǔn)切潞铣傻模@種復(fù)制方式稱為半保留復(fù)制。DNA的半保留復(fù)制實驗依據(jù) 1958年Meselson & st

5、ahl用同位素示蹤標(biāo)記和密度梯度離心技術(shù)實驗,證明了DNA是采取半保留的方式進行復(fù)制: 將E.Coli培養(yǎng)在以15NH4Cl為唯一氮源的培養(yǎng)基中生長；提取其DNA；進行氯化銫密度梯度離心。再移至14N培養(yǎng)基中生長、提取DNA、離心分析。復(fù)制中的大腸桿菌染色體放射自顯影圖(Caims實驗)P407先看課本 用3H-胸苷標(biāo)記大腸桿菌DNA，經(jīng)過近兩代的時間，3H-胸苷摻入大腸桿菌DNA。用溶菌酶把細(xì)胞壁消化掉，使完整的大腸桿菌染色體DNA釋放出來，放射自顯影，得到上圖。非復(fù)制部分（C）銀粒子密度較低，由一股放射性鏈和一股非放射性鏈構(gòu)成。已復(fù)制部分站整個染色體的三分之二，其中一條雙鏈（B）僅有一股鏈

6、是標(biāo)記的，另外一股雙鏈（A）的兩股鏈都是標(biāo)記的，銀粒子密度為前二者的兩倍。ABC環(huán)狀DNA的復(fù)制ABC二、DNA復(fù)制的起點和方式 基因組能獨立進行復(fù)制的單位稱為復(fù)制子(replicion)，每個復(fù)制子都含有控制復(fù)制起始的起點(origin)和終止復(fù)制的終點(terminus)，復(fù)制一旦開始，即繼續(xù)下去，直到復(fù)制結(jié)束。 1、復(fù)制起點：原核生物：1個起點; 單復(fù)制子；可連續(xù)發(fā)動復(fù)制 真核生物：多起點；多復(fù)制子 2、方向：多為雙向(實驗) 3、復(fù)制叉：細(xì)菌為環(huán)狀DNA,復(fù)制起始于單個位點， 雙向，半保留，每個復(fù)制泡（眼）包括2 個復(fù)制叉。 4、DNA復(fù)制方式 5、完成一次復(fù)制的時間DNA的雙向和單向

7、復(fù)制環(huán)狀 DNA復(fù)制時所形成的結(jié)構(gòu)起始點復(fù)制叉的推進復(fù)制叉起始點起始點起始點復(fù)制叉復(fù)制叉未復(fù)制DNA單向復(fù)制雙向復(fù)制實驗先用低放射性的3H標(biāo)記的dT培養(yǎng)E.coli，經(jīng)數(shù)分鐘后轉(zhuǎn)移到 含高放射性3H標(biāo)記的dT培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)，得到含3H的DNA；放射自顯影。推測：若放射性中間低，兩端高雙向； 若放射性一端高，一端低單向；實驗證明：生物染色體DNA是雙向復(fù)制，并且是對稱的。例外：枯草桿菌、質(zhì)粒R6K、質(zhì)粒Col E。（線粒體DNA的復(fù)制方式）（某些噬菌體DNA復(fù)制方式）完成一次復(fù)制的時間：細(xì)菌DNA復(fù)制叉移動速度：50 000bp/min真核生物10003000bp/min例：某細(xì)菌的染色體是

8、環(huán)狀的雙鏈DNA分子，有5.2106個堿基對三、原核生物DNA聚合反應(yīng)有關(guān)的酶類（一）DNA聚合酶(DNA polymetases)（二）引物酶(peimase)：啟動RNA引物鏈的合成。 (三） DNA連接酶（DNA ligase）p419（四）DNA的兩條鏈解開后才能作為模板，解開其雙螺旋的結(jié)構(gòu)是一些酶和蛋白共同作用的結(jié)果，目前已知的解旋、解鏈酶共3種，包括拓?fù)洚悩?gòu)酶(topoisomerase)、DNA解鏈酶(DNA helicase)、DNA單鏈結(jié)合蛋白(single-strand binding protein, SSB)。解旋酶DNA聚合酶III解鏈酶RNA引物引物酶和引發(fā)體DNA

9、聚合酶ISSB335355RNA引物DNA聚合反應(yīng)和聚合酶1、DNA聚合酶反應(yīng)特點：以四種dNTP為底物需要模板指導(dǎo)需要有引物3-羥基存在 DNA鏈的生長方向是53產(chǎn)物DNA的性質(zhì)與模板相同2、大腸桿菌的DNA聚合酶3、3種DNA聚合酶的比較需要4種脫氧核糖核苷三磷酸需要模板作為指導(dǎo)合成方向大腸桿菌的DNA聚合酶 (DNApolymerase, DNApol)催化形成新的磷酸二酯鍵；有外切酶活性。含有5種不同的DNA聚合酶1、E.coli DNA聚合酶需要原料：4種dNTP；DNA模板；與模板互補的一段RNA引物；Mg2+；Zn2+ （酶活性部位）；DNA聚合酶功能 DNA聚合酶I主要起損傷修

10、復(fù)作用。每秒可聚合10個左右的堿基。催化dNTP加到DNA鏈的3-OH末端（方向53） 5 3外切酶活性，可切除引物；3 5外切酶活性，可糾錯；DNA聚合酶5-3外切酶活力5- 3核酸外切酶水解位點單鏈缺口5DNA聚合酶的3- 5外切酶水解位點3355錯配堿基3- 5核酸外切酶水解位點2、 DNA聚合酶活力比聚合酶高；反應(yīng)需Mg2+、NH4+；以帶缺口的ds DNA為模板，反應(yīng)同酶；具35外切酶活性；但無53外切酶活力;是一種修復(fù)酶而非復(fù)制酶。3、DNA聚合酶 由多個亞基組成的蛋白質(zhì)，是大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)真正負(fù)責(zé)DNA鏈延伸的復(fù)制酶；具3 5外切酶活性；活性高大腸桿菌DNA聚合酶全酶的結(jié)構(gòu)和功能1

11、0種亞基DNA聚合酶 兩個亞基夾住DNADNA聚合酶異二聚體核心酶幫助亞基校對促使核心酶二聚化聚合活性組建核心酶引物的結(jié)合和識別，形成夾子大腸桿菌三種DNA聚合酶比較DNA聚合酶分子量每個細(xì)胞的分子統(tǒng)計數(shù)5-3 聚合酶作用3-5 核酸外切酶作用5-3 核酸外切酶作用聚合能力DNA聚合酶109,000400+（糾錯）+（切引物）弱120,000100+-一般400,00010-20+-強比較項目DNA聚合酶切除引物損傷修復(fù)修復(fù)酶非復(fù)制酶復(fù)制功能 1999年發(fā)現(xiàn)聚合酶和，它們涉及DNA的錯誤傾向修復(fù)（errooune repair） *DNApol主要負(fù)責(zé)DNA鏈延伸。DNA連接酶(ligase)

12、：作用：催化相鄰的二個DNA片段間5磷酸基團和3羥基生成磷酸二酯鍵而連接。條件：兩片段相鄰；兩片段需與同一互補鏈結(jié)合;反應(yīng)耗能。拓?fù)洚悩?gòu)酶（topoisomerase）兼具內(nèi)切酶和連接酶活力，能迅速將DNA超螺旋或雙螺旋緊張狀態(tài)變成松馳狀態(tài)，便于解鏈。，增加DNA連環(huán)數(shù)，消除負(fù)超螺旋DNA解鏈酶(DNA helicase)：又稱Dna B斷裂DNA的互補堿基間的氫鍵，使雙鏈分離使復(fù)制叉前方DNA雙螺旋解開一小段，復(fù)制 過程中該酶隨復(fù)制叉的伸展而前移。每解1個bp需耗2個ATP。大腸桿菌在解鏈時還需要另外兩種酶： Dna A辨認(rèn)起始點 Dna C協(xié)助Dna B結(jié)合在起始點并打開雙鏈DNA單鏈結(jié)合

13、蛋白(Single Strand Bindingprotein, SSB) ：幾分子的SSB與已分開的DNA單鏈緊密結(jié)合，以防兩鏈重新結(jié)合成雙螺旋。還可以防止單鏈模板被核酸酶水解。四、雙鏈DNA復(fù)制的分子機制（DNA的半不連續(xù)復(fù)制）1、岡崎片段和半不連續(xù)復(fù)制 2、RNA引物3、半不連續(xù)復(fù)制過程 岡崎片斷和半不連續(xù)復(fù)制岡崎等提出DNA的不連續(xù)復(fù)制模型，認(rèn)為：35走向的DNA是由許多53方向合成的DNA片段連接而成的。實驗放射自顯影、電子顯微鏡觀察 岡崎片段： 以53走向DNA為模板合成的小片段。 約1000-2000bp。 結(jié)論：DNA是半不連續(xù)合成的。前導(dǎo)鏈（leading strand):以

14、35 鏈為模板，新生鏈以53方向連續(xù)合成；后隨鏈(lagging strand): 由岡崎片段連接成的DNA鏈為后隨鏈。RNA引物 通過對新合成的DNA鏈分析發(fā)現(xiàn)它們以共價鍵連接著一小段RNA鏈；經(jīng)RNA酶水解證明RNA鏈位于DNA片斷的5端。以上說明：岡崎片斷的合成需要RNA引物。RNA引物酶（RNA primase)：為多聚體； 功能：催化引物合成，在DNA模板鏈的一定部位合成并與其互補，合成方向53。引物酶合成的引物為十幾個核苷酸。岡崎片段引物的合成不需要特異的起始部位。半不連續(xù)復(fù)制過程：A、引物酶按DNA模板合成出前導(dǎo)鏈和后隨 鏈引物。B、DNApol在引物上延伸（前導(dǎo)鏈和后 隨鏈）。

15、C、完成DNA合成后，DNApol用其53 外切酶活性除去引物并填補缺口。D、DNA連接酶將兩個岡崎片段連接起來。引發(fā)體（解鏈酶、引物合成酶、RNA引物）五、原核細(xì)胞DNA復(fù)制過程(1)解旋：由拓?fù)洚悩?gòu)酶解除超螺旋；(2)解鏈：由DNA解鏈酶催化，SSB與單鏈DNA結(jié)合，防止雙鏈間氫鍵再形成； (3)RNA引物合成：以DNA為模板，在引物酶催化下由DNA轉(zhuǎn)錄生成5-10個 核苷酸鏈；(4)DNA鏈延長：在引物3-OH基上，按堿基互補原則經(jīng)DNA聚合酶（主要是 酶）催化DNA鏈從53延伸。前導(dǎo)鏈為連續(xù)的；后滯鏈 為不連續(xù)的岡崎片段。(5)切除引物，補齊缺口：由DNA聚合酶催化，切去RNA引物；

16、按堿基互補原則，沿53方向，補齊缺口。(6)連接封口： 由DNA連接酶催化，將補齊缺口的3-OH基與下一個岡崎片段 的5-P以磷酸二酯鍵連接起來（消耗NADH+）最終形成完整的、 與模板互補的DNA新鏈(7)校正并修復(fù)DNA：由DNA聚合酶校正并切除錯配，再按53方向加上 正確核苷酸。大腸桿菌復(fù)制體結(jié)構(gòu)示意圖DNA復(fù)制的忠實性 DNA復(fù)制過程是一個高度精確的過程，據(jù)估計，大腸桿菌DNA復(fù)制5109堿基對僅出現(xiàn)一個誤差。保證復(fù)制忠實性的原因主要有以下三點: DNA聚合酶的高度專一性（嚴(yán)格遵循堿基配對原則） DNA聚合酶的校對功能（錯配堿基被3-5外切酶切除） 起始時以RNA作為引物DNA聚合酶的

17、校對功能聚合酶錯配鹼基復(fù)制方向正 確核苷酸555333切除錯配核苷酸起始時以RNA作為引物的作用 DNA復(fù)制為什么要合成一個RNA引物，而后又把這個引物消除呢？這是保證DNA聚合過程高度精確的又一措施。 已知DNA 聚合酶具有35外切酶功能校對復(fù)制過程中的核苷酸，也就是說聚合酶在開始形成一個新的磷酸二酯鍵前，總是檢查前一個堿基是否正確，這就決定了它不能從頭開始合成。因此先合成一條低忠實性的多核苷酸來開始DNA的合成，并以核糖核苷酸來表示是“暫時”的，當(dāng)DNA開始聚合以后再以53外切酶的功能切除，以高忠實性的脫氧核苷酸取而代之，確保復(fù)制的忠實性。七、真核細(xì)胞DNA的復(fù)制真核細(xì)胞DNA復(fù)制與原核類

18、似，但更復(fù)雜，不同之處：1、真核生物的DNA通常與組蛋白構(gòu)成核小體，以染色質(zhì)的形 式存在于細(xì)胞核中。2、DNA模板上有多個起點，即真核細(xì)胞DNA復(fù)制由多個復(fù)制子共同完成。3、真核生物染色體在全部復(fù)制完成之前起點不再重新開始 復(fù)制，而快速生長的原核生物起點可以連續(xù)發(fā)動復(fù)制。 4、有5種DNA聚合酶：、；5、端粒（telomere)的復(fù)制真核細(xì)胞DNA復(fù)制的特點 多個起點復(fù)制起點起點起點起點起點起點真核生物的DNA聚合酶DNA聚合酶 分子量亞基數(shù)細(xì)胞內(nèi)分布功能外切酶活力DNA聚合酶 110-23,000四個細(xì)胞核引物合成無120,000二個線粒體線粒體DNA合成3-5外切酶400,000二個細(xì)胞核

19、核DNA 合成 3-5外切酶DNA聚合酶 DNA聚合酶 45,000一個細(xì)胞核修復(fù)DNA無端粒（telomere)的復(fù)制端粒：線形染色體末端富含G的核苷酸序列。端粒酶（telomerase)功能：穩(wěn)定染色體末端結(jié)構(gòu)，防止染色體間末端連接，并可補償滯后鏈5末端在切除RNA引物后造成的空缺。端粒、端粒酶意義：與細(xì)胞衰老、凋亡有關(guān)； 正常：體細(xì)胞端粒酶活性喪失。 異常：腫瘤細(xì)胞端粒酶活性恢復(fù)，端粒復(fù)制，細(xì)胞惡性增殖。 抑制端粒酶活性可防治腫瘤。端粒酶（telomerase） DNA復(fù)制需要引物，但在線形DNA分子末端不可能通過正常的機制在引物被降解后合成相應(yīng)的片段.如果沒有特殊的機制合成末端序列，染

20、色體就會在細(xì)胞傳代中變得越來越短。這一難題是通過端粒酶的發(fā)現(xiàn)才得到了澄清。端粒酶是催化端粒復(fù)制的一種核糖核蛋白，攜帶RNA模板（與端?；パa）的逆轉(zhuǎn)錄酶?？墒箯?fù)制以后的線形DNA分子的末端保持不變。功能：1）起模板作用；2）有逆轉(zhuǎn)錄酶的作用。 初步研究表明，人體中生殖細(xì)胞的端粒長度保持不變，而體細(xì)胞的端粒長度則隨個體的老化而逐步縮短。對此的一個推論是：人的生殖細(xì)胞具端粒酶的活力，體細(xì)胞則否。這一問題的解決無疑會有助于對生命衰老的認(rèn)識。53AAAACCCCAAAACCCCCCA端粒酶端粒復(fù)制:1）借RNA與末端ssDNA互補；2）以酶上RNA為模板合成一段DNA；3）延長的ssDNA反折為雙鏈。是

21、不依賴模板DNA的復(fù)制來補償切除引物引起的末端縮短。真核和原核DNA細(xì)胞復(fù)制比較第二節(jié) DNA的損傷與修復(fù) 某些物理化學(xué)因子，如紫外線、電離輻射和化學(xué)誘變劑等，都有引起生物突變和致死的作用，其機理是作用于DNA，造成DNA結(jié)構(gòu)和功能的破壞，稱為DNA的損傷。DNA的修復(fù)主要有以下類型: 二、 直接修復(fù)（光裂合酶） 五、誘導(dǎo)修復(fù)（SOS修復(fù)）三、切除修復(fù)四、重組修復(fù) 一、錯配修復(fù)（核酸外切酶切除，聚合酶修復(fù)）DNA紫外線損傷的光裂合酶修復(fù)1、形成嘧啶二聚體 影響DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)2、光復(fù)合酶結(jié)合于損傷部位3、酶被可見光激活4、修復(fù)后酶被釋放DNA的損傷和切除修復(fù)堿基丟失堿基缺陷或錯配結(jié)構(gòu)缺陷切開核酸內(nèi)切酶核酸外切酶切除DNA聚合酶DNA連接酶核酸內(nèi)切酶核酸外切酶切開切除修復(fù)連接糖苷酶插入酶堿基取代DNA的重組修復(fù)胸腺嘧啶二聚體復(fù)制核酸酶及重組蛋白修復(fù)復(fù)制DNA聚合酶DNA連接酶重組SOS反應(yīng)的機制未誘導(dǎo)的細(xì)胞靶基因lexA基因被LexA 蛋白質(zhì)部分阻遏recA基因被LexA 蛋白質(zhì)部分阻遏（40個不同的位點被阻遏）LexA(阻遏物) RecA(輔蛋白酶)靶基因表達(dá)lexA靶基因表達(dá) 但產(chǎn)物被分解recA大量