生物技術(shù)新進展和食品安全和質(zhì)量檢測及其應(yīng)用

1、生物技術(shù)新進展和食品安全和質(zhì)量檢測及其應(yīng)用第一節(jié) 新進展概述第二節(jié) 生物傳感器技術(shù)與應(yīng)用第三節(jié) 生物芯片技術(shù)與應(yīng)用第四節(jié) 免疫技術(shù)及其應(yīng)用 第二節(jié) 生物傳感器與食品安全檢測1 生物傳感器的基本概念 生物傳感器通常是指由一種生物敏感部件和轉(zhuǎn)化器緊密結(jié)合,對特定種類化學物質(zhì)或生物活性物質(zhì)具有選擇性和可逆響應(yīng)的分析裝置。 它是發(fā)展生物技術(shù)必不可少的一種先進的檢測與監(jiān)控方法,也是對食品質(zhì)量在分子水平上進行快速和微量分析的方法。生物傳感器工作原理待測物質(zhì)經(jīng)擴散作用進入固定生物膜敏感層，經(jīng)分子識別而發(fā)生生物學作用，產(chǎn)生的信息如光、熱、音等被相應(yīng)的信號轉(zhuǎn)換器變?yōu)榭啥亢吞幚淼碾娦盘?，再?jīng)二次儀表放大并輸出，

2、以電極測定其電流值或電壓值，從而換算出被測物質(zhì)的量或濃度。 .1 將化學變化轉(zhuǎn)變成電信號 如酶傳感器,酶催化特定底物發(fā)生反應(yīng),從而使特定生成物的量有所增減。 用能把這類物質(zhì)的量的改變轉(zhuǎn)換為電信號的裝置和固定化酶耦合,即組成酶傳感器,常用轉(zhuǎn)換裝置有氧電極、過氧化氫。 2.2 將熱變化轉(zhuǎn)換成電信號 固定化的生物材料與相應(yīng)的被測物作用時常伴有熱的變化。例如大多數(shù)酶反應(yīng)的熱焓變化量在25-100kJ/mol的范圍.這類生物傳感器的工作原理是把反應(yīng)的熱效應(yīng)借熱敏電阻轉(zhuǎn)換為阻值的變化,后者通過有放大器的電橋輸入到記錄儀中。 . 將光信號轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?例如，過氧化氫酶,能催化過氧化氫/魯米諾體系發(fā)光,因此如

3、設(shè)法將過氧化氫酶膜附著在光纖或光敏二極管的前端,再和光電流測定裝置相連,即可測定過氧化氫含量. 還有很多細菌能與特定底物發(fā)生反應(yīng),產(chǎn)生熒光.也可以用這種方法測定底物濃度.上述三類傳感器原理的共同點： 都是將分子識別元件中的生物敏感物質(zhì)與待測物發(fā)生化學反應(yīng),將反應(yīng)后所產(chǎn)生的化學或物理變化再通過信號轉(zhuǎn)換器轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘栠M行測量,這種方式統(tǒng)稱為間接測量方式. .4 直接產(chǎn)生電信號方式這種方式可以使酶反應(yīng)伴隨的電子轉(zhuǎn)移、微生物細胞的氧化直接(或通過電子遞體的作用)在電極表面上發(fā)生。根據(jù)所得的電流量即可得底物濃度。生物傳感器發(fā)展歷程開端于 20 世紀 60 年代。1962 年克拉克等人報道了用葡萄糖氧化酶

4、與氧電極組合檢測葡萄糖的結(jié)果 ,可認為是最早提出了生物傳感器(酶傳感器)的原理。1967年Updike等人實現(xiàn)了酶的固定化技術(shù) ,研制成功酶電極 ,這被認為是世界上第一個生物傳感器。 20世紀70年代中期后,生物傳感器技術(shù)的成功主要集中在對生物活性物質(zhì)的探索、活性物質(zhì)的固定化技術(shù)、生物電信息的轉(zhuǎn)換以及生物傳感器等研究 ,并獲得了較快的進展 。1977年,鈐木周一等發(fā)表了關(guān)于對生化需氧量(BOD)進行快速測定的微生物傳感器的報告 , 正式提出了對生物傳感器的命名。 生物傳感器分類 4.1 根據(jù)傳感器輸出信號的產(chǎn)生方式,可分為生物親合型生物傳感器、代謝型或催化型生物傳感器;* 4.2 根據(jù)生物傳感

5、器的信號轉(zhuǎn)換器可分為電化學生物傳感器、半導體生物傳感器、測熱型生物傳感器、測光型生物傳感器、測聲型生物傳感器等 4.3 根據(jù)生物傳感器中生物分子識別元件上的敏感材料可分為酶傳感器、微生物傳感器、免疫傳感器、組織傳感器、基因傳感器、細胞及細胞器傳感器。 每一類名稱又都包含許多種具體的生物傳感器例如，酶電極類:根據(jù)所用酶的不同就有幾十種，如葡萄糖電極、尿素電極、尿酸電極、膽固醇電極、乳酸電極、丙酮酸電極等等葡萄糖電極也并非只有一種，有用pH電極或碘離子電極作為轉(zhuǎn)換器的電位型葡萄糖電極，有用氧電極或過氧化氫電極作為轉(zhuǎn)換器的電流型葡萄糖電極等實際上還可再細分。 生物親合型傳感器 被測物質(zhì)與分子識別元件

6、上的敏感物質(zhì)具有生物親合作用，即二者能特異地相結(jié)合，同時引起敏感材料的分子結(jié)構(gòu)和/或固定介質(zhì)發(fā)生變化。例如：電荷、溫度、光學性質(zhì)等的變化。反應(yīng)式可表示為： S（底物）+ R（受體） = SR 代謝型傳感器 底物（被測物）與分子識別元件上的敏感物質(zhì)相作用并生成產(chǎn)物，信號轉(zhuǎn)換器將底物的消耗或產(chǎn)物的增加轉(zhuǎn)變?yōu)檩敵鲂盘?，這類傳感器稱為代謝型傳感器，其反應(yīng)形式可表示為 S（底物）R（受體）= SR P（生成物） 生物傳感器優(yōu)點：由于具有較高的選擇性，因此不需對被測組分進行分離，即不用對樣品進行預(yù)處理。結(jié)構(gòu)簡單，體積小，使用方便，特別是便攜式的生物傳感器，非常有利干食品質(zhì)量的市場快速評價；可以實現(xiàn)連續(xù)的在

7、線檢測，使食品加工過程的質(zhì)量控制變得簡便；響應(yīng)速度快，樣品用量少；與其他大型分析儀器相比，生物傳感器的制作成本低，且可反復(fù)使用。6 生物傳感器組成部分一 是生物分子識別元件(感受器),是具有分子識別能力的生物活性物質(zhì)(如組織切片、細胞、細胞器、細胞膜、酶、抗體、核酸、有機物分子等);二 是信號轉(zhuǎn)換器(換能器),主要有電化學電極(如電位、電流的測量)、光學檢測元件、熱敏電阻、場效應(yīng)晶體管、壓電石英晶體及表面等離子共振器件等，當待測物與分子識別元件特異性結(jié)合后,所產(chǎn)生的復(fù)合物(或光、熱等)通過信號轉(zhuǎn)換器變?yōu)榭梢暂敵龅碾娦盘枴⒐庑盘柕?從而達到分析檢測的目的。（一）生物識別元件它是酶、抗原(體)、細

8、胞器、組織切片和微生物細胞等生物分子經(jīng)固定化后形成的一種膜結(jié)構(gòu)，對被測定的物質(zhì)有選擇性的分子識別能力.（二）換能器它能將識別元件上進行的生化反應(yīng)中消耗或生成的化學物質(zhì)，或產(chǎn)生的光或熱等轉(zhuǎn)換為電信號，在一定條件下，產(chǎn)生的電信號強度和反應(yīng)中物質(zhì)的變化量或光、熱等的強度呈現(xiàn)一定的比例關(guān)系。換能器(信號轉(zhuǎn)換器)將分子識別元件進行識別時所產(chǎn)生的化學的或物理的變化轉(zhuǎn)換成可用信號生物傳感器的信號轉(zhuǎn)換器已有許多種，其中到目前為止用得最多的且比較成熟的是電化學電極，用它組成的生物傳感器稱為電化學生物傳感器（三）信號處理放大裝置主要負責信號的分析處理和放大輸出。它能將換能器產(chǎn)生的電信號進行處理、放大和輸出。手掌型

9、葡萄糖(glucose)分析儀 6.2 傳感器類型(1) 酶傳感器(EnzymeSensor) 酶的活力單位（酶單位）標準酶單位 國際生物化學協(xié)會酶委員會規(guī)定了酶單位的標準形式為：一個酶單位（U）是在特定的條件下lmin內(nèi)催化形成1mol產(chǎn)物的酶量（或轉(zhuǎn)化1mo1底物的酶量） 特定條件一般是指選定的條件，如溫度為25，30，37，最適pH,底物為飽和溶液 酶傳感器它將活性物質(zhì)酶覆蓋在電極表面,酶與被測的有機物或無機物反應(yīng),形成一種能被電極響應(yīng)的物質(zhì)。1967年Updick和Hicks將固定化的葡萄糖氧化酶膜結(jié)合在氧電極上,做成了第一支葡萄糖電極；此后,這類酶傳感器通常是通過檢測產(chǎn)物H2O2的濃

10、度變化或氧的消耗量來檢測底物。葡萄糖電極缺點:(1)溶解氧的變化可能引起電極響應(yīng)的波動;(2)由于氧的溶解度有限,當溶解氧貧乏時,響應(yīng)電流明顯下降而影響檢測限;(3)傳感器響應(yīng)性能受溶液pH值和溫度影響較大依據(jù)信號轉(zhuǎn)換器的類型,酶傳感器大致可分為酶電極(主要包括離子選擇電極、氣敏電極、氧化還原電極等電化學電極)、酶場效應(yīng)晶體管傳感器(FET-酶)和酶熱敏電阻傳感器等 (2) 組織傳感器(TissueSensor)組織傳感器是以動植物組織薄片中的生物催化層與基礎(chǔ)敏感膜電極結(jié)合而成,該催化層以酶為基礎(chǔ),基本原理與酶傳感器相同.與酶傳感器比較，組織傳感器具有如下優(yōu)點：1.酶活性較離析酶高.2.酶的穩(wěn)

11、定性增大.3.材料易于獲得.肝組織電極 動物肝組織中含有豐富的H2O2酶，可與氧電極組成測定H2O2及其它過氧化物的組織電極1981年Mascini等研究了數(shù)種哺乳動物和其它動物（鳥、魚、龜）的肝組織電極，翌年，報道了基于牛肝組織的H2O2電極 若向溶液中通以氮氣，以降低氧的溶解度，減少空氣平衡溶液中氧的殘余電流（約10A）至十分之幾微安，檢測下限可降低至1X10-5molL，相關(guān)系數(shù) R=0.997(n9) 植物組織膜電極結(jié)構(gòu)圖解 b一果皮, c-中果皮,d-內(nèi)果皮1-中果皮組織薄片2-固定化骨架3-透氣健, 4-墊圈5-內(nèi)電解質(zhì)6-復(fù)合PH電極7-塑料電極體二氧化碳氣敏電極結(jié)構(gòu) (3) 微

12、生物傳感器微生物傳感器分為兩類：一類是利用微生物在同化底物時消耗氧的呼吸作用；另一類是利用不同的微生物含有不同的酶。裝置：由適合的微生物電極與氧電極組成。原理：利用微生物的同化作用耗氧,通過測量氧電極電流的變化量來測量氧氣的減少量,從而達到測量底物濃度的目的.例如,熒光假單胞菌,能同化葡萄糖；蕓苔絲孢酵母可同化乙醇,因此可分別用來制備葡萄糖和乙醇傳感器，這兩種細菌在同化底物時,均消耗溶液中的氧,因此可用氧電極來測定基于不同類型的信號轉(zhuǎn)換器,常見的微生物傳感器有電化學型、光學型、熱敏電阻型、壓電高頻阻抗型和燃料電池型， (4) 核酸傳感器依據(jù)生物體內(nèi)核苷酸順序相對穩(wěn)定,核苷酸堿基順序互補的原理而

13、設(shè)計出核酸探針傳感器,即基因傳感器?；騻鞲衅饕话阌?030個核苷酸的單鏈核酸分子,能夠?qū)Ｒ坏嘏c特定靶序列進行雜交從而檢測出特定的目標核酸分子。根據(jù)換能器種類不同可分為電化學型、光學型、壓電免疫傳感器及表面等離子體共振型基因傳感器，這種傳感器可用于檢測食品中的病原體,為食品中病原體的鑒定提供了新的手段。7 生物傳感器的應(yīng)用在食品分析中的應(yīng)用在發(fā)酵工程中的應(yīng)用在環(huán)境監(jiān)測中的應(yīng)用在生物醫(yī)學上的應(yīng)用在軍事上的應(yīng)用在食品分析的應(yīng)用食品成分分析食品添加劑的分析農(nóng)藥和抗生素殘留量分析微生物和生物毒素的檢驗食品鮮度的檢測（一）食品鮮度的測定1、魚鮮度傳感器 魚鮮度傳感器在日本、拿大等國廣泛用于魚類鮮度的測定

14、。魚死后體內(nèi)ATP經(jīng)酶解依次形成ADP、AMP、IMP、肌苷、次黃嘌呤和尿酸、鮮度可用K值表示：K=肌苷+次黃嘌呤/ (ATP +ADP+AMP+IMP +肌苷+次黃嘌呤+尿酸)當K20時，魚極新鮮，可供生食。K在2040之問為新鮮，必須熟食。K大于40，不新鮮，不宜食用，這與嗅覺檢驗結(jié)果相一致。 由于大多數(shù)魚死后520h，ATP，ADP 和AMP已分解盡，超過24h，鮮度主要取決于IMP-肌苷-次黃嘌呤-尿酸。 基于此，Karube等催化將這3個步驟的三種酶（5核苷酸酶、核苷磷酸化酶、黃嘌呤氧化酶）固定在氧電極上，制成魚鮮度測定儀。2.肉鮮度傳感器肉類在腐敗過程中會產(chǎn)生各種胺類，故胺類測定也

15、能反映肉類的新鮮程度。用腐胺氧化酶與過氧化氫電極構(gòu)成多胺生物傳感器，測定肉在貯藏過程中的鮮度，反應(yīng)時間40s，測定腐胺線性范圍為3 10-4 molL。用單胺氧化酶膜和氧電極組成的酶傳感器測定可以豬肉新鮮度，響應(yīng)時間為4min，單胺測定線性范圍為502010 -4 molL。3.食品添加劑的分析過量的食品添加劑通常會對人體造成危害，因此對食品中添加劑含量進行分析和監(jiān)測是非常必要的。亞硫酸鹽是常用的食品防腐劑和漂白劑，但是亞硫酸鹽容易引起哮喘，因此美國FDA規(guī)定了其在新鮮水果和蔬菜等食品中的含量不得超過110-6mol/L。Groom等人將亞硫酸氧化酶固定于玻璃電極上，制成了測定亞硫酸鹽的生物傳

16、感器，其靈敏度（檢出下限）達到5nmol/L，線形范圍為0-5mmol/L，電極在3mol/L的硫酸鹽溶液中4oC保存2個月活性不變。天冬酰苯丙氨酸甲酯，又稱甜味素，是人工合成的低熱量甜味劑。Guilbault等將天冬氨酸酶固定于氨電極上，制成生物傳感器，其檢測線性范圍為。4.污染微生物的檢測1）腐敗菌的檢測Matssunage等人開發(fā)出一種基于微生物在代謝過程中能產(chǎn)生電子，電子直接在陽極上放電產(chǎn)生電流，通過測定電流大小從而測定微生物濃度的傳感器。用該傳感器能很好地檢測釀酒酵母和乳酸菌等微生物的數(shù)量2 病原菌的檢測常見的污染食品的病原菌有沙門氏菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、李斯特氏菌、產(chǎn)氣莢膜

17、梭菌和蠟樣芽孢桿菌等。采用生物傳感器則能迅速地測定它們的數(shù)量。用來測定病原菌的生物傳感器主要是光纖生物傳感器、免疫生物傳感器和DNA生物傳感器。發(fā)酵罐主機計算機 7.2 在發(fā)酵工業(yè)中的應(yīng)用-為發(fā)酵自動控制提供了新的基礎(chǔ)平臺1)、發(fā)酵中葡萄糖測定 過去用操作繁瑣時間長的還原糖方法只能近似地估計葡萄糖的變化。 現(xiàn)在提供了快速而準確的固定化酶的測定方法，發(fā)酵中可根據(jù)糖消耗確定微生物的生長速率，觀察是否染菌，隨時與產(chǎn)物的產(chǎn)生一起估算轉(zhuǎn)化率，確定補料效果和及時判斷發(fā)酵結(jié)束的時間。 發(fā)酵過程或設(shè)備異?，F(xiàn)象通過葡萄糖分析得到及時預(yù)報。 2)、谷氨酸發(fā)酵液的分析在谷氨酸發(fā)酵中，隨時跟蹤目標產(chǎn)物的產(chǎn)生。快速獲得

18、主控參數(shù)的變化信息，使時間縮短了幾十倍。在發(fā)酵前期及時知道產(chǎn)酸出現(xiàn)時間在發(fā)酵中期可根據(jù)谷氨酸產(chǎn)生速率，預(yù)知最終的產(chǎn)量，并獲得補氨是否均勻的信息在發(fā)酵后期，可根據(jù)谷氨酸產(chǎn)生速率變慢情況確定放罐時間和今后配料的調(diào)整在我國發(fā)酵工廠普及應(yīng)用的谷氨酸-葡萄糖雙功能分析儀工廠發(fā)酵車間化驗員正在分析樣品3、乳酸傳感器在發(fā)酵上的應(yīng)用 乳酸測定是生物傳感器出現(xiàn)后新增加的控制參數(shù)。實踐中發(fā)現(xiàn)它的控制是獲得發(fā)酵高產(chǎn)的關(guān)鍵。 乳酸是需氧發(fā)酵產(chǎn)物轉(zhuǎn)化過程中的中間產(chǎn)物，是過程控制的敏感參數(shù)，與生物素的加入量、補糖、活菌數(shù)、菌活力、空氣補給等控制直接相關(guān)。 發(fā)酵旺盛期，乳酸必然產(chǎn)生，適度的乳酸濃度是高產(chǎn)罐的重要指示。此時單純地通過通風是達不到乳酸下降的目的，反而引起能源的浪費及減產(chǎn)。發(fā)酵后期、放罐前應(yīng)控制乳酸下降，才能達到高產(chǎn)。乳酸傳感器的應(yīng)用現(xiàn)狀是體育上耐力項目科學訓練的常用設(shè)備已在抗疲勞保健食品檢測中普及應(yīng)用，許多省級衛(wèi)生防疫站成功地用這項新技術(shù)實現(xiàn)了在同一小實驗動物體內(nèi)多次采血檢測，簡化了