第六章+化學(xué)毒物的一般毒性作用課件

1、第六章 化學(xué)毒物的一般毒性作用7/25/20221目的要求掌握一般毒性作用的概念、試驗?zāi)康氖煜ひ话愣拘栽囼灧椒ㄒc熟悉蓄積毒作用的概念了解蓄積毒作用研究方法7/25/20222一般毒性作用（基礎(chǔ)毒性作用）外來化合物在一定劑量、一定接觸時間和接觸方式下對實驗動物產(chǎn)生綜合毒效應(yīng)稱為一般毒性作用（general toxicity) 或基礎(chǔ)毒性作用（basic toxicity) .7/25/20223 一般毒性作用分為急性毒性、亞慢性毒性和慢性毒性。 防治急慢性中毒； 安全性評價和危險度評定;制訂衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)；管理毒理學(xué)的決策7/25/20224一般毒性作用的類型一般毒性測試 了解毒性大小特征 了解污染

2、物理化特征 了解在體內(nèi)蓄積和耐受性 了解對機(jī)體毒作用靶點和指標(biāo) 確定閾值和閾下劑量 急性毒性試驗急性致死試驗急性非致死試驗 蓄積毒性試驗 亞急性毒性試驗亞慢性毒性試驗 慢性毒性試驗 （3個月）（36個月）（6個月至終身）7/25/202251 急性毒性作用(acute toxicity)一、急性毒性和急性毒性試驗的目的二、急性毒性試驗三、急性毒性分級7/25/20226一、急性毒性和急性毒性試驗的目的急性毒性(acute toxicity)是指機(jī)體(人或試驗動物)一次接觸或24小時內(nèi)多次接觸化學(xué)物后在短期(最長到14天)內(nèi)所發(fā)生的毒性效應(yīng)，包括一般行為、外觀改變、大體形態(tài)變化以及死亡效應(yīng)。最主

3、要觀察指標(biāo)是LD50。7/25/20227一、急性毒性和急性毒性試驗的目的目的測試和求出化學(xué)毒物對一種或幾種試驗動物的致死量(以LD50表示)以及其它的急性毒性參數(shù)，了解急性毒作用強(qiáng)度。7/25/20228目的并通過觀察動物中毒表現(xiàn)和死亡的情況，了解急性毒作用性質(zhì)、可能的靶器官和致死原因，提供化學(xué)毒物的急性中毒資料、初步評價對人體產(chǎn)生損害的危險性。探求化學(xué)毒物急性毒性的劑量反應(yīng)關(guān)系與中毒特征。為亞慢性、慢性毒性作用試驗的染毒劑量設(shè)計提供參考依據(jù)。研究化學(xué)毒物急性中毒的預(yù)防和急救治療措施。為毒理學(xué)機(jī)制研究提供線索 。 7/25/20229一、急性毒性和急性毒性試驗的目的急性毒性試驗常用的毒性參數(shù)

4、：LD50/LC50Zac （LD50/Limac） LD84/LD16(或LC84LC16) 劑量反應(yīng)曲線斜率 7/25/202210二、急性毒性試驗方法的要點(一)試驗動物原則：急性毒性試驗要求選擇對化學(xué)毒物的代謝和毒效應(yīng)表現(xiàn)與人的反應(yīng)盡可能一致的試驗動物。動物易于獲得品系純化價格較低和易于飼養(yǎng)等條件。 7/25/202211二、急性毒性試驗1試驗動物的種屬和品系最好用兩種種屬的動物嚙齒類:小鼠、大鼠、豚鼠或家兔非嚙齒類：狗或猴。急性皮膚毒性試驗可選用成年大鼠、豚鼠或家兔，優(yōu)先考慮白色家兔。而急性吸入毒性試驗和經(jīng)口急性毒性試驗則優(yōu)先考慮大鼠。7/25/202212二、急性毒性試驗試驗動物的

5、年齡和體重：急性試驗動物不宜過老或過幼，通常要求選擇剛成年動物進(jìn)行試驗，而且須是未曾交配和受孕的動物。例如：大鼠180240g、小鼠1825g、家兔22.5kg、豚鼠200250g、狗1015kg。同一批試驗動物體重變異范圍不應(yīng)超過該批動物平均體重的20。 7/25/202213二、急性毒性試驗3.試驗動物的性別： 雌雄各半； 如雌、雄動物毒效應(yīng)有明顯差異，應(yīng)分別并求出雌性和雄性動物的LD50值； 特殊的試驗研究可僅作單一性別的急性毒性試驗。 7/25/202214二、急性毒性試驗4.動物數(shù)量與隨機(jī)分組：實驗方法不同采用的動物的數(shù)量不同分組原則隨機(jī)化、均衡性的原則5.禁食：經(jīng)消化道染毒時，要求

6、試驗前對動物禁食大鼠、小鼠隔夜進(jìn)食；染毒后禁食4h大動物每日上午喂食前染毒染毒后繼續(xù)禁食24h，但在禁食時要保障飲水。6.實驗動物的預(yù)檢：選擇健康動物12周的檢疫期7/25/202215（二）受試物及處理 常用劑型為水溶液、混懸液、油溶液 水溶性受試物，胃腸道外染毒需用生理鹽水，保持與體內(nèi)滲透壓一致。 水不溶性受試物，溶于或懸浮于適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)溶劑中。 受試物一般應(yīng)臨用前新配 7/25/202216適宜容積染毒 經(jīng)口：20ml/kg(空腹動物)； 經(jīng)皮：2ml/kg； 靜脈：1ml/kg(5min以上)； 肌肉注射：0.5ml/kg(一個部位)； 眼睛：0.01ml/每眼； 直腸：0.5ml/kg

7、； 陰道：大鼠0.2ml，兔lml； 吸入：2mg/L； 鼻：猴或犬每鼻孔0.1ml。7/25/202217二、急性毒性試驗 （二）試驗動物的飼養(yǎng)環(huán)境恒定的溫度：223濕度：3070%照度：晝夜各半飼料合格、飲水合格、墊料合格7/25/202218二、急性毒性試驗（三）染毒途徑的選擇: 染毒途徑（exposure routes）的選擇需考慮：模擬人在生活和生產(chǎn)環(huán)境中實際接觸受試物的途徑和方式；有利于不同化學(xué)物之間急性毒性大小的比較；受試物的性質(zhì)和用途；各種受試物毒性評價程序的要求等。 最常用的染毒途徑為經(jīng)口、經(jīng)呼吸道、經(jīng)皮及注射途徑。 7/25/202219染毒途徑影響受試物急性毒性 靜脈注射

8、吸入肌肉注射腹腔注射皮下注射經(jīng)口皮內(nèi)注射經(jīng)皮。 同一受試物不同染毒途徑LD50的大小通常符合上述規(guī)律。7/25/202220二、急性毒性試驗經(jīng)口(胃腸道)接觸 : 灌胃:小鼠0.21.0ml/只或0.10.5ml/10g 大鼠一次灌胃體積不超過5ml/只 家兔不超過10ml/2kg 狗不超過50ml/10kg 與飼料或飲用水混合： 吞咽膠囊: 經(jīng)呼吸道接觸 : 靜式吸入 動式吸入 經(jīng)皮膚接觸 :注射途徑接觸: 7/25/202221二、急性毒性試驗（四）染毒劑量與分組: 1查閱文獻(xiàn)參考新化學(xué)物的理化性質(zhì)了解化學(xué)毒物的結(jié)構(gòu)式、分子量、常溫常壓下的狀態(tài)、熔點、沸點、密度、閃點、揮發(fā)度、蒸氣壓、水溶

9、性和脂溶性等理化特性，生產(chǎn)批號及純度，雜質(zhì)成分與含量等。確定使用哪一種計算方法求LD50，然后再設(shè)計劑量分組。LD50的計算方法常用寇氏法、概率單位法、霍恩氏法等。根據(jù)試驗所選的LD50計算方法確定劑量組數(shù)。一般設(shè)5-8個劑量組；霍恩氏法設(shè)4個劑量組。 找出與受試化學(xué)毒物結(jié)構(gòu)與理化性質(zhì)近似的化學(xué)物的毒性資料，并以文獻(xiàn)資料中相同的動物種系和相同接觸途徑所測得的LD50(LC50)值作為受試化學(xué)物的預(yù)期毒性中值。 7/25/202222二、急性毒性試驗（四）染毒劑量與分組:2預(yù)試驗 目的：1）得到死亡率在10%90%之間的致死劑量范圍 2）計算正式試驗的組距或公比7/25/2022231）等比劑量

10、設(shè)計（寇氏法）一般設(shè)57組，各組間采用一定的公比設(shè)計劑量公比r=4，則組距i=lg4=0.6例如待測化合物預(yù)期LD50為40mg/kg，以此為中間劑量組，以4為公比，或0.6組距向上、下個推兩個劑量組。7/25/202224某化合物的急性毒性預(yù)試驗劑量設(shè)計組別劑量對數(shù)值12.51.6021-0.6*2210.01.6021-0.6340.01.60214160.01.6021+0.65640.01.6021+0.6*27/25/2022252預(yù)試驗2）33 法取9只動物，分為3組，每組3 只，以3種不同劑量處理。組距一般r=10,如10mg/kg ,100mg/kg, 1000mg/kg結(jié)果分

11、析：（1）3組均無死亡，說明劑量偏低，劑量可上移增大；（2）3組全部死亡，說明劑量偏高，劑量可下移減??；（3）第一組未死，2、3組全部死亡劑量在12組間；而1、2組未死，第3組死亡，大致致死劑量在1001000mg/kg間7/25/2022262預(yù)試驗3）序貫法設(shè)計一系列等比劑量，將動物一只一只序貫進(jìn)行。特點：快速、簡便、節(jié)約動物7/25/202227正式試驗的劑量設(shè)計可根據(jù)以下公式計算出劑量組距： i=(lgLD90-lgLD10)(n-1) 或：i=(lgLD100-lgLD0)(n-1)式中i為組距(相鄰的兩個劑量組對數(shù)劑量之差)； n為設(shè)計的劑量組數(shù)。 r=lg-1(lgb-lga)/

12、(n-1)式中：b最高組劑量，a最低組劑量，n為設(shè)計的劑量組數(shù)，正式試驗分組：a,ar,ar2,ar3,ar47/25/202228LD50計算lgLD50=Xm-i(p-0.5)式中：Xm最高劑量對數(shù) i組距，或公比的對數(shù)值 p各組死亡率的總和LD50標(biāo)準(zhǔn)誤差SlgLD50SlgLD50=i pq/n式中：p各實驗組死亡率；q各實驗組存活率 i組距 n試驗動物組數(shù)LD5095% 可信限= lg-1(lgLD501.96 SlgLD50)7/25/202229例題：小鼠腹腔注射敵百蟲的急毒及LD50計算預(yù)試：致死率在0100% 的劑量范圍在300600mg/kg.r=5-1600/300=1.

13、2各組劑量：300，3001.2=360；3001.22=432；3001.23=518，3001.24=6227/25/202230試驗結(jié)果組別劑量只數(shù)死亡數(shù)（只）死亡率/p存活率/q130010001.023601020.20.834321050.50.545181070.70.3562210101.007/25/202231解：lgLD50=Xm-i (p-0.5)Xm=lg622=2.7933i=lg1.2=0.0792p=2.4lgLD50=2.7933-0.0792（2.4-0.5）=2.6433LD50=lg-12.6433=439.87mg/kgSlgLD50=i pq/n=0

14、.0792 =0.0197LD5095% 可信限=lg(6.64331.96 0.0197) =402.44480.73mg/kg7/25/202232霍恩氏法（horn) 特點：方法簡單，使用動物少，每組動物數(shù)相等，可用4只或5只。劑量1：2.15倍組距劑量系列劑量2 ：3.16倍組距劑量系列7/25/202233二、急性毒性試驗（五）試驗周期與毒效應(yīng)觀察1.中毒癥狀7/25/202234二、急性毒性試驗（五）試驗周期與毒效應(yīng)觀察: 2.體重在觀察試驗動物中毒癥狀的過程中，應(yīng)同時觀察體重的變化。體重可以反映動物中毒后的整體變化原因：若化學(xué)毒物刺激或損傷消化道可出現(xiàn)試驗動物飲食減少甚至拒食，表

15、現(xiàn)為體重減輕。若化學(xué)毒物引起腹瀉，將影響食物吸收和利用，體重也會減輕。如果化學(xué)毒物影響水的攝取或腎功能急性損傷，也可能在體重上反映出來。所以，對存活動物尤其是對低于LD50劑量組的存活動物應(yīng)在觀察期14天內(nèi)稱量其體重的變化以便了解受試物引起毒效應(yīng)的持續(xù)時間。 7/25/202235二、急性毒性試驗（五）試驗周期與毒效應(yīng)觀察:3.病理檢查及其他指標(biāo):對死亡的動物均應(yīng)及時進(jìn)行大體解剖和病理組織學(xué)檢查，肉眼觀察主要臟器的大體病理變化，如臟器大小、外觀、色澤的變化，有無充血、出血、水腫或其它改變，對有改變的臟器進(jìn)行取材做組織病理學(xué)檢查。對存活動物在觀察期結(jié)束時進(jìn)行大體病理檢查必要時做組織病理學(xué)檢查。根

16、據(jù)試驗需要可進(jìn)一步擴(kuò)大觀察項目如體溫、心電圖、腦電圖或進(jìn)行某些生化指標(biāo)測定等。7/25/202236二、急性毒性試驗（五）試驗周期與毒效應(yīng)觀察4.死亡和死亡時間重點觀察和記錄每只動物死亡的時間，特別是最早出現(xiàn)死亡的時間以及各個劑量組動物的死亡數(shù)。分析中毒死亡時間的規(guī)律具有一定意義，可為深入研究化學(xué)物的毒作用機(jī)制提供參考。 7/25/202237二、急性毒性試驗(六)經(jīng)典急性毒性試驗的局限性1.消耗的動物量大2.獲得的信息有限3.測得的LD50僅僅是一個近似值4.在安全性評價中僅評價動物死亡和簡單的癥狀觀察是不夠的，更需要的是生理學(xué)、血液學(xué)及其它化驗檢查所提供的深入細(xì)致的毒性信息。7/25/20

17、2238三、急性毒性評價外源化學(xué)物急性毒性分級（WHO）毒性分級大鼠一次經(jīng)口LD50 (mg/kg)6只大鼠吸入4小時，死亡24只的濃度(ppm)兔經(jīng)皮LD50(/mg/kg)對人可能致死的估計量g/kg總量(g/60kg)劇毒11051510007/25/202239三、急性毒性評價我國食品毒理急性毒性分級法(1994)急性毒性分級大鼠經(jīng)口LD50(mg/kg)大致相當(dāng)于70kg人的致死量6級(極毒)1稍嘗,150001050克7/25/202240一、基本概念二、 蓄積毒性試驗方法及其評價 第二節(jié) 蓄積毒性7/25/202241 化學(xué)毒物進(jìn)入機(jī)體后，經(jīng)過生物轉(zhuǎn)化以代謝產(chǎn)物或化學(xué)物原型排出體

18、外。但是，當(dāng)化學(xué)毒物反復(fù)多次給動物染毒，化學(xué)毒物進(jìn)入機(jī)體的速度(或總量)超過代謝轉(zhuǎn)化的速度和排泄的速度(或總量)時，化學(xué)毒物或其代謝產(chǎn)物就有可能在機(jī)體內(nèi)逐漸增加并貯留，這種現(xiàn)象稱為化學(xué)毒物的蓄積作用(accumulation)。 一、基本概念7/25/202242蓄積作用物質(zhì)蓄積（material accumulation）反復(fù)多次接觸化學(xué)毒，可以用分析方法測出體內(nèi)物質(zhì)的原型或其代謝產(chǎn)物。功能蓄積（functional accumulation）長期接觸某些化學(xué)毒物后，機(jī)體內(nèi)雖不能測出其原型或代謝產(chǎn)物，卻出現(xiàn)了慢性毒性作用。 7/25/202243二、蓄積毒性試驗方法及其評價化學(xué)毒物的蓄積作用

19、是發(fā)生慢性中毒的物質(zhì)基礎(chǔ)，因此研究化學(xué)毒物在機(jī)體內(nèi)的蓄積性是評價化學(xué)毒物能否引起潛在慢性毒性的依據(jù)之一，也是衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)制訂過程選擇安全系數(shù)的主要依據(jù)。蓄積毒性試驗是研究化學(xué)毒物基礎(chǔ)毒性的重要內(nèi)容之一，目的是通過試驗求出蓄積系數(shù)K，了解化學(xué)毒物蓄積毒性的強(qiáng)弱，并為慢性毒性試驗及其他有關(guān)毒性試驗的劑量選擇提供參考。7/25/202244蓄積作用的研究方法（一）蓄積系數(shù)法以生物效應(yīng)為指標(biāo)，用經(jīng)驗系數(shù)（K）評價蓄積作用的方法，即將多次染毒與一次染毒所產(chǎn)生的毒性效應(yīng)進(jìn)行比較。簡便，但不能區(qū)分化學(xué)毒物的蓄積性是物質(zhì)蓄積還是功能蓄積。7/25/202245(一)蓄積系數(shù)法 蓄積系數(shù)(accumulation

20、coefficient)是多次染毒使半數(shù)動物出現(xiàn)效應(yīng)(或死亡)的累積劑量ED50(n)與一次染毒使半數(shù)動物出現(xiàn)相同效應(yīng)(或死亡)的劑量ED50(1)的比值，即： KED50(n)/ED50(1) KLD50(n)/LD50(1) 蓄積作用的研究方法反復(fù)染毒時實驗動物對化學(xué)毒物發(fā)生過敏現(xiàn)象，可能出現(xiàn)K5。固定劑量法試驗期為25-100天。 7/25/202248 2劑量遞增法： 在試驗期間，當(dāng)化學(xué)毒物引起動物累積死亡一半時即可終止試驗，計算K值進(jìn)行評價。一般來說，在試驗第2l天也可結(jié)束試驗，因為這之前如果動物沒有死亡或死亡數(shù)不足一半，說明其累積劑量已達(dá)5.26LD50，即K5。使用本方法時要注意

21、染毒期間定期(每4天一次)給動物稱重，按實測體重，調(diào)整化學(xué)毒物的染毒絕對量。二、蓄積毒性試驗方法及其評價7/25/2022493劑量固定的20天蓄積法： 它通常采用經(jīng)口灌胃染毒方式，將動物隨機(jī)分為5個組，包括陰性對照組和1/20 LD50、l/10 LD50、1/5 LD50和1/2 LD50四個劑量組，每組動物數(shù)10只，雌雄各半。每日染毒一次，連續(xù)染毒20天。觀察每組雌雄合計的死亡動物數(shù)量。 評定標(biāo)準(zhǔn)：各劑量組均無死亡，即為蓄積性不明顯； 如僅1/2LD50劑量組有死亡，其他組均無死亡，則為弱蓄積性； 如1/20LD50劑量組無死亡，其他各組間死亡數(shù)有劑量反應(yīng)關(guān)系時，則為中等蓄積性； 如1/

22、20LD50劑量組有死亡，且有劑量反應(yīng)關(guān)系，則為強(qiáng)蓄積性。 蓄積作用及其評價二、蓄積毒性試驗方法及其評價7/25/202250一 亞慢性毒性作用： 亞慢性毒性的概念 亞慢性毒性試驗的目的 亞慢性毒性試驗的設(shè)計 二 慢性毒性作用： 慢性毒性的概念 慢性毒性試驗的目的 慢性毒性試驗設(shè)計 第三節(jié) 亞慢性和慢性毒性試驗7/25/202251(一) 概念： 亞慢性毒性(subchronic toxicity)是指人 或?qū)嶒瀯游镞B續(xù)接觸較長時間、較大劑量的外源化合物所引起的毒性效應(yīng)。慢性毒性(chronic toxicity)是指人或?qū)嶒瀯游镩L期(甚至終生)反復(fù)接觸低劑量的化學(xué)毒物所產(chǎn)生的毒性效應(yīng)。一、亞

23、慢性和慢性毒性試驗的概念、目的7/25/202252亞慢性毒性實驗?zāi)康?. 觀察受試物以不同劑量水平較長期喂養(yǎng)，對動物的毒性作用性質(zhì)和靶器官，并初步確定最大無作用劑量和最小有作用劑量。 2. 分析受試物的劑量效應(yīng)關(guān)系。3. 為慢性毒性試驗的劑量設(shè)計和觀察指標(biāo)提供依據(jù)。4. 為評價受試物能否應(yīng)用提供依據(jù)。7/25/202253慢性毒性試驗?zāi)康?.確定造成損害作用的最低劑量（LOAEL)和未觀察到損害作用的最大劑量（NOLAE)，對最終評價受試物能否應(yīng)用提供依據(jù)。2.進(jìn)一步研究慢性毒作用的特點、毒作用的靶器官及毒理機(jī)制，為外推到人的安全系數(shù)選擇提供參考。ADI值是根據(jù)對小動物（大鼠、小鼠等）近乎一

24、生的長期毒性試驗中所求得的最大無作用量（MNL）,取其1/100-1/500作為ADI值。 7/25/202254二、亞慢性和慢性毒性試驗設(shè)計 （一）實驗動物選擇 亞慢性毒性試驗 年齡：大鼠80100g 狗 812月 小鼠1015g數(shù)量：小動物20 大動物6性別：雌雄各半 慢性毒性試驗?zāi)挲g：大鼠 5070g 狗 8月 小鼠 初斷乳數(shù)量：小動物40 大動物8性別：雌雄各半7/25/202255（二）實驗動物染毒期限：工業(yè)毒理學(xué) 36個月食品毒理學(xué) 6個月1年環(huán)境毒理學(xué) 6個月1年致癌試驗 接近或等于動物的預(yù)期壽命二、亞慢性和慢性毒性試驗設(shè)計7/25/202256二、亞慢性和慢性毒性試驗設(shè)計（二）實驗動物染毒期限7/25/202257 經(jīng)消化道經(jīng)呼吸道經(jīng)皮膚二、亞慢性和慢性毒性試驗設(shè)計（三）實驗動物染毒方式7/25/202258亞慢性毒性的劑量選擇陰性對照組低劑量組中劑量組高劑量組 急性毒性的閾劑量 1/201/5 LD50組距：310倍，最低不小于2倍慢性毒性的劑量選擇陰性對照組低劑量組中劑量組高劑量組 亞慢性閾劑量或其1/51/2 1/10 LD50組距：25倍，最低不小于2倍二、亞慢性和慢性毒性試驗設(shè)計（四）試驗分組和劑量設(shè)計7/25/202259亞慢性毒性的劑量選擇的目的陰性對照組低劑量組: