微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)原理及思考題

1、微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)原理及思考題一、培養(yǎng)基的配制原理：微生物的生長發(fā)育都有一定的營養(yǎng)需要，培養(yǎng)基即人工培養(yǎng)物，為其生長發(fā)育提供所需營養(yǎng)的基質(zhì)。培養(yǎng)基配制好以后必須經(jīng)過滅菌方能用于分離培養(yǎng)微生物實(shí)驗(yàn)。一次培養(yǎng)基的配制和滅菌是微生物實(shí)驗(yàn)室中最基本的操作，通過本次實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)微生物實(shí)驗(yàn)室中常用培養(yǎng)基的配制方法和滅菌方法。配制培養(yǎng)基應(yīng)注意哪些問題？要選定合適的培養(yǎng)基，培養(yǎng)基成分要稱量準(zhǔn)確；pH要適宜，調(diào)pH時(shí)要小心操作，避免回調(diào)；滅菌要嚴(yán)格。稱藥品的鑰匙不要混用，稱完藥品應(yīng)及時(shí)蓋緊瓶蓋，因?yàn)槟承┏煞秩绲鞍纂藰O易吸水潮解。培養(yǎng)基配制完成后為什么要立即滅菌？已滅菌的培養(yǎng)基如何進(jìn)行無菌檢查？防止細(xì)菌污染培養(yǎng)基，一旦細(xì)菌

2、污染了培養(yǎng)基，由于培養(yǎng)基有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，細(xì)菌會段時(shí)間內(nèi)大量產(chǎn)生。這樣會跟培養(yǎng)物爭奪營養(yǎng)物質(zhì)，另一方面，細(xì)菌生長過程中會產(chǎn)生有毒物質(zhì)致使培養(yǎng)物死亡。放在37的恒溫箱中一兩天后，培養(yǎng)基上沒有生長任何微生物的就可以使用（若有微生物則是以菌落出現(xiàn)的，肉眼可以看見）二、細(xì)菌的單染色技術(shù)原理：單染色法師利用單一染料對細(xì)菌進(jìn)行染色的一種方法。在中性，堿性或弱酸性溶液中，細(xì)菌細(xì)胞通常帶負(fù)電荷，所以常用堿性染料進(jìn)行染色。堿性染料并不是堿，和其他染料一樣是一種鹽，電離時(shí)染料離子帶正電，易于帶負(fù)電荷的細(xì)菌結(jié)合而使細(xì)菌著色。制備染色標(biāo)本時(shí)的注意事項(xiàng)？選擇合適菌齡的細(xì)菌；固定時(shí)避免火焰直接烘烤破壞細(xì)菌形態(tài)；染色時(shí)間要

3、適宜；水洗時(shí)水不能直接沖在涂片處。制片為什么要完全干燥后才能用油鏡觀察？油和水之間會分層，油就不能與標(biāo)本接觸還有光會發(fā)生折射等等原因，這樣不利于油鏡觀察。油鏡便于觀察的原理是什么?用油鏡觀察時(shí)在油鏡與載玻片之間加入了和玻璃折射率相近的香柏油，使進(jìn)入透鏡的光線增多，視野亮度增強(qiáng)，使物象明亮清晰。細(xì)調(diào)節(jié)器每旋轉(zhuǎn)一周使鏡筒上升或下降0.1mm.三、細(xì)菌的革蘭氏染色法原理：細(xì)菌先經(jīng)堿性染料結(jié)晶紫染色，而經(jīng)碘液媒染后用酒精脫色，在一定條件下有的細(xì)菌紫色不被脫去，為G+，有的可被脫去，為G-。注意事項(xiàng)：1.革蘭氏染色成敗的關(guān)鍵是乙醇脫色。脫色過度，陽性細(xì)菌被染成陰性細(xì)菌，脫色不足，陰性細(xì)菌被染成陽性細(xì)菌。

4、2.涂片務(wù)必均勻，切忌過厚，以免脫色不徹底造成假陽性。3.要用活躍生長期的適齡菌，老齡菌因體內(nèi)核算減少或菌體死亡，會使陽性菌被染成陰性菌，故不建議使用。為什么革蘭氏染色所用細(xì)菌的菌齡一般不超過24h？若菌齡太老，由于菌體死亡或自溶常使革蘭氏陽性菌轉(zhuǎn)呈陰性反應(yīng)，關(guān)鍵在于細(xì)胞壁的通透性的改變，使結(jié)晶紫染液可以脫色透出。當(dāng)你對一株未知菌進(jìn)行革蘭氏染色時(shí)，怎樣才能保證你的操作正確，結(jié)果可靠？找事先已知的且和未知菌形態(tài)明顯不同的G+和G-分別做混合涂片，當(dāng)和G+做時(shí)G+正確顯紫色和當(dāng)和G-做時(shí)G-正確顯紅色，看這個(gè)未知菌分別顯什么色，若一致，則可確定此菌為G+或G-。再回過頭單做此未知菌的革蘭氏染色，顯

5、現(xiàn)正確那就證明此染色技術(shù)操作正確。四、細(xì)菌的鞭毛染色法原理：染色前先用媒染劑處理，讓他沉積在鞭毛上，使鞭毛直徑加粗，然后再進(jìn)行染色。注意事項(xiàng)：1.鍍銀法染色染色液必須現(xiàn)配先用，不能存放。2.Leifson染色法受菌種，菌齡和室溫等因素的影響，且染色液須經(jīng)1520次過濾，要掌握好染色條件3.細(xì)菌鞭毛極細(xì)，很易脫落，在整個(gè)操作過程中藥小心，防止鞭毛脫落。4.染色用玻片干凈無油污是鞭毛染色成功的先決條件。哪些因素能影響鞭毛染色結(jié)果？如何控制？選取的細(xì)菌菌種及菌齡要適宜；鍍銀法染色液必須現(xiàn)配先用；操作要小心，防止鞭毛脫落；染色用玻片干凈無油污。鞭毛染色的菌種為什么要連續(xù)傳種幾代，并且要采用幼齡菌種？因

6、為菌齡較老的細(xì)菌容易失落鞭毛。五、細(xì)菌數(shù)量的測定原理：鏡檢計(jì)數(shù)法適用于各種含單細(xì)胞菌體的純培養(yǎng)懸浮液，如有雜質(zhì)或雜菌常不易分辨。菌體較大的酵母菌或霉菌孢子可采用血球計(jì)數(shù)板。血球計(jì)數(shù)板較厚，不能使用油鏡，故細(xì)菌不易看清。注意事項(xiàng)：1.有壓線的菌體，每格只統(tǒng)計(jì)上方及右方線上的細(xì)胞；2.因菌液在血球計(jì)數(shù)板上處于不同的空間，要在不同的焦距下才能看全，所以觀察時(shí)必須不斷調(diào)節(jié)細(xì)螺旋方可找全。3.每個(gè)樣品重復(fù)23次，若兩次差別太大應(yīng)重測。哪些因素會造成血細(xì)胞計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)誤差，應(yīng)如何避免 ？儀器的準(zhǔn)確度和操作的規(guī)范性所用器材均應(yīng)清潔干燥，計(jì)數(shù)板的規(guī)格應(yīng)符合要求或經(jīng)過校正；必須一次性充滿計(jì)數(shù)室，防止產(chǎn)生氣泡。六

7、、放線菌的形態(tài)和結(jié)構(gòu)觀察原理：放線菌細(xì)胞一般呈分枝無隔的絲狀，纖細(xì)的菌絲體分為基內(nèi)菌絲和氣生菌絲.采用插片法觀察放線菌。將蓋玻片傾斜約45角插入瓊脂表面，然后將放線菌接種于蓋玻片與培養(yǎng)基接縫處，經(jīng)培養(yǎng)使放線菌生長在蓋玻片上。觀察時(shí)將蓋玻片取下，貼放在載玻片上，直接鏡檢。注意事項(xiàng)：1.用玻璃紙法接種時(shí)，注意玻璃紙與培養(yǎng)基之間不能有氣泡，以免影響其表面放線菌的生長。2.操作過程，切勿動玻璃紙菌面上的培養(yǎng)物。玻璃紙培養(yǎng)和觀察法是否可以應(yīng)用于其他微生物類群的培養(yǎng)和觀察？為什么可以應(yīng)用于霉菌。鏡檢時(shí)，如何區(qū)別放線菌的基內(nèi)菌絲和氣生菌絲？基內(nèi)菌絲分枝繁茂，無色或產(chǎn)生水溶性或脂溶性色素而呈現(xiàn)黃、綠、橙、紅、

8、紫、藍(lán)、褐、黑等各種顏色。氣生菌絲顏色較深且較基內(nèi)菌絲粗，直徑為11.4m，直形或彎曲狀，有分枝，有的產(chǎn)生色素。七、酵母菌形態(tài)觀察及死活細(xì)胞的鑒別原理：酵母菌是多行的，不運(yùn)動的單細(xì)胞微生物，細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)已有明顯分化，菌體比細(xì)菌大。美藍(lán)是一種無毒性染料，他的氧化型呈藍(lán)色，還原型無色。用美藍(lán)對酵母的活細(xì)胞進(jìn)行染色時(shí)，由于活細(xì)胞的新陳代謝作用，細(xì)胞內(nèi)具有較強(qiáng)的還原能力，能是美藍(lán)由藍(lán)色的氧化型變成無色的還原型。因此，具有還原能力的酵母細(xì)胞是無色的，而死細(xì)胞或代謝作用微弱的衰老細(xì)胞則呈藍(lán)色或淡藍(lán)色。注意事項(xiàng)：1.染液不宜過多或過少，否則再蓋上蓋片時(shí)菌液會溢出或出現(xiàn)大量氣泡而影響觀察。2.蓋玻片不宜平著

9、放下，以免產(chǎn)生氣泡影響觀察。美藍(lán)染色法對酵母細(xì)胞進(jìn)行死活鑒別時(shí)為什么要控制染液濃度和染色時(shí)間？美藍(lán)濃度高和染色時(shí)間過長都會增加酵母菌的死亡，美蘭有氧化性，濃度太高會使活菌很快致死，濃度低老齡細(xì)胞與活細(xì)胞不易區(qū)分；染色時(shí)間短，活細(xì)胞還沒從藍(lán)變無色，觀察到的活細(xì)胞數(shù)量會比預(yù)計(jì)的少，染色時(shí)間長，活細(xì)胞數(shù)量也會減少顯微鏡下，酵母菌有哪些特征區(qū)別于一般細(xì)菌？酵母菌菌體呈圓形、卵形或橢圓形不同于一般細(xì)菌的形狀；酵母菌菌體比一般細(xì)菌大。八、霉菌形態(tài)的觀察原理：霉菌營養(yǎng)體是分支的絲狀體，分為基內(nèi)菌絲和氣生菌絲。氣生菌絲又可分化出繁殖絲。不同霉菌的繁殖絲可形成不同的孢子。霉菌的個(gè)體比細(xì)菌和放線菌大的多，故用低倍

10、鏡即可觀察，常用的觀察方法有直接制片觀察，載波濕室培養(yǎng)觀察法和玻璃紙透析培養(yǎng)法三種。霉菌菌絲體較粗大，細(xì)胞易收縮變形，且孢子絲易飛散，故在直接制片觀察時(shí)常用乳酸石碳酸棉蘭染色液。其優(yōu)點(diǎn)是：細(xì)胞既不變形，又具有殺菌防腐作用，且不易干燥，能保持較長時(shí)間，還能防止孢子飛散。染液的藍(lán)色能增強(qiáng)反差，使物象更清楚。注意事項(xiàng)：1.瓊脂塊的制作應(yīng)注意無菌操作；2.載玻片培養(yǎng)時(shí)，盡可能將分散的孢子接種在瓊脂塊邊緣，且量要少，以免培養(yǎng)后菌絲過于稠密影響觀察。3.制片時(shí)，盡可能保持霉菌自然生長狀態(tài)，加蓋時(shí)勿入氣泡和移位。顯微鏡下，細(xì)菌，放線菌，酵母菌，和霉菌的主要區(qū)別？放線菌與細(xì)菌需要在油鏡下才能觀察清楚，而霉菌和

11、酵母菌在低倍鏡下即可看到。細(xì)菌：為細(xì)而短的單細(xì)胞微生物（個(gè)體微小），主要形態(tài)有：球、桿、螺旋狀等。（部分桿菌還可形成芽孢）放線菌：存在分枝絲狀體和菌絲體，革蘭氏陽性菌，有孢子絲和孢子（球形、橢圓形、桿狀、柱狀）。酵母菌：單細(xì)胞，菌體呈圓球、卵形或橢圓形，少數(shù)呈檸檬形、尖形等。菌體比細(xì)菌大幾倍到幾十倍，部分處于出芽繁殖過程中菌體還可觀察到芽體，大多數(shù)菌體上還有芽痕。霉菌：菌絲和孢子的寬度通常比細(xì)菌和放線菌粗得多，常是細(xì)菌菌體寬度的幾倍到幾十倍，在低倍鏡下即可看到，并還可看到孢子囊梗、囊軸、孢子囊、包囊孢子等。九、酸奶的制備和乳酸菌的分離原理：乳酸菌將牛奶中的乳糖發(fā)教程乳酸使其PH降至酪蛋白等電點(diǎn)附近從而使牛奶形成凝膠狀；其次，乳酸菌還會促使部分酪蛋白降解，形成乳酸鈣和產(chǎn)生一些脂肪，乙醛，雙乙酰和丁二酮等風(fēng)味物質(zhì)。發(fā)酵過程通過雙菌或多菌的混合培養(yǎng)實(shí)現(xiàn)。其中桿菌先分解酪蛋白為氨基酸和小肽，由此促進(jìn)了球菌的生長，而球菌產(chǎn)生的甲酸又刺激了桿菌產(chǎn)生大量乳酸和部分乙醛，此外球菌還產(chǎn)生了雙乙酰這類風(fēng)味物質(zhì)，達(dá)到了穩(wěn)定狀態(tài)的混合發(fā)酵。酸奶制作為什么混菌發(fā)酵？為了發(fā)酵均勻和完全十、質(zhì)粒DNA的小量制備原理：在pH 12.0-12.6堿性環(huán)境中，線性的大分子量細(xì)菌染色體DN