構(gòu)建載體心得和體會

1、轉(zhuǎn)載一篇別人的載體構(gòu)建的心得與體會這兩年在美帝凈做克隆實驗了，以前讀PHD時候還覺得自己分子克隆挺牛X的，來這邊之后 做了各種各樣的構(gòu)建才知道以前是坐井觀天，剛才粗粗統(tǒng)計了一下，在美帝一年零八個月，我 構(gòu)建的質(zhì)粒的超過四百個，其中有很簡單MPCR構(gòu)建到拿WB結(jié)果的一共不到一周，也有巨 難的花了四個月時間換了幾次strategy才弄好激動得我半夜備合老板發(fā)信的品種;有單片段酶切 插入這種不用腦型的，也有九個片段逐一插入正反向還不同的。專家不敢說，但是熟能生巧， 確實積累了不少經(jīng)驗，現(xiàn)在系里從POSTDOC到PHD學生到TECH構(gòu)建前很多人都跟我商 量（做博后結(jié)果成了技術(shù)員的人生真悲哀啊）。我老板

2、甚至開玩笑說，我們將來開個公司，我專門負責構(gòu)建（這話聽得我想揍他大家同意不?）想了想還是把經(jīng)驗寫下來，一來做個記錄，二來博同行一笑，能讓大家少繞點彎路則更好。1.準備工作俗話說用欲善其事，必先利其器。我強烈建議大家在做構(gòu)建之前先找好工具，這樣起的效果事 半功倍。這里說個笑話，我們系有個新PHD學生，是個印度女孩，很聰明很刻苦，她所在的 實驗室也很好，不過除了她之外包括老板在內(nèi)都是生物物理背景的，以前一個生物POSTDOC在的時候還好，這個POSTDOC 一走，整個實驗室對分生就只有一個粗淺的概念， 這個女孩就想把一個質(zhì)粒上的基因插到另一個質(zhì)粒上去，要是我就先查查有沒有合適的酶切位 點，要沒有就

3、改造一下質(zhì)粒一切搞定，這女孩她不懂?。ㄒ氖撬习骞倘慌?，對這方面也 不懂），自己辛辛苦苦設(shè)計了 PCR引物去做PCR , P 了將近5K的產(chǎn)物去測序，結(jié)果測的結(jié)果 中間有個MUTATION，要懂行的就找找酶切位點，從原來的替換上去，然后測這下這段就行。 她呢，又送去了若干了質(zhì)粒一個接一個的測，一個測序反應(yīng)這邊是8刀，一個質(zhì)粒測下來就是 40刀，她光測序就要花好幾百刀（你得佩服老美實驗室真有錢呀）。這件事教育我們準備工作是多么重要。這里推薦大家兩個工具，一個都知道，PRIMER5.0。另一個工具極強大，也不知道國內(nèi)流行 不，叫l(wèi)asergene，包括設(shè)計引物到構(gòu)建圖譜一應(yīng)俱全，圖譜非常漂亮，

4、而且分析酶切位點等 等就超NB，如果感興趣的話我可以備合大家傳一個圖譜看看。2. PCR如果沒有現(xiàn)成的質(zhì)?？晒┟盖?，PCR是最理想也是最方便的策略。關(guān)于PCR具體技術(shù)壇子內(nèi) 帖很多，我不多說了，這里僅在構(gòu)建方面談一談。（1 ）如何設(shè)計引物?首先，看懂質(zhì)粒圖譜！拿大家比較熟悉的PEGFP-C1和PEGFP-N1做例子。想用N1質(zhì)粒，設(shè)計引物就得把下游引 物上的中止密碼子去掉，不要辛辛苦苦的一路做下來結(jié)果根本不表達融合蛋白，你就死了C1 質(zhì)粒，注意frame，要是移碼了，你也死了。而且PEGFP系列有1.2.3，要弄清楚別弄竄了。 一句話，要看懂你的圖譜!再多一句，PEGFP的XBA1和Bcl1位

5、點不能用。注意在設(shè)計酶切位點的時候要加保護堿基（大家要用T載體就當我沒說）。酶切位點設(shè)計也有一 定的講究，我的原則是，能用粘端就用粘端，實在不能用的就用只好用一些常用的平端酶，如 ECORV和SNAB1之類，要是以后還有別的用處就多加點酶切位點，我曾一口氣在引物上加 了五個酶切位點以防以后要用到，注意計算TM的時候要減去這些不match的序列，或者選用 touch-up 策略。除了酶切位點，還要注意KOZAK序列的問題，很多質(zhì)粒沒有提供KOZAK序列，這要在設(shè)計 的時候直接在引物上加好。GENE OVERLAP也比較有用，比方說加個FLAG片段，HIS片段，2A序列之類的，直接設(shè) 計三引物OV

6、ERLAP 一下就可以，省得還要再多構(gòu)建一步，這些都是設(shè)計引物時候就要考慮 好的。引物長一點不要緊（我最喜歡兩步法了），尤其是對GC比高的序列，有時候引物不長PCR根 本不出結(jié)果，注意如果GC比較高，這個時候GENE OVERLAP就不要做了，很麻煩，克隆 很難挑。（2 ）沒有合適的酶切位點？很簡單，用同尾酶策略，比方說Bgl2和BamH1,Nhe1和spe1，Xho1和Sal1（注意連上了切 不下來），實在不行就平端吧，只要不超過4KB，平端酶連接也不那么難。（3）如何選擇Taq酶？選擇Taq酶也很關(guān)鍵，首先，高保真（High fidelity）這是必須的，我在國內(nèi)常用LA KIT，可這 邊

7、忑貴，只好用美國貨。常用的PFU，PHUSION和PFX。PFX50是invitrogen公司的，一 度曾賣到脫銷，保真性應(yīng)該是目前最高的，是普通Taq的50倍，對一般基因絕無問題（我同事 4.5K PCR產(chǎn)物，居然一個突變都沒有），但是對比較難PCR的高GC或者位點比較難做PCR 的基因（基因組為模板）就明顯不行7;PFU（安捷倫）保真性沒有PFX50高，但是能力很強，略貴 點;phusion是NEB公司的，不貴，但是這個酶很怪異，每次用都要把annealing溫度調(diào)高好 幾度，否則就出雜帶，個人覺得NEB內(nèi)切酶絕對是NO.1 ,但是Taq就不如Invitrogen 了， 如果實驗室有錢，直

8、接買invitrogen的spuermix，什么都混好了，連ddH歹都搞定，只要直 接向里加模版和引物就OK，每次我要拿漂亮的結(jié)果都用supermixo還是那句話，讀說明書。同是高保真Taq酶，iproof要求98度起始1min，pfx就要求95起始 2min，延伸有的是72，有的是68，有的要加1uL,有的加0.5，有的TM要低五度，有的高三 度，這些必須要讀說明書，讀且仔細讀，這是拿到任何試劑都要做的第一步。(4 )如果基因太難PCR，怎么辦？首先，DMSO是好物，好到甚至FISHER的Phusion就直接寫上了 DMSO這項，注意3%- 6%，太高Taq酶活性就不行了。如果GC太高而且片

9、段過長的話，DMSO也不行，GC低的 不推薦。我做個過一個2.8 k, GC比高達92%的基因PCR，一共做了兩周，從保真性最強的PFX50到 普通的 promega 2xGO Taq 都試過，什么 DMSO，甘油，Biorad 的 iproof with high GC Buffer, NEB one Taq 2x Taq High GC(還帶 Enhancer 的)，TAKARA 的 LA 都試過，都不行， 要么不出帶，要么就是亂七八糟的帶一起來，頭暈?zāi)X漲的我都打算抹平策略了，后來從別的實 驗室弄來一個clontech的2 GC rich kit，一次搞定!強烈推薦這個KIT，太牛了，在別

10、家都繳 械的時候，它一錘定音，不過價格也比別家都牛，10次反應(yīng)就130刀，其實實驗室大可以備 一個，就是防備超高GC又長的片段。不過這個KIT非高保真，送了三個克隆測序，各在不同 部位有突變，于是我就從A克隆切一段接到B克隆上，又從C克隆切一段接B克隆上。注意 的問題是GC比太高測序也很困難，正常GC能測1K左右，到了 High GC就能測個五六百， 這時要多準備些引物。(5)PCR產(chǎn)物的純化如果帶很單一，又強，直接PCR產(chǎn)物純化就可以，如果有雜帶，但目的帶也很強，跑膠，目 的帶切膠回收?；厥者@里也有個瓶頸，就是回收率的問題，我試過很多家的KIT，promega的 GEL回收試劑盒效率和價格都

11、很合適，推薦這個。關(guān)于T載體，我在國內(nèi)的時候是必用的，到了美帝反倒一次沒用過，這邊比較流行直接用 PCR產(chǎn)物切，就是回收完了直接切上，回收后然后連接，這又回到了最開始設(shè)計，要加保護 堿基。這個策略好處就是免除了T載體這步，直接插入目的載體，存在的問題就是處于盲做狀 態(tài)，還要加保護堿基。3.酶切我的原則一向是：盡量避免PCR，能酶切的多酶切，實在沒辦法才去PCRo 這里強烈推薦NEB的內(nèi)切酶，還記得在有一次用別家的酶切過夜，結(jié)果質(zhì)粒都被切碎了（當然 當時質(zhì)粒濃度也不高），而用NEB的酶，切個七十二小時仍舊一切OK，尤其現(xiàn)在NEB還推出 了 HF的內(nèi)切酶，沒有星活性而且統(tǒng)一都用Buffer4，很好

12、用，在國內(nèi)我都用TAKARA的酶， 基本上還可以。注意要讀說明書，選用什么buffer，多少度，用不用加BSA，這些都要仔細讀。酶切的起始量，PCR產(chǎn)物沒甚么可說的，全都切上，如果是從質(zhì)粒上切片段，要根據(jù)你片段 大小，片段適中，比如說7 kb質(zhì)粒，有2 KB是目的片段，這時切個3-4 ug就足夠了，如果 只有0.2 KB,那最好多切點，6 ug-7 ug內(nèi)切酶也沒問題。4.連接最常用的是NEB的T4和Promega的T4都很好用，但是注意Buffer里有ATP，反復凍融 ATP失活得很快，這時有兩種辦法，一種是象我們chair實驗室，每次連接都統(tǒng)統(tǒng)朝里面加 1uL ATP;另一種是我們實驗室的

13、策略，拿到buffer就分裝，10 uL/管，一次性使用，哪怕就用 1uL，剩下的直接扔掉。連接最重要的注意事項：（1）載體總量；（2）載體和插入片段比例；（3）載體和插入片段質(zhì)量。我在回收之后都要測載體濃度，一般來說，載體濃度在20-100 ng/uL很好，太低的話碰撞幾 率低，太高的話又會產(chǎn)生很多非目的克隆，總量從50-100 ng就可以，太低失敗幾率很高，太 高克隆太多，挑克隆會很麻煩，反應(yīng)總體積也有講究，體積太大載體和目的片段碰撞幾率太低， 而且對感受態(tài)細胞也是個挑戰(zhàn)，通用10-15 uL，我試過25 uL沒有問題，40 uL就不行了。載體和插入片段比例一般是1:3，如果很難連接，比如

14、說平端連接，要適當提高載體濃度，同 時加大比例1:10，我試過一端平一端粘連接，4 kb片段，4KB載體，連接成功率相當高，10 個克隆里8個都是陽性的，但是7 KB片段，5 KB載體的平端連接就連試兩周都失敗，最后換 策略分兩段先后克隆進去的，這也備合了我很深教訓，隔了一陣又做類似的實驗，這回我干脆連 試都沒試，繼續(xù)分成兩段分別連進去的。3片段連接同理，如果片段不太大，比方說小于3 K , 3片段連接成功幾率很高，但是如果你 片段太大，就不行了，我試過4 K載體，4 K片段A，2 K片段B連接，失敗四五次，最后還 是繞路走了。轉(zhuǎn)化這個簡單遵循基本的準則就行，話說實驗室原來從sigma買感受態(tài)

15、（competent cell），后來發(fā) 現(xiàn)還是自己做的效率高，尤其在使用XL-10細菌的時比DH5a效率要高，需要的話我可以發(fā) protocol上來。要注意的是LB必須無菌而且沒有抗生素，實驗室原來有個volunteer，做一次 失敗一次，我就奇怪了，后來才發(fā)現(xiàn)他用的居然是加了 KANA的LB，直接暈過去了。還有就 是氯化鈣的問題。氯化鈣吸水性很強，吸水后就完蛋了，我一般把它放在干燥罐里（反正我也 不知道啥名字，就那種玻璃罐，干燥用的），大家要不放心，用之前可以把氯化鈣放在烘箱里 烤一烤。鑒定普通實驗做酶切鑒定，陽性率非常高，大多數(shù)情況下四個中起碼有三個是正確的，很多時候都 是百分百正確，這

16、里推薦一種叫fast digest的酶，切個十幾分鐘跑膠就行了。如果找不到合適的酶切位點或者有其他問題，比方說有段時間我做個非常新潮的實驗，初始步 驟的雖然是藍白篩選，但是白斑也大部分都不對，沒辦法鑒定就用菌液PCR，最夸張的一次 是五十個白斑里面居然就一個陽性的（沒辦法，該實驗特點），這要提質(zhì)?？商岵黄稹＞篜CR 也有講究，很多人做菌液PCR鑒定假陽性特多，為甚么?因為你PCR引物選的都在載體上， 注意，引物必須分別在載體和插入片段上才準，PCR方法鑒定是極其準確的，我做過數(shù)百次 菌液PCR，只要PCR條件正確，PCR和酶切結(jié)果絕對百分之百對得上。PCR鑒定做起來也 很簡單，拿個2 mL

17、tube，裝0.5 mL加入相應(yīng)抗生素的LB，搖個三小時左后取1 uL做模板 就行了，樓下有個實驗室的POSTDOC特喜歡做直接的菌落PCR，我沒試過，效果怎樣不好 說。還要多說一句，要注意質(zhì)粒是低拷貝還是高拷貝，普通的質(zhì)粒一般4mL搖過夜，1.5 mL就能 提到500 ng/uL總體積40 uL的質(zhì)粒（根據(jù)試劑盒不同，最高提過800 ng/uL，也試過200 ng/ul，都正常）。如果是低拷貝質(zhì)粒，象PET系列和pshuttle系列，都是低拷貝，能拿到100 ng/uL就已經(jīng)很好了，這時候需要4 ML菌當2 ML提，但是最要命的還是Adeasy質(zhì)粒（用來 做腺病毒的），這個質(zhì)粒超過30 KB，普通KIT回收效率低到忍無可忍，一定要用特定的試劑 盒才行，還是那句話，這些都要讀說明書。我們拿到測序結(jié)果時候，不僅要核對具