農(nóng)桿菌介導(dǎo)法課件

1、2.5 植物基因工程121983年首次成功實(shí)現(xiàn)了將外源基因(Bt基因)導(dǎo)入植物（煙草）進(jìn)行表達(dá)。到現(xiàn)在100多種不同的植物物種都實(shí)現(xiàn)了轉(zhuǎn)化。1994年：首個(gè)轉(zhuǎn)基因食品（延熟番茄）在美國上市1996年：轉(zhuǎn)基因作物種植商業(yè)化的第一年，僅有6個(gè)國家2007年：232008年：252009年：252010年：29我國目前共有7種轉(zhuǎn)基因植物允許商業(yè)化種植，包括番茄、甜椒、辣椒、矮牽牛、玉米、水稻、棉花，其中種植面積最多的是轉(zhuǎn)基因棉花。*34截至2009年底，全球已有25個(gè)國家批準(zhǔn)了24種轉(zhuǎn)基因作物的商業(yè)化應(yīng)用。562009年我國種植的轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物主要是棉花。2010年4月2日：2009年第三批安全證書中

2、，181個(gè)項(xiàng)目中有172個(gè)是棉花。7“中國生物安全網(wǎng)”隸屬農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理辦公室，專門負(fù)責(zé)發(fā)布相關(guān)政策及審批信息http:/biosafety/892009年我國種植的轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物主要是棉花。2009年農(nóng)業(yè)部為轉(zhuǎn)基因水稻、玉米頒發(fā)了生物安全證書，未來幾年我國可能實(shí)現(xiàn)用于纖維的Bt棉花、用作飼料的植酸酶玉米和用于糧食作物的Bt水稻商業(yè)化種植。來源于蘇云金芽孢桿菌的殺蟲晶體蛋白10蘇云金芽孢桿菌的殺蟲晶體蛋白，家畜、人類食用了，是否安全？ 一虎一席談20100417期(轉(zhuǎn)基因食品安不安全？) /programs/view/oP2DE9jbsho11蘇云金芽孢桿菌(Bacillus th

3、uringiensis, Bt) 革蘭氏陰性菌，菌體短桿狀，生鞭毛，單生或形成短鏈，內(nèi)生芽孢有若干菌株（亞種），產(chǎn)生不同的毒素，能特異地殺死不同昆蟲。121901年在日本被發(fā)現(xiàn)蘇云金芽孢桿菌1911 年由貝利納（E.Berliner）從德國蘇云金地區(qū)一家面粉廠寄出的地中海粉螟的患病幼蟲中分離出來，1915年被命名.1951年發(fā)現(xiàn)具有潛在商業(yè)價(jià)值是當(dāng)前國內(nèi)外研究最多，應(yīng)用最廣泛，最成功、開發(fā)時(shí)間最長、產(chǎn)量最大的殺蟲細(xì)菌能感染130多種鱗翅目幼蟲和一些膜翅目、雙翅目、直翅目和鞘翅目的一些昆蟲，如吉卜賽毒蛾、小菜蛾、松毛蟲、樅色卷蛾等13Bt能殺死宿主昆蟲主要靠其芽孢和毒素（殺蟲晶體蛋白，Bt）。細(xì)

4、菌營養(yǎng)生長到一定階段后，在細(xì)菌的一端形成芽孢，另一端形成伴孢晶體（蛋白質(zhì)晶體、近菱形）。菌體破裂后可釋放出芽孢和伴孢晶體。伴胞晶體主要由蛋白質(zhì)（殺蟲晶體蛋白，ICP，cry）和糖組成，不溶于水或有機(jī)溶劑,有一定耐熱能力(100下保毒30min)，可溶于堿性溶液。*14當(dāng)昆蟲吞食后，ICP在昆蟲中腸的堿性消化液和胰蛋白酶作用下，變成有活性的毒蛋白，并與昆蟲中腸上皮細(xì)胞上的特異性受體結(jié)合，全部或部分嵌合于細(xì)胞膜中形成離子通道，造成膜穿孔，細(xì)胞滲透平衡受到破壞，代謝終止，昆蟲停止進(jìn)食，最后脫水死亡。由于ICP要形成有活性的毒蛋白，必須同時(shí)具備堿性條件和特定的蛋白酶才能產(chǎn)生，因此人畜不受影響。殺蟲晶體

5、蛋白的殺蟲作用機(jī)理*15芽孢（spore）細(xì)菌生長到一定階段形成的一種結(jié)構(gòu)，是營養(yǎng)細(xì)胞的休眠體。成熟的芽孢可抵抗溶菌酶的消化，具保護(hù)作用。對鱗翅目幼蟲有毒性的芽孢包括活芽孢、死芽孢、芽孢衣和芽孢外套。純的芽孢對昆蟲毒力很低，主要通過與殺蟲晶體蛋白協(xié)同作用起到殺蟲的效果。16在殺蟲晶體蛋白對中腸上皮細(xì)胞造成膜穿孔之后，在昆蟲血腔大量繁殖，營養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)生的大量的外毒素和酶，使得幼蟲患敗血癥，同時(shí)腸液也進(jìn)入血腔使血淋巴pH值上升,幼蟲全身癱瘓,發(fā)黑,最終死亡。芽孢的殺蟲作用機(jī)理174 Bt的其他活性物質(zhì)營養(yǎng)期殺蟲蛋白（Vegetative insecticital protein, VIP）幾丁質(zhì)酶（

6、 chitinase ）蘇云金素（thuringiensin）18Contents2.5.1常用的植物轉(zhuǎn)化方法(農(nóng)桿菌介導(dǎo)法)2.5.2 植物基因工程的應(yīng)用2.5.3轉(zhuǎn)基因植物的安全性問題192.5.1常用的植物轉(zhuǎn)化方法Agrobacterium-mediated transformation（農(nóng)桿菌介導(dǎo)法）*種質(zhì)系統(tǒng)介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化（花粉管通道法等）plant viruses（植物病毒載體介導(dǎo)法）direct DNA transfer（DNA直接導(dǎo)入法化學(xué)（PEG介導(dǎo)法、脂質(zhì)體法）；物理（基因槍法、電激法、激光微束法、 顯微注射法等）目前較為成熟的植物病毒載體是花椰菜花葉病毒(CaMV)和番茄金

7、花葉病毒(TGMV)。20農(nóng)桿菌介導(dǎo)法目前研究最多、理論機(jī)理最清楚、技術(shù)方法最成熟的基因轉(zhuǎn)化途徑是當(dāng)前植物基因工程最常用的方法第一批能表達(dá)外源基因的轉(zhuǎn)基因植物就是用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化獲得的。迄今所獲得的轉(zhuǎn)基因植株中80以上是利用根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化系統(tǒng)產(chǎn)生的。*番茄莖桿上的根瘤21根瘤菌科，農(nóng)桿菌屬（Agrobacterium）：革蘭氏陰性菌，侵染植物傷口進(jìn)入細(xì)胞后，將T-DNA插入植物基因組中，導(dǎo)致植物產(chǎn)生冠癭瘤或毛狀不定根，干擾植物的正常生長根癌農(nóng)桿菌（A. tumefaciens） Ti質(zhì)粒(tumor-inducing plasmid) （廣泛使用）發(fā)根農(nóng)桿菌(A. rhizogenes) R

8、i質(zhì)粒(root-inducing plasmid)22Ti plasmidTi（tumor-inducing plasmid）質(zhì)粒：根癌農(nóng)桿菌含有一種內(nèi)源質(zhì)粒，大小因種類而異，在200250kb之間。當(dāng)農(nóng)桿菌同植物接觸時(shí)，Ti質(zhì)粒中有一段DNA，大約在15kb-30kb，稱為T-DNA（transfer-DNA），能轉(zhuǎn)移并整合到植物基因組中，并導(dǎo)致冠癭瘤的形成。章魚堿型胭脂堿型農(nóng)桿堿型農(nóng)桿菌素型琥珀堿型根據(jù)其誘導(dǎo)的植物冠癭瘤中所合成的冠癭堿種類，Ti 質(zhì)粒進(jìn)行分類*23Ti質(zhì)粒分為4個(gè)功能區(qū)：Con區(qū)：與細(xì)菌間接合轉(zhuǎn)移的有關(guān)基因，調(diào)控Ti 質(zhì)粒在農(nóng)桿菌之間的轉(zhuǎn)移 Ori區(qū)：Ori區(qū)上的基因調(diào)

9、控Ti 質(zhì)粒的自我復(fù)制。TDNA區(qū)：從Ti質(zhì)粒上被切割下來轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞的一段DNA，約23kb，含有編碼植物激素和冠癭堿的基因。 Vir區(qū)：Vir區(qū)上的基因能激活T-DNA轉(zhuǎn)移，使根癌農(nóng)桿菌表現(xiàn)出毒性*24邊界序列TDNA左右兩端邊界各有一個(gè)25bp長的正向重復(fù)序列(左邊界(left border, LB) ，右邊界(right border, RB)，在不同Ti質(zhì)粒中高度保守。它在T-DNA的切除及整合過程具有重要意義。右邊界的存在對外源基因整合到植物基因組中相當(dāng)重要，但左邊界則非必須。邊界序列對TDNA轉(zhuǎn)移和整合不可缺少；已證實(shí)只要保留兩端邊界序列，雖然中間序列不同程度被外源片斷所替換，

10、仍可轉(zhuǎn)移整合到植物基因組中 Ti質(zhì)粒遺傳轉(zhuǎn)化的理論依據(jù)。 *25外源基因在Ti質(zhì)粒介導(dǎo)轉(zhuǎn)化到植物的過程(T-DNA的轉(zhuǎn)移過程)農(nóng)桿菌吸附于植物的表面?zhèn)诓课皇芊宇愇镔|(zhì)（乙酰丁香酮或羥基乙酰丁香酮）的誘導(dǎo)，vir區(qū)基因被激活，virD基因編碼的核酸內(nèi)切酶分別將T-DNA的RB序列和LB序列切出單鏈切口，釋放出T-DNA的單鏈線性拷貝（T-鏈）T-鏈在RB序列的引導(dǎo)下定向穿過農(nóng)桿菌的細(xì)胞膜、細(xì)胞壁、進(jìn)入植物細(xì)胞壁并整合到植物的染色體基因組中T-DNA在植物細(xì)胞中表達(dá)*26Ti質(zhì)粒介導(dǎo)轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞示意圖27根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化植株的基本程序可簡單分為三大部分研究工作轉(zhuǎn)化是將目的基因?qū)胧荏w植物細(xì)胞，并

11、且能得以表達(dá)和穩(wěn)定的遺傳。所以它也是基因工程研究應(yīng)用于生產(chǎn)的關(guān)鍵技術(shù)。*受體系統(tǒng)的建立（組織培養(yǎng)體系）Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建目的基因的轉(zhuǎn)化28田間試驗(yàn)、遺傳分析、性狀鑒定根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化植株的基本程序（詳細(xì)）植物表達(dá)載體構(gòu)建（E.coli）選擇受體材料重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌（三親、凍融等）建立植株再生體系遺傳轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞（共培養(yǎng)）轉(zhuǎn)化體篩選（抗生素）植株再生（組織培養(yǎng)）轉(zhuǎn)基因植株的檢測（PCR、分子雜交等）*29水稻幼胚水稻成熟胚水稻胚性愈傷側(cè)面觀底面觀潮霉素篩選及分化溫室煉苗農(nóng)桿菌與愈傷共培養(yǎng)30植物表達(dá)載體構(gòu)建重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌建立植株再生體系遺傳轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞31創(chuàng)傷植株感染法（植株接種

12、共轉(zhuǎn)化法）農(nóng)桿菌介導(dǎo)外源基因轉(zhuǎn)化植物的常用方法：2 共培養(yǎng)感染法葉盤轉(zhuǎn)化法愈傷組織共培養(yǎng)轉(zhuǎn)化法懸浮細(xì)胞共培養(yǎng)轉(zhuǎn)化法原生質(zhì)體共培養(yǎng)轉(zhuǎn)化法32Ti質(zhì)粒介導(dǎo)轉(zhuǎn)化植物的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：自然界天然存在的基因工程，轉(zhuǎn)化效率高主要以單拷貝或低拷貝形式插入，利于后代的純化和穩(wěn)定遺傳不需要特殊的專用設(shè)備缺點(diǎn)：只能以T-DNA插入的方式導(dǎo)入寄主細(xì)胞，沒有方向性331.2 基因槍法（particle gun）也稱微彈轟擊法：將外源DNA包被在微小的金粒或鎢粒表面，然后在高壓的作用下微粒被高速射入受體細(xì)胞或組織。微粒上的外源DNA進(jìn)入細(xì)胞后，整合到植物染色體上，從而實(shí)現(xiàn)基因的轉(zhuǎn)化?？蓪⒒驑尫譃槿N類型：第一類是以火藥作

13、為動(dòng)力；第二類是以高壓氣體作為動(dòng)力；第三類是以高壓放電作為動(dòng)力。34基因槍35提高植物的農(nóng)業(yè)價(jià)值（產(chǎn)量、品質(zhì)、抗性）和園藝價(jià)值（花色、花形、花期），eg. 抗蟲棉、轉(zhuǎn)基因矮牽牛等；作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)某些重要蛋白質(zhì)和次生代謝物質(zhì)，eg. 生長激素、干擾素、白介素-2、 乙肝疫苗、表皮生長因子等；研究基因在發(fā)育及其他生理生化過程與代謝途徑中的作用2 植物基因工程的應(yīng)用363 轉(zhuǎn)基因植物的安全性問題轉(zhuǎn)基因植物的擴(kuò)散、轉(zhuǎn)入植物的外源基因的擴(kuò)散、轉(zhuǎn)入植物的其他標(biāo)記基因的擴(kuò)散、轉(zhuǎn)基因植物是否會(huì)影響生物多樣性、轉(zhuǎn)基因植物是否會(huì)改變與之相關(guān)物種（如害蟲）的進(jìn)化速度、轉(zhuǎn)基因植物中標(biāo)記基因的毒性問題等環(huán)境安全性食品安全性其食用部分是否會(huì)引起食用者產(chǎn)生不良反應(yīng)(過敏)，有無累積效應(yīng)；經(jīng)合組織1993年提出了食品安全性評價(jià)的實(shí)質(zhì)等同性原則。如果轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)的產(chǎn)品與傳統(tǒng)產(chǎn)品具有實(shí)質(zhì)等同性，則可以認(rèn)為是安全的。*37應(yīng)對措施設(shè)置緩沖作物帶；設(shè)置隔離區(qū)；質(zhì)粒構(gòu)建時(shí)盡量避免使用抗性基因或發(fā)展無選擇標(biāo)記的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)；轉(zhuǎn)基因作物與未轉(zhuǎn)基因作物隔年輪作；38小結(jié)：植物基因工程的主要內(nèi)容目的基因的獲得構(gòu)建合適的植物表達(dá)載體通過合適方式的介導(dǎo)（農(nóng)桿菌介導(dǎo)、基因槍、PEG介導(dǎo)、病毒載體介導(dǎo)等），將其轉(zhuǎn)化到植物受體細(xì)胞（創(chuàng)傷部位、原生質(zhì)體、