純生啤酒泡沫與蛋白酶A的關(guān)系研究課件

1、純生啤酒泡沫與蛋白酶A的關(guān)系研究顧國賢2004.7.12概述在我國純生啤酒越來越受到人們的重視和親睞，由于其獨特的風味，它必將成為今后啤酒消費的主流。純生啤酒在包裝前未經(jīng)過巴氏滅菌，由酵母分泌的少量蛋白酶活性存留下來，在啤酒儲存及貨架壽命中對泡持性蛋白進行降解，最終使純生啤酒的泡沫變差。 實驗已證實這其中起主要作用是蛋白酶A 。泡沫蛋白蛋白酶抑制劑蛋白酶A分解抑制保護一、啤酒泡沫蛋白質(zhì)的研究啤酒中蛋白類物質(zhì)含量約在300-800mgN/L之間，主要由大麥產(chǎn)生。 近年來通過特定的抗體實驗已經(jīng)知道泡持性蛋白屬于蛋白質(zhì)Z類，發(fā)現(xiàn)主要是分子量在10,000-100,000Da之間的蛋白質(zhì)參與了啤酒泡沫

2、的形成。 啤酒泡沫穩(wěn)定性啤酒泡沫穩(wěn)定性隨著蛋白質(zhì)分子量增加和疏水性的增強而增強。 啤酒的泡持性蛋白主要來自于麥芽，而麥芽中泡持性蛋白質(zhì)主要受大麥品種和產(chǎn)區(qū)國家影響。 其它因素如酒花-酸、非淀粉類多糖、金屬離子、CO2等因素都對泡沫有利，而脂肪和過高濃度的酒精將抑制泡沫穩(wěn)定性。添加酵母或酵母沉降上清液會對泡沫產(chǎn)生消極影響，這可能就是其中酵母蛋白酶作用的后果。表面張力對泡持性而言也是個重要因素，表面張力越低，泡持性越好17。 二、啤酒蛋白酶的研究麥芽 人為添加的蛋白酶 酵母PrAPrB羧肽酶Y1.蛋白酶主要來源液泡降解產(chǎn)物蛋白酶A 分泌因素缺乏高爾基體 泡持蛋白質(zhì)錯誤途徑 無活性的蛋白酶A前體 無

3、活性的蛋白酶A 自溶活性蛋白酶A 蛋白水解圖1 PrA的釋放機理示意圖122. PrA簡介PrA是一種酸性蛋白酶， PrA的氨基酸組成以天門冬氨酸為最多，最少的為蛋氨酸。以HCl-Hb為底物時，最適pH為3.0，最適溫度為37-45，分子量為43000道爾頓左右，等電點為4.34.4或更高的數(shù)值。3.PrA量與下列因素有很大關(guān)系原料酵母的自溶發(fā)酵工藝酵母菌株4.啤酒中PrA的活性 根據(jù)國內(nèi)外研究資料看來，測定啤酒中PrA活力難度最大，因為它的活力一般只有10-4-10-5TU（酪氨酸活力）左右。 熒光底物法 DFP法4.1 熒光底物法 啤酒樣品純生A純生B自釀清酒液熟啤APrA活力(u)10.

4、001041.5610412.31104ND原理：高熒光強度的基團MOCAc在水解前受到2,4-二硝基酚（Dnp）的抑制而幾乎沒有熒光強度，而在PrA斷開了兩個苯丙氨酸（Phe-Phe）鍵后，它的熒光強度在合適的激發(fā)波長下就會釋放出來，從而可以測出對應(yīng)的PrA活力。 表1 熒光底物法測定結(jié)果 4.2 DFP法原理：DFP是一種蛋白酶抑制劑，它能抑制除PrA外的幾種主要酵母蛋白酶，將DFP添加到反應(yīng)體系中可以專一的測出PrA活力。 啤酒樣品自釀生啤自釀發(fā)泡酒純生D純生EPrA活力(u)3.351041.16104ND4.02104表2 DFP法測定結(jié)果 4.3 熒光底物法與DFP法的比較對同一個

5、樣品，兩種方法測定的結(jié)果處于同一個數(shù)量級，有一定的差別。由于熒光底物是根據(jù)PrA作用位點氨基酸序列設(shè)計的，所以它有著非常強的底物專一性。而DFP法的血紅蛋白底物相比較而言專一性要小很多。熒光底物法適用于純生啤酒中微量PrA活力的測定。 測定方法熒光底物法DFP法某樣品測定結(jié)果（u）8.561042.781044.4 發(fā)酵過程中酵母PrA活力變化酵母PrA活力隨著發(fā)酵天數(shù)的增加不斷變大，最高值達到了33.310-5u 。過濾操作可以除去70%左右，但即便如此PrA的活力仍是不能接受的。 圖1 發(fā)酵過程中PrA活力曲線4.5 酵母死亡率和PrA的關(guān)系隨著酵母的死亡，PrA活力的水平不斷增高，這說明

6、酵母PrA是一種胞內(nèi)蛋白酶，隨著酵母的死亡，細胞壁的通透性增強，PrA分泌到細胞外，所以在實際生產(chǎn)過程中，應(yīng)考慮控制酵母自溶來降低酵母PrA的活力。而在酵母死亡率達到最大后，酵母PrA活力出現(xiàn)下降趨勢。 圖2 酵母死亡率和PrA關(guān)系曲線4.6 不同酵母菌株發(fā)酵后的PrA酶活力酵母菌株ABCD酵母平均死亡率（%）1.52.05.05.0PrA酶活力（U/mL）1.510-57.010-52.810-45.510-3pH*+0.15+0.4+0.5+0.9*pH：設(shè)定啤酒pH為pH 2，酵母泥經(jīng)離心機以4000r/min離心10min后離心液的pH 1，則pH = pH 1pH 2。 5 PrA性

7、質(zhì)的初步研究圖3 蛋白酶A最適反應(yīng)溫度 圖4 蛋白酶A最適反應(yīng)pH 圖5 蛋白酶A耐熱曲線圖 圖6 蛋白酶A耐酸堿曲線三、蛋白酶A抑制劑L的研究控制純生啤酒的PrA的含量的幾個著手點：選擇合適菌株 選擇合適的發(fā)酵和貯酒工藝 尋找PrA抑制劑要找出一種抑制劑，它加入純生啤酒中能夠有效地抑制PrA，又不會影響啤酒的其它品質(zhì)，同時也不會影響人對啤酒中營養(yǎng)蛋白質(zhì)的消化吸收。從農(nóng)作物（如大豆）中或從一些生物活性材料中提取的抑制劑是安全的，便于在啤酒中推廣應(yīng)用。 對PrA抑制劑的要求要找出一種抑制劑，它加入純生啤酒中 能夠有效地抑制PrA 不會影響啤酒的其它品質(zhì) 不會影響人對啤酒中營養(yǎng)蛋白質(zhì)的消化吸收。從

8、農(nóng)作物（如大豆）中或從一些生物活性材料中提取的抑制劑是安全的，便于在啤酒中推廣應(yīng)用。將抑制劑L分別稀釋至10倍、100倍、1000倍直接加入灌裝后的純生啤酒中，在室溫下放置3個月，每隔一定時間取樣測定泡持和濁度 。在稀釋倍數(shù)為100倍時的抑制效果較好。在純生啤酒3個月的貨架期中均有較好的抑制效果。 3.1 抑制劑L對純生啤酒泡沫穩(wěn)定性和非生物穩(wěn)定性的影響粗提抑制劑L 不同稀釋倍數(shù)測定空酒白樣 添加抑制劑效果/%時間泡持濁度泡持/S濁度/EBC/S/EBC1010010001010010001010010008.112220.188.262060.182162201870.180.180.176

9、2.587.59.161900.202061941560.180.180.185012.59.301900.212141941700.190.190.207512.510.171900.212131941700.220.220.2071.812.511.121370.201531761590.220.220.2018.845.925.9精制抑制劑L 不同稀釋倍數(shù)測定空酒白樣 添加抑制劑效果/%時間泡持濁度泡持/S濁度/EBC/S/EBC1010010001010010001010010008.112220.188.262060.181612101960.170.160.17259.161900

10、.201091931850.180.170.189.459.301900.201902091900.200.190.2059.410.171900.211951941700.210.230.2015.612.511.121370.201672001780.220.200.2135.374.148.23.2 抑制劑L的基本特性考察不同作用條件對凝膠層析富集抑制劑L的抑制效果的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)溫度的影響較小，而作用時間和酶抑比*的影響稍大，在溫度20、時間2h、酶抑比為24:1時，抑制率可達71%。 *酶抑比：單位為u/mg3.2.1 抑制劑L的溫度穩(wěn)定性在不同溫度下將層析后的抑制劑保溫30min，

11、結(jié)果如左圖。抑制劑在100處理30min后，抑制效果仍然能夠維持較好水平，此點不僅進一步驗證抑制劑不是酶（曾在不同pH下測定都無蛋白酶活力），而且說明抑制劑的熱穩(wěn)定性也相當高 。圖7 ACA44層析后抑制劑L的熱穩(wěn)定性 3.2.2 抑制劑L的pH穩(wěn)定性抑制劑L的pH穩(wěn)定范圍在3.0-7.0之間，啤酒的pH 環(huán)境在4左右，此時抑制劑相當穩(wěn)定，有利于其在啤酒中起后修飾作用。 圖8 ACA44層析后抑制劑L的pH穩(wěn)定性 3.2.3 抑制劑L的特異性蛋白酶種類抑制劑L的抑制活力* （u/ml）胃蛋白酶1.74蛋白酶A5.44胰蛋白酶0.72木瓜蛋白酶1.37中性蛋白酶0.17*抑制劑活力單位定義：在相同條件下，蛋白酶抑制劑所抑制的相應(yīng)的蛋白酶活力單位數(shù)即為此蛋白酶抑制劑的活力單位數(shù)。 進一步的動力學實驗結(jié)果顯示，抑制劑L對蛋白酶A主要為一種非競爭性抑制作用，它對蛋白酶A的抑制劑常數(shù)Ki=2.1610-6 mol/L。 兩步層析純化所得粗提抑制劑L與精提抑制劑L經(jīng)Agilent 1100液相色譜分析測定，發(fā)現(xiàn)：粗提抑