液相色譜基礎(chǔ)知識(shí)課件

1、液相色譜基礎(chǔ)知識(shí)一、色譜起源石油醚碳酸鈣顆粒色素色譜組分HPLC的分離類型正相色譜 (NP-HPLC)反相色譜 (RP-HPLC)反相離子對(duì)色譜 (RPIC)離子交換色譜 (IEC)空間排阻色譜 (SEC)手性化合物分離模式(Chiral separation mode)液相色譜按兩相極性不同分為:正相色譜反相色譜 化合物保留時(shí)間隨流動(dòng)相配比的變化 不同極性的化合物出峰順序正相HPLC色譜柱 硅膠型 氰基型 氨基型 糖類分析 二醇基型 蛋白質(zhì)分析Silica gelSiSi-Si-CH2CH2CH2CN-Si-CH2CH2CH2NH2-Si-CH2CH2CH2OCH(OH)-CH2(OH)Mo

2、dified Si反 相 HPLC 色 譜 柱C18 (ODS) type C8 (octyl) typeC4 (butyl) typePhenyl type TMS typeCyano type-Si-C18H37SiNon-polar property 色譜柱:非極性溶劑: 極性水 / 甲醇 / 乙腈反 相 色 譜保留時(shí)間和疏水性O(shè)HOHC18 (ODS) StrongWeak固 定 相 作 用C18 (ODS) StrongC8samplesamplesampleC4MediumWeak液相色譜流程圖輸液泵進(jìn)樣器色譜柱柱溫箱檢測(cè)器溶劑數(shù)據(jù)處理流動(dòng)相流動(dòng)相選擇注意事項(xiàng)：純度：采用“ HPL

3、C ”級(jí)溶劑避免使用會(huì)引起柱效損失或保留特性變化的溶劑對(duì)試樣有適宜的溶解度溶劑粘度要小與檢測(cè)器相匹配流動(dòng)相配制時(shí)的順序溶 劑 等 級(jí)水的等級(jí)純化水蒸餾水去離子水波長 (nm)純化水去離子水因?yàn)椴患兾锏拇嬖?，去離子的吸光率較高純化水中去除了無機(jī)和有機(jī)的污染物吸光率水 / MeOH梯度ODS 柱鬼峰Gradient Curve1 ml/min, 0-100% MeOHover 10 mins and hold for15 mins.溶 劑 等 級(jí)鬼峰的出現(xiàn)溶 劑 等 級(jí)溶劑的等級(jí)HPLC級(jí)優(yōu)級(jí)純分析純都經(jīng)過蒸餾和0.45u的過濾(除纖維毛,未溶解的機(jī)械顆粒優(yōu)級(jí)純的純度比分析純大,但里面含有防腐劑和

4、抗氧化劑HPLC級(jí)經(jīng)過0.2u的過濾,且除去有紫外吸收的雜質(zhì)微量分析、梯度洗脫甲醇 乙睛 正己烷分析純級(jí)和 HPLC 級(jí)溶劑的吸光度比較圖溶 劑 等 級(jí)溶劑前處理 過濾：0.45um或更小孔徑濾膜 目的：除去溶劑中的微小顆粒，避免堵塞色譜柱，尤其是使用無機(jī)鹽配制的緩沖液。過濾膜種類 水系過濾膜 有機(jī)系過濾膜溶劑前處理 脫氣 目的：除去流動(dòng)相中溶解或因混合而產(chǎn)生的氣泡 一般混合溶劑中能容納的空氣量往往要比單個(gè)溶劑所能容納的空氣總量要小 氣泡對(duì)測(cè)定的影響： 1）柱壓波動(dòng)，流量偏小 2）基線波動(dòng) 返回流路中形成氣泡引起的問題改變保留時(shí)間和峰面積流動(dòng)相中形成氣泡對(duì)液流的不良影響泵中形成氣泡使液流波動(dòng)峰

5、變形柱中氣泡形成和累積使流動(dòng)相繞流尖峰或鋸齒狀噪聲檢測(cè)池中氣泡形成和累積產(chǎn)生基線噪聲輸液泵輸液泵控制方式： 恒流控制 恒壓控制輸液泵類型： 注射泵 柱塞往復(fù)泵 隔膜泵柱塞往復(fù)泵單向閥馬達(dá)和凸輪柱塞桿柱塞桿密封圈泵頭10 -100uL柱塞往復(fù)泵優(yōu)點(diǎn)壓力脈動(dòng)小易于更換溶劑缺點(diǎn)需要更換柱塞桿密封圈等度洗脫輸液泵進(jìn)樣器色譜柱柱溫箱檢測(cè)器單一或混合溶劑梯度洗脫 A 泵進(jìn)樣器色譜柱柱溫箱檢測(cè)器 B泵AB時(shí)間B 濃度分析時(shí)間長分離度差 MeOH / H2O = 6 / 4MeOH / H2O = 8 / 2( column : ODS type )等度洗脫95%30%MeOH 濃度梯度洗脫梯度洗脫：優(yōu)點(diǎn)：可

6、提高分離度、縮短分離時(shí)間、降低最小檢測(cè)量和提高分離精度注意事項(xiàng)：溶劑的純度要高，否則梯度洗脫的重現(xiàn)性差梯度混合的溶劑互溶性要好梯度洗脫應(yīng)使用對(duì)流動(dòng)相組成變化不敏感的選擇性檢測(cè)器（如紫外吸收檢測(cè)器或熒光檢測(cè)器），而不能使用對(duì)流動(dòng)相組成變化敏感的通用型檢測(cè)器（如示差折光檢測(cè)器）混合器低壓梯度比例閥 高壓梯度低壓梯度脫氣機(jī)高壓/低壓梯度系統(tǒng)返回高壓梯度系統(tǒng)梯度準(zhǔn)確度好系統(tǒng)復(fù)雜 (需兩臺(tái)或三臺(tái)泵)低壓梯度系統(tǒng)系統(tǒng)簡單需在線脫氣機(jī)存在時(shí)間滯后效應(yīng)高壓/低壓梯度系統(tǒng)進(jìn)樣器自動(dòng)進(jìn)樣器手動(dòng)進(jìn)樣器 原理：（六通閥） 注入方式： 1）全量注入 2）部分注入返回手動(dòng)進(jìn)樣器的原理圖 裝填狀態(tài)進(jìn)樣狀態(tài)返回進(jìn)樣體積 檢測(cè)

7、器響應(yīng)值定量管體積的一半3倍定量管體積全量注入部分注入進(jìn)樣體積與響應(yīng)值關(guān)系返回柱溫箱分析結(jié)果重現(xiàn)性好提高柱效降低柱壓保證檢測(cè)穩(wěn)定性 柱溫控制的優(yōu)點(diǎn)：色譜柱1）柱壓低于150kgf/cm2（15cm色譜柱）2）柱溫在40左右，最高使用溫度為503）流動(dòng)相PH使用范圍為27.5返回ODS柱的使用注意點(diǎn)：流動(dòng)相注意點(diǎn)離子對(duì)試劑的使用具有緩沖鹽流動(dòng)相的使用 分析結(jié)束及開始流動(dòng)相平衡 加快平衡時(shí)間異丙醇的使用LC檢測(cè)器紫外可見檢測(cè)器（UV/VIS）二極管陣列檢測(cè)器（PDA）示差檢測(cè)器（RID）電導(dǎo)檢測(cè)器（CDD）熒光檢測(cè)器（RF）電化學(xué)檢測(cè)器（L-ECD）質(zhì)譜檢測(cè)器（MS）蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（ELSD）

8、紫外可見檢測(cè)器原理：基于被分析組分對(duì)特定波長紫外光的選擇性吸收定量基礎(chǔ)：Lambert-Beer定律，AKCL優(yōu)點(diǎn)：1）對(duì)溫度和流速變化不敏感 2）可用于梯度分析缺點(diǎn)：僅適用于測(cè)定有紫外吸收的物質(zhì)紫外可見檢測(cè)器樣品池參比池光電管光電管EinEinEin光柵D2 / W 燈lEout紫外可見檢測(cè)器島津VP系列紫外檢測(cè)器功能1）設(shè)定時(shí)間程序（波長切換等）2）雙波長檢測(cè)3）比例色譜，初步判斷峰的純度4）停泵掃描，確定組分最大吸收波長NEXT波長切換返回雙波長檢測(cè)返回比例色譜280nm220 nmratio280/220返回波長掃描返回二極管陣列檢測(cè)器（SPDM10AVP）二十一世紀(jì)標(biāo)準(zhǔn)紫外檢測(cè)器色譜

9、信息： 保留時(shí)間 常規(guī)紫外檢測(cè)器 紫外光譜 二極管陣列檢測(cè)器樣品池二極管陣列（512個(gè)單元）光柵D2 / W燈每一單元可檢測(cè)一個(gè)波長下的吸光度二極管陣列檢測(cè)器三維譜圖時(shí)間波長吸光度色譜光譜二極管陣列檢測(cè)器的優(yōu)點(diǎn)1）采集三維譜圖2）峰純度檢驗(yàn)3）光譜庫檢索NEXT峰純度檢驗(yàn)（3點(diǎn)光譜圖比較）Initial detection pointFinal detection pointT1T3T2peak topup slopedown slope1/21/3乙酰水楊酸下降點(diǎn)上升點(diǎn), 頂點(diǎn)峰純度檢驗(yàn)（3點(diǎn)光譜圖比較）返回光譜庫檢索返回檢測(cè)器原理：連續(xù)測(cè)定流通池中溶液折射率變化以測(cè)定 試樣各組分濃度。優(yōu)點(diǎn)：通用型檢測(cè)器缺點(diǎn)：1）對(duì)溫度和壓力變化敏感 2）不能用于梯度分析示差折光檢測(cè)器返回糖的色譜圖Analytical ConditionsColumn : Shim-pack CLC-NH2Mobile phase : Acetonitrile / water = 7 / 3Flow rate : 1.0 mL/minTemperature