工學第3章動植物細胞培養(yǎng)課件

1、生物制藥基礎(chǔ)化學化工學院陶洪文1第三章 動植物細胞培養(yǎng)制藥技術(shù)2第一節(jié) 動物細胞培養(yǎng)制藥技術(shù)概述動物細胞培養(yǎng)的特性動物細胞培養(yǎng)基的組成和制備細胞培養(yǎng)過程的檢測動物細胞培養(yǎng)方法和操作方式動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用3一. 概 述 20世紀初，人們不知道神經(jīng)纖維是由神經(jīng)細胞的細胞質(zhì)外突形成，還是由神經(jīng)細胞周圍的其他細胞融合而成。 1907年，美國生物學家哈里森(Harrison)從蝌蚪的脊索中分離出神經(jīng)組織，把它放在青蛙的凝固的淋巴液中培養(yǎng)。蝌蚪的神經(jīng)組織存活了好幾周，并且從神經(jīng)細胞中長出了神經(jīng)纖維。 哈里森的實驗解決了神經(jīng)纖維的起源問題，開創(chuàng)了動物組織培養(yǎng)的先河。此后，動物組織培養(yǎng)不斷改進并逐漸

2、發(fā)展成為動物細胞培養(yǎng)。1. 動物細胞培養(yǎng)的起源4動物細胞培養(yǎng) 就是從動物有機體中取出相關(guān)的組織，將它分散成單個細胞，然后，放在適宜的培養(yǎng)基中，讓這些細胞生長和增殖.用培養(yǎng)的人細胞構(gòu)建人造皮膚5動物胚胎或幼齡動物的組織、器官胰蛋白酶剪碎單個細胞培養(yǎng)液制成細胞懸浮液10代細胞部分細胞“癌變”，無限傳代動物細胞培養(yǎng)不能最終培養(yǎng)成動物體50代細胞原代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)細胞貼壁剝離、分瓶細胞株細胞細胞系2.動物細胞培養(yǎng)過程：接觸抑制遺傳物質(zhì)未改變遺傳物質(zhì)改變6動物細胞培養(yǎng)工藝流程7有關(guān)概念:原代培養(yǎng)： 從機體取出后立即培養(yǎng)的細胞為原代細胞。培養(yǎng)的第1代細胞與傳10代以內(nèi)的細胞稱為原代細胞培養(yǎng)。傳代培養(yǎng)：將原代

3、細胞從培養(yǎng)瓶中取出，配制成細胞懸浮液，分裝到兩個或兩個以上的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，稱為傳代培養(yǎng)。8細胞株：原代細胞一般傳至10代左右細胞生長停滯，大部分細胞衰老死亡，少數(shù)細胞存活到4050代，這種傳代細胞為細胞株。 細胞系：細胞株傳代至50代后又出現(xiàn)細胞生長停滯狀態(tài)，只有部分細胞由于遺傳物質(zhì)的改變，使其在培養(yǎng)條件下可以無限制傳代，這種傳代細胞為細胞系。 細胞株和細胞系的區(qū)別： 細胞系的遺傳物質(zhì)改變，具有癌細胞的特點，失去接觸抑制，容易傳代培養(yǎng)。9細胞貼壁：細胞懸液中的分散細胞貼附到培養(yǎng)瓶壁上。 要求培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿的內(nèi)表面光滑、無毒、易于貼附。 接觸抑制：當貼壁細胞分裂生長到表面相互接觸時，細胞會停

4、止運動，但不影響細胞分裂增殖。 密度抑制：細胞長滿培養(yǎng)平板，達到一定密度后，細胞會停止分裂增殖。10動物細胞鏡檢形態(tài)高密度低密度懸浮型細胞11整體放大貼壁型細胞12二、動物細胞培養(yǎng)特性1.分裂期長12-48小時，細胞生長緩慢，易受微生物污染。2.細胞大，無細胞壁，機械強度低，環(huán)境影響大 動物細胞對周圍環(huán)境十分敏感,滲透壓、酸度、離子濃度、剪切力、微量元素等的變化都會影響其生長。動物細胞對培養(yǎng)基要求很高，需要 12種必需氨基酸、8種以上維生素、多種無機鹽和微量元素、葡萄糖外，還需要多種細胞生長因子和貼壁因子.133. 培養(yǎng)需氧少，不耐強力通風和攪拌正常二倍體細胞的壽命是有限的，一般繁殖50代左右

5、，就逐漸死亡。4. 培養(yǎng)時有群體效應(yīng)、錨地依賴性、接觸抑制性和功能全能性5. 產(chǎn)物在胞外，成本高，但價格昂貴6. 與微生物有區(qū)別，培養(yǎng)時不可套用經(jīng)驗7. 原代培養(yǎng)一般50代及退化死亡14三、動物細胞培養(yǎng)基的組成與制備1)所有的與細胞接觸的設(shè)備、器材和溶液都必須保持絕對無菌，避免污染； 2)必須有足夠的營養(yǎng)保證，絕對不可有有害的物質(zhì)，避免有害離子；3)保證有適量的氧氣供應(yīng)； 4)需隨時清除細胞代謝中的有害產(chǎn)物； 5)有適于生存的外界環(huán)境，滲透壓、離子濃度和酸度； 6)及時分種，保持合適的細胞密度。 1.動物細胞在體外培養(yǎng)所需條件 152.動物培養(yǎng)基的種類和組成 1）天然培養(yǎng)基：血漿凝塊、血清、淋

6、巴液、胚胎浸液、羊水、腹水。 2）合成培養(yǎng)基：組成穩(wěn)定可大量生產(chǎn)供應(yīng)。成分為氨基酸（細胞合成蛋白質(zhì)的原料）、維生素（維持細胞生命活動的低分子活性物質(zhì)，形成酶的輔基或輔酶）、糖類（碳源）、無機鹽（保持細胞的滲透壓并參與代謝）、緩沖系統(tǒng)、礦物類、有機補充物、激素類、生長因子類。合成培養(yǎng)基中除了各種營養(yǎng)成分外，還需添加 5%-10%的小牛血清，才能使細胞很好地增殖.16添加小牛血清的作用：1、提供有利于細胞生長增殖所需的各種生長因子和激素；2、提供有利于細胞貼壁所需的貼附因子和伸展因子；3、提供可識別金屬、激素、維生素和脂類的結(jié)合蛋白；4、提供細胞生長所必需的脂肪酸和微量元素。 17 3、無血清培養(yǎng)

7、基 無血清培養(yǎng)基在天然或合成培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加激素、生長因子、結(jié)合蛋白、貼附和伸展因子及其他元素。優(yōu)點：增加確定性；性能更一致；供應(yīng)充足、穩(wěn)定；容易進行純化和下游加工提高制品安全性和產(chǎn)量。18培養(yǎng)基的性質(zhì)1.pH：哺乳類動物細胞生長需要合適的酸堿度，多為7.27.4,不超過6.87.6范圍，同時pH值的測定也可以檢查培養(yǎng)基的批間差異 2.滲透壓：細胞必須生活在合適的滲透壓環(huán)境中（690850kPa）；同時滲透壓值的測定也可以檢查培養(yǎng)基的批間差異3.溫度：哺乳動物多為36.5 0.5 4.黏度：CMC和聚乙烯吡咯烷酮5.表面張力和泡沫19四、細胞培養(yǎng)過程的檢測 （一）細胞生長的檢測 細胞計數(shù)（血

8、小板計數(shù)器） 細胞常規(guī)檢查（污染與否、pH） 生長情況、細胞形態(tài)、營養(yǎng)液、污染和細胞活性（死細胞著色 計數(shù)） 生物學檢查和鑒定 支原體污染檢查 20 細胞生長過程 每代貼附生長細胞的生長過程：游離期、貼壁期、潛伏期、對數(shù)生和長期停止期（平臺期）。（1）游離期：細胞接種后在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)也稱懸浮期。此時細胞質(zhì)回縮，胞體呈圓球形。10分鐘-4小時。（2）貼壁期：細胞附著于底物上，游離期 結(jié)束。細胞株平均在10分鐘-4小時貼壁。 底物：膠原、玻璃、塑料、其它細胞等. 血清中有促使細胞貼壁的和纖粘素、膠原等糖蛋白，這些糖蛋白的促貼壁因子先吸附于底物上，懸浮細胞再與吸附有促貼壁因子的附著。21（3）

9、潛伏期：此時細胞有生長話動，而無細胞分裂。細胞株潛伏期一般為624小時。（4）對數(shù)生長期： 細胞數(shù)隨時間變化成倍增長，活力最佳，最適合進行實驗研究。（5）停止期（平臺期）：細胞長滿瓶壁后，細胞雖有活力但不再分裂。22培養(yǎng)物污染的預防細菌、真菌、病毒或細胞均可導致培養(yǎng)物污染。生物的組織材料、操作者自身、培養(yǎng)基、各種器皿、甚至環(huán)境均可引起污染。顯著污染的標志是培養(yǎng)基PH值迅速改變、外形模糊、甚至出觀漂浮的集落。常用抗生素：青霉素（200單位/mL）；卡那霉素（200ug/mL）。支原體污染的控制：抗生素處理；支原體血清處理；高熱處理23防止交叉污染。從事體外細胞培養(yǎng)的工作者都必須遵循這樣一個原則：

10、在任何時間，在一個工作區(qū)中決不能有一種以上的細胞系的細胞同時存在。一種細胞系的細胞所用的培養(yǎng)基、器皿、移液管等決不能為另一種細胞系的細胞所移用。一旦在同質(zhì)的細胞群中出現(xiàn)不同形態(tài)的集落，則應(yīng)懷疑是否發(fā)生了細胞污染，且用染色體組型及同功酶組型鑒定。24（二）細胞培養(yǎng)工藝控制1.溫度控制：采用鉛電阻溫度計控制2.pH與溶解氧控制：碳酸氫鹽緩沖溶液，另外可以通過通CO2,O2控制。3.葡萄糖和乳酸檢測4.產(chǎn)物的收集和檢測25五、動物細胞培養(yǎng)方法和操作方式根據(jù)不同的需要將離體培養(yǎng)的細胞分為三類：1、貼壁細胞 生長時必須要有給以貼附的支持物表面，細胞依靠自身分泌的或培養(yǎng)基中提供的貼附因子才能在該表面上生長

11、和繁殖，在培養(yǎng)過程中，隨著培養(yǎng)條件的變化細胞形態(tài)也會發(fā)生改變。 262、懸浮細胞 生長不依賴支持物表面，在培養(yǎng)液中懸浮生長，如淋巴細胞等。 3、兼性貼壁細胞 根據(jù)生長條件的不同可貼壁也可懸浮生長，中國地鼠卵巢細胞。 271.細胞培養(yǎng)方法1)懸浮培養(yǎng) 優(yōu)點：操作簡單、培養(yǎng)條件均一、傳質(zhì)和傳氧比較好，容易擴大培養(yǎng)規(guī)模，可借鑒細菌發(fā)酵的經(jīng)驗。缺點：體積小，較難采用灌流培養(yǎng)。常用反應(yīng)器為攪拌和氣升式2)貼壁培養(yǎng) 優(yōu)點：適用的細胞種類多，較容易采用灌流培養(yǎng)，達到高密度細胞。缺點：操作比較復雜，需要合適的貼附材料和足夠的面積，培養(yǎng)條件不易均一，傳質(zhì)和傳氧較差。 283)固定化培養(yǎng)（1）吸附培養(yǎng) 細胞貼附于

12、支持物表面 （2）共價貼附 化學鍵結(jié)合（3）離子/共價交聯(lián)（4）包埋和微囊培養(yǎng)，包埋或包裹在凝膠載體和微囊內(nèi)的細胞可獲得保護，避免了剪切力的損害；可以獲得較高的細胞密度；通過控制微囊膜的孔徑可使產(chǎn)品濃縮在微囊內(nèi)有利于下游處理；可采用多種生物反應(yīng)器進行大規(guī)模培養(yǎng) 292.細胞培養(yǎng)的操作方式1）分批式培養(yǎng)操作2）流加式培養(yǎng)操作3）半連續(xù)式培養(yǎng)操作4）連續(xù)式培養(yǎng)操作5）灌注式培養(yǎng)操作30六、動物細胞培養(yǎng)的應(yīng)用1.用于生物制品的生產(chǎn)：如病毒疫苗、干擾素、單克隆抗體2.基因工程中受體細胞的培養(yǎng)：選用合適宿主、改變細胞的某些酶基因、改進控制培養(yǎng)條件使產(chǎn)物正確糖基化。3.組織工程研究:通過對細胞大量培養(yǎng)，并

13、用細胞直接作為一種治療手段用于臨床，或用細胞進一步加工構(gòu)成一種組織，如皮膚、肝臟、胰腺等用于臨床治療。31第二節(jié) 植物細胞培養(yǎng)制藥技術(shù) 植物細胞培養(yǎng)：指在離體條件下，將愈傷組織或其他易分散的的組織置于液體培養(yǎng)基中，進行振蕩培養(yǎng)，得到分散成游離的懸浮細胞，通過傳代培養(yǎng)使細胞增殖，從而獲得大量的細胞群體的一種技術(shù)。一、概述32植物細胞培養(yǎng)流程 33二 、植物細胞培養(yǎng)的特性與營養(yǎng) （一）植物細胞的特性 1.植物細胞的組成 植物細胞由細胞壁和原生質(zhì)體組成，原生質(zhì)體包括 細胞質(zhì)、細胞核和液泡。 2.細胞后含物和生理活性物質(zhì) 細胞中除含有生命物質(zhì)原生質(zhì)體外，還有許多非生命物質(zhì)，細胞的代謝產(chǎn)物，一類是后含物

14、，儲藏物質(zhì)，分布于液泡內(nèi)，生物堿、糖類、苷、鹽類、有機酸、揮發(fā)油等，另一類是生理活性物質(zhì)，對細胞內(nèi)生化代謝和生理活動起著調(diào)節(jié)作用。 34 3.細胞的全能性: 即單一的離體細胞在一定的環(huán)境條件下能分化成不同細胞組織乃至整個植株的能力。 4.細胞分化：是指導致細胞形成不同結(jié)構(gòu)，引起功能改變或潛在發(fā)育方式改變的過程。細胞分化也可以說是相同基因型的細胞所具有的各個不同的表現(xiàn)型。 它包括：時間上的分化：一個細胞在不同的發(fā)育階段上可以有不同的形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能；空間上的分化：對于多細胞生物來講，同一細胞后代，由于所處的環(huán)境不同而可以有相異的形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能。 5.脫分化：植株上已經(jīng)分化的細胞或組織離體后在培養(yǎng)條

15、件下逐漸恢復到分生狀態(tài)的過程。細胞脫分化的結(jié)果通常是形成愈傷組織（未分化的細胞團）。35植物細胞培養(yǎng)的特性 植物細胞重量的增加主要在對數(shù)期，次級代謝產(chǎn)物的累積主要在穩(wěn)定期。與動物細胞培養(yǎng)類同，生長速率慢，為防止培養(yǎng)過程中染菌，需加抗生素；細胞大，細胞壁以纖維素為主要成分，表現(xiàn)為抗張力強度大，抗剪切力能力小。植物細胞常生長成各種大小的團塊，增加了懸浮培養(yǎng)的難度等。細胞培養(yǎng)需氧，但培養(yǎng)時不需要很高的氣液傳質(zhì)速率，而是要控制氧量，以保持較低的溶氧水平泡沫性質(zhì)不同于發(fā)酵，氣泡大，黏度也大，通常要采用化學或機械方法加以控制。產(chǎn)物在細胞內(nèi)且產(chǎn)量低。36（二）植物細胞的營養(yǎng)成分及其培養(yǎng)基 培養(yǎng)基的成分由無機

16、鹽類、碳源、維生素、植物生長激素、有機氮源、有機酸和一些復合物質(zhì)組成。1. 無機鹽 有大量元素和微量元素，30 毫克每升為界限，大量有氮、硫、磷、鉀、鎂、鈣、氯、鈉。微量有鐵、錳、碘、鉬、銅、鋅。2、有機質(zhì) 有機營養(yǎng)物質(zhì)（提供C、H、O和N） 生理活性物質(zhì)373、植物生長調(diào)節(jié)劑 植物激素是植物代謝過程中形成的生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，在極低濃度（小于 1 微摩爾）時即能調(diào)節(jié)植物的生育過程，并能從合成部位轉(zhuǎn)運到作用部位而發(fā)揮作用。常見的植物激素有生長素、分裂素、赤霉素、脫落酸、乙烯。植物組織和細胞培養(yǎng)物的生長過程主要取決于生長素和分裂素的比例，比值高可刺激細胞分裂，比值低則刺激細胞生長。384.附加物：瓊脂

17、、蔗糖、活性碳等，非必須，但對生長有利。5.成分未知的天然汁液,提供必要的微量營養(yǎng)成分、生理活性物質(zhì)和生長激素物質(zhì)。39選擇培養(yǎng)基的原則：需要根據(jù)不同培養(yǎng)對象、培養(yǎng)目的及培養(yǎng)條件探索適宜培養(yǎng)基。 選擇的培養(yǎng)基在培養(yǎng)過程使細胞總體積倍增時間1天左右為宜。 培養(yǎng)基的配制過程：母液配制、混合、稀釋、pH調(diào)節(jié)、分裝、包扎、滅菌。40（三）植物細胞的培養(yǎng) 植物細胞培養(yǎng)的基本步驟（1）植物材料的準備和清洗、消毒等 用于植物組織培養(yǎng)的外植體必須無菌。 常用表面滅菌試劑的特點是滅菌后易于除去或容易分解的試劑，根據(jù)所處理材料對滅菌試劑的敏感性選擇適當?shù)奶幚頃r間。常用滅菌試劑有次氯酸鈣、次氯酸鈉和氯化汞。 次氯酸

18、鈣為工業(yè)漂白粉過濾后的飽和溶液，適用于草本植物和柔軟組織的滅菌處理，時間為5-30分。 氯化汞滅菌效果好，但不易除去，時間不易過長，以免殺死植物細胞，當其用于休眠種子的滅菌劑最為理想，適用濃度為 0.1%，2-10 分鐘，種子皮較厚時可延長至 20分以上。 41（2）準備培養(yǎng)基 培養(yǎng)基是指人工配制的含有營養(yǎng) 物質(zhì)供培養(yǎng)物生長分化的介質(zhì)。通常含無機營養(yǎng)物質(zhì)(大量元素和微量元素)、碳源(1%-4%蔗糖)、生長調(diào)節(jié)劑以及有機附加物(維生素、甘氨酸)等幾類物質(zhì)組成。（3）接種 在無菌條件下操作，把材料放進培養(yǎng)基42（4）愈傷組織的培養(yǎng)和誘導愈傷組織：原指植物體的局部受到創(chuàng)傷刺激后，在 傷口表面新生的組

19、織。它由活的薄壁細胞組成。在離體培養(yǎng)條件下，外植體中的活細胞經(jīng)誘導脫分化，恢復其潛在的全能性，轉(zhuǎn)變?yōu)榉稚毎^而其衍生的細胞分化為薄壁組織而形成愈傷組織 愈傷組織類型：結(jié)構(gòu)致密型：表面光滑有光澤，結(jié)構(gòu)致密，多為淡黃色或白色，易于再生芽 結(jié)構(gòu)松散型：多為白色，可以用于懸浮系建立43（5）誘導產(chǎn)生器官或體細胞胚 調(diào)節(jié)培養(yǎng)基營養(yǎng)組織營養(yǎng)成分組成，愈傷組織在傳代培養(yǎng)若干代后，產(chǎn)生細胞團(器官原基),該細胞群能適應(yīng)進一步的的懸浮培養(yǎng)，形成器官（先芽后根），從而建立穩(wěn)定的懸浮培養(yǎng)植物細胞系（6）移栽4445三.植物細胞培養(yǎng)的類型與技術(shù) 根據(jù)所處狀態(tài)的不同，分為懸浮培養(yǎng)與固定化植物細胞培養(yǎng)法。 懸浮培養(yǎng)法

20、 分批培養(yǎng)法半連續(xù)培養(yǎng)法連續(xù)培養(yǎng)法 固定化培養(yǎng)法 包埋技術(shù)吸附技術(shù)共價結(jié)合技術(shù)461.分批培養(yǎng)法 與微生物的分批培養(yǎng)類同。由于操作簡單，從實驗室到大型罐廣泛應(yīng)用。分批培養(yǎng)中，植物細胞的生長曲線一般呈S型，可明顯觀察出誘導期、對數(shù)生長期、減速期、靜止期和衰亡期。但是與細菌和酵母菌的培養(yǎng)相比，即使是生長速率快的煙草細胞，分批培養(yǎng)時間（一個周期）也要6天以上，生長緩慢。主要采用氣升式反應(yīng)器，其培養(yǎng)過程用通氣代替攪拌，細胞產(chǎn)量高。47 生物種類 (h-1) 平均世代時間 (h) 煙草 0.0320.044 421.717.3 番茄 0.0140.026 49.526.7 胡蘿卜 0.021 33.0

21、釀酒酵母 0.50.65 1.391.07 紅曲霉 0.125 5.54 植物與微生物細胞生長速率的比較48 目前，無論在實驗室還是在工廠中，大至20噸罐，廣泛采用分批式操作。 藤田開發(fā)的二步培養(yǎng)法是分批培養(yǎng)法的一種變形，同時使用兩個反應(yīng)器，第一個反應(yīng)器主要是為大量培養(yǎng)細胞，即使用生長培養(yǎng)基使細胞大量增殖，達到了一定的細胞密度。第二個反應(yīng)器是為增加目的產(chǎn)物的含量。改用適合細胞產(chǎn)物積累的培養(yǎng)基，促進細胞啟動，次級代謝途徑并提高產(chǎn)物的產(chǎn)量。 分批培養(yǎng)中，在一定范圍內(nèi)增加底物濃度，可增加目的產(chǎn)物的產(chǎn)量，但濃度過高又會造成接種細胞的死亡。492.半連續(xù)培養(yǎng)法 在反應(yīng)器中投料和接種培養(yǎng)一段時間后，將部分

22、培養(yǎng)液和新鮮培養(yǎng)液進行交換的培養(yǎng)方法稱之為半連續(xù)培養(yǎng)法。反應(yīng)過程通常以一定時間間隔進行數(shù)次反復操作以達到培養(yǎng)細胞與生產(chǎn)有用物質(zhì)的目的。 503.連續(xù)培養(yǎng)法 采用連續(xù)培養(yǎng)反應(yīng)器，在投料和接種培養(yǎng)一段時間后，以一定速度連續(xù)采集細胞與培養(yǎng)液，并以同樣速度供給新鮮培養(yǎng)基，此種培養(yǎng)方式可使細胞生長環(huán)境長期維持恒定。連續(xù)培養(yǎng)法細胞生產(chǎn)能力一般較分批法高，但因細胞生長緩慢，培養(yǎng)時間長，要維持系統(tǒng)無菌狀態(tài)，技術(shù)條件要求相當苛刻。514.固定化培養(yǎng)法 固定化培養(yǎng)采用固定化反應(yīng)器，這類反應(yīng)器有網(wǎng)狀多孔板、尼龍網(wǎng)套及中空纖維膜等形式。將細胞固定在尼龍網(wǎng)套內(nèi)或固定于中空纖維膜反應(yīng)器的膜表面，或固定于網(wǎng)狀多孔板上，放在

23、培養(yǎng)液中進行培養(yǎng)，可通入凈化空氣代替攪拌。固定化培養(yǎng)法的優(yōu)點在于細胞位置固定，易于獲得高密度細胞群體及建立細胞間物理學和化學聯(lián)系，維持細胞間物理化學梯度，易于控制培養(yǎng)條件及獲得次生產(chǎn)物。 52常用固化劑有瓊脂、明膠、藻酸鹽、羥乙基纖維素。 培養(yǎng)溫度為 25左右，常需光照。由于植物組織在培養(yǎng)基上生長時要不斷消耗養(yǎng)分、散失水分和累積代謝產(chǎn)物，因此外植體在培養(yǎng)周左右必須移至新鮮培養(yǎng)基上，以保持繼續(xù)生長。移換一次培養(yǎng)基成為一次繼代培養(yǎng)，經(jīng)過一定次數(shù)的繼代培養(yǎng)，其培養(yǎng)物可用于懸浮培養(yǎng)。53優(yōu)點：簡便易行、所占空間小缺點：是外植體或愈傷組織僅有一部分與培養(yǎng)基接觸，培養(yǎng)基中產(chǎn)生濃度差，愈傷組織生長不平衡；外

24、植體基部插入培養(yǎng)基中，該處氣體交換不暢阻礙了組織呼吸正常進行，會堆積生長過程中的有害物質(zhì)；在愈傷組織細胞間出現(xiàn)極化現(xiàn)象，細胞群體不均一。54四、影響植物次級代謝物累積的因素1、組織來源：外植體、季節(jié)、休眠、分化等；2、化學培養(yǎng)條件：無機鹽、碳源、物質(zhì)生長調(diào)節(jié)劑、維生素、氨基酸、核酸、抗生素、天然物質(zhì)和前體等；3、物理條件：溫度、光（光照時間、光強、光質(zhì)）、通氣（氧氣）、pH和滲透壓551.組織來源外植體直接影響所誘導的組織和細胞的生長，而且也關(guān)系到其次級代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)能力。外植體的前處理也可嚴重影響次級代謝產(chǎn)物的累積方式。一定培養(yǎng)條件下不同植物細胞及同一植株不同部位細胞生長速度不同，次生物產(chǎn)率

25、也不同，應(yīng)選擇生長速度快及次生物產(chǎn)率高的細胞為培養(yǎng)材料。562.化學培養(yǎng)條件1）培養(yǎng)基的組成，基本培養(yǎng)基的各種成分是愈傷組織和懸浮細胞培養(yǎng)的物質(zhì)基礎(chǔ)。碳源：自養(yǎng)培養(yǎng)的二氧化碳和異養(yǎng)培養(yǎng)的糖類，性質(zhì)和數(shù)量往往對培養(yǎng)細胞的生物量有很大的影響。糖的作用有：延長穩(wěn)定期；通過蔗糖分解后的產(chǎn)物（葡萄糖）所產(chǎn)生的對內(nèi)源性生長素合成的抑制作用；增強戊糖磷酸化途徑有關(guān)酶的活性磷：低磷會導致次級代謝產(chǎn)物的累積，缺乏磷會導致生物量的大幅度降低。57氮：硝酸鹽、銨鹽、有機氮源。如天冬氨酸、尿素、酪蛋白水解物或蛋白胨銅：作為鄰及對-二酚可抗壞血酸氧化酶活性基團的作用，是次級代謝產(chǎn)物累積的必要元素，還可作為非生物誘導子。

26、生長調(diào)節(jié)物質(zhì)：其種類和數(shù)量對培養(yǎng)細胞的生長、分化和次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量有很大影響。(2) 誘導子: 植物抗毒素是在植物防御系統(tǒng)內(nèi)能對抗微生物進攻的某些次級代謝產(chǎn)物，有些時候連續(xù)合成，或僅在被誘導下其產(chǎn)量才能增加。觸發(fā)形成植物抗毒素信號的物質(zhì)稱為誘導子，能夠誘導植物細胞中的一個反應(yīng)，并能形成特征性自身防御反應(yīng)的分子。583.物理培養(yǎng)條件的影響（1）溫度：溫度對植物細胞培養(yǎng)有一定影響。如煙草NC2512細胞分別于20，25及30培養(yǎng)時，發(fā)現(xiàn)20及25時細胞生長速度均良好，但25時尼古丁產(chǎn)率更高；甘薯懸浮細胞培養(yǎng)物從30和32向25轉(zhuǎn)移后，對培養(yǎng)基中蔗糖及氨利用率下降，細胞生長速度減慢。次級代謝產(chǎn)物的

27、最佳產(chǎn)生溫度是 20-28 ，低溫時細胞不再生長，產(chǎn)物不合成。59(2)光的影響：光照時間的長短、光質(zhì)、光強對次級代謝產(chǎn)物的累積有不同影響。如在連續(xù)紅光或遠紅光作用下，玫瑰細胞培養(yǎng)物形成的揮發(fā)油成分與連續(xù)黑暗培養(yǎng)者相似；而用藍光或白色熒光照射15h或24h所形成的成分相似，但不同于暗培養(yǎng)者。有時光照對某些次生物質(zhì)的合成亦有抑制作用，如煙草NC2512細胞培養(yǎng)物連續(xù)暗處理，其尼古丁含量高于連續(xù)光照處理；有些植物細胞次生物產(chǎn)率不受光照影響，如橙葉雞血藤細胞培養(yǎng)物的蒽醌產(chǎn)率不受光照影響。植物細胞培養(yǎng)過程，光照影響是復雜的，故需根據(jù)不同培養(yǎng)對象，采取不同光處理措施。60（3）通氣 細胞生長過程需維持其

28、正常呼吸作用，懸浮細胞及固定化細胞培養(yǎng)時供氧方式有不同，前者可采用攪拌和通氣方式，后者僅能采用通氣方式，攪拌轉(zhuǎn)速通常為rmin，過快則易破壞細胞；通氣過程，一般用含的潔凈空氣為佳，通氣量適當，供氧量過多或過少均影響細胞生長及次生物產(chǎn)量。 （4）酸度： 一般植物細胞培養(yǎng)基pH5一6為宜，如甘薯細胞培養(yǎng)時，維持其pH為6.3，次生物產(chǎn)量較不控制pH高一倍，當pH降至4.時，其色氨酸積累完全抑制。61（5）培養(yǎng)容器的影響：因為容器的大小和攪拌裝置的不同會產(chǎn)生不同的次級代謝產(chǎn)物。攪拌速度也有影響，表現(xiàn)在發(fā)酵液中的溶氧濃度和機械攪拌對細胞所產(chǎn)生的剪切力上。 62（五）植物細胞培養(yǎng)的應(yīng)用1 利用植物細胞培

29、養(yǎng)進行藥物生產(chǎn) 太平洋紫杉細胞生產(chǎn)抗癌藥物紫杉醇、人參細胞培養(yǎng)人參皂苷和人參多糖、毛地黃細養(yǎng)轉(zhuǎn)化毛地黃毒苷典型案例：紫杉醇生產(chǎn)63 紫杉醇(Paclitaxel)是繼阿霉素和鉑類抗癌藥之后本世紀后期最受人們重視的一種抗癌新藥，是一新發(fā)現(xiàn)的有絲分裂抑制劑，其作用機理在于阻止微管正常生理聚集，抑制癌細胞的有絲分裂和紡錘體的形成，從而使癌細胞的復制受到阻斷而凋亡。 1967年美國化學家Wall和Wani等首先從太平洋紫 杉（短葉紅豆杉，Taxus. brevifolia）樹皮中提取出來。該藥于1990年進入期臨床試驗， 1992年底獲美國FDA批準上市。 64 紫杉醇存在于紅豆杉屬植物的樹皮、葉及莖中， 其中樹皮中的含量最高，大約從12000株成年紫杉樹中才能提取1KG的紫杉醇，而且紫杉的生長周期很長，在世界分布很少。 紫杉醇的國際市場價格為450美元/g 65 日本有關(guān)組織從紅豆杉中誘導產(chǎn)生愈傷組織，篩選得到細胞培養(yǎng)4周就增殖了5倍，紫杉醇