水稻粒形基因GS3的功能標(biāo)記開發(fā)與鑒定

1、水稻粒形基因GS3的功能標(biāo)記開發(fā)與鑒定收稿日期： 2016-04-06基金項目：國家自然科學(xué)基金 （編號：31571624、31071382）； 國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃（編號： 2010CB125904、 2013CBA01405 ;江蘇省高校自然科學(xué)研究重大項目（編號： 15KJA210004；揚州大學(xué)大學(xué)生學(xué)術(shù)科技創(chuàng)新基金（編號： X2015616）;江蘇高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程項目。由于人口數(shù)量持續(xù)增長、 耕地面積日益減少、 自然災(zāi)害頻發(fā) 和水資源不足等原因， 水稻育種研究者不斷致力于提高水稻產(chǎn)量 水平，確保國家的糧食安全。同時隨著生活水平的不斷提高，稻 米消費者對稻米品質(zhì)也提出了更高的要

2、求。 水稻的產(chǎn)量和稻米品 質(zhì)都是受多因素控制的復(fù)雜性狀 1-2 ，其中粒形是影響水稻產(chǎn) 量和稻米品質(zhì)的重要因素之一 3 。在目前已經(jīng)克隆的水稻基因 中，通過調(diào)節(jié)粒形提高水稻產(chǎn)量的基因有 GS34、qPE9-15 、 GW26、 qGL3/GL3.17- 8 、qSW5/GW59-10、GS511 、 GS612、GW71、GW83、SLG713和 TGW614;通過調(diào)節(jié)粒 形改善稻米品質(zhì)的基因有 GW71和GW83。因此粒形性狀調(diào)控 機理的研究對水稻的產(chǎn)量育種和品質(zhì)育種有著重要的參考價值。GS3是控制水稻粒形的重要基因。 Fan等研究發(fā)現(xiàn)基因GS3 是控制水稻粒長和粒質(zhì)量的負(fù)調(diào)控因子， 以短粒

3、水稻品種川 7基 因GS3的基因組序列DQ355996為參照，來自長粒水稻品種明恢63的第2外顯子1 670 bp處的A堿基變異是無義突變，導(dǎo)致目 標(biāo)蛋白C端截短了 178個氨基酸4。結(jié)合180個水稻品種的關(guān) 聯(lián)分析，F(xiàn)an等進一步證實在秈粳亞種中基因型A比C都有更大的平均粒長15。除此變異外，Wang等還發(fā)現(xiàn)第4內(nèi)含子的（AT） n變異和第5外顯子的（TCC n變異也與水稻的粒長有關(guān)16。 目前該基因還有哪些變異位點以及它們對水稻粒形性狀效應(yīng)還 不清楚。為了加快基因GS3有利等位變異在水稻育種工作中的應(yīng)用， 本研究在序列比對的基礎(chǔ)上， 對第 2外顯子已知的功能變異和第 5 外顯子未知功能的錯

4、義突變開發(fā)了相應(yīng)的功能標(biāo)記，結(jié)合水稻 微核心種質(zhì)和近年來江蘇省審定粳稻品種的基因型檢測， 分析了 這些變異位點對水稻粒形性狀的影響， 為我國尤其是江蘇省的水 稻產(chǎn)量和品質(zhì)育種提供理論依據(jù)和快捷的選擇手段。1 材料與方法1.1 供試材料本研究的供試水稻材料包括秈稻品種明恢 63、粳稻品種日 本晴和蘇粳 2號、從中國農(nóng)業(yè)大學(xué)引進的 294 份水稻微核心種質(zhì) 和從江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院引進的65份江蘇省在20072013年期間審定的粳稻品種 17 。水稻微核心種質(zhì)包含 96份國外栽培 稻品種和 198 份中國栽培稻品種 18 ，具有豐富的遺傳多樣性。 供試材料來自國內(nèi)外不同稻作區(qū)的水稻品種， 它們的感

5、光性存在 較大的差異。為了確保能夠正常抽穗，所有供試水稻品種 2014 年 11 月于海南省陵水縣播種和育苗， 2015 年 1 月移栽大田，田 間管理同于常規(guī)水稻品種。 待水稻籽粒完全成熟后收種， 曬干后 進行水稻籽粒相關(guān)性狀的測量。1.2 水稻成熟種子粒形相關(guān)性狀數(shù)據(jù)的測定 參照水稻種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的方法，水稻種 子收獲并風(fēng)干后， 挑選飽滿成熟種子使用游標(biāo)卡尺 (精確到 0.01 mm測量粒長、粒寬和粒厚，5次重復(fù)，計算平均值。千粒質(zhì)量 使用電子天平測定 1 000 粒成熟烘干種子的質(zhì)量， 3次重復(fù)，計 算平均值。1.3基因GS3序列變異的分析和功能標(biāo)記的設(shè)計根據(jù)水稻粒形基因GS

6、3的研究結(jié)果，從Rice genome annotation project 網(wǎng)站( http ：/)下載 GS3基因的基因組 DNA序列DQ355996以該序列為種子序列，在 NCBI網(wǎng)站核酸序列數(shù)據(jù) 庫中找到高度同源的3個基因組DNA序列(來自秈稻品種9311 的基因GS3序列Ctg009226、?磣躍？稻品種日本睛的基因 GS3序 列AB488612和來自粳稻品系 H343的基因GS3序列 AB74389519)和 1 個來自廣陸矮 4 號的 cDNA序列 (CT835094。 借助 BioEdit 軟件對上述序列進行比對分析。本研究利用Primer Premier 5.0 軟件，對基因

7、GS3的第2 外顯子A/C序列點突變和第5外顯子的13 bp In del的序列變異 分別設(shè)計了 CAPs標(biāo)記GS3-1和GS3-2。弓I物的合成和序列的測定在生工生物工程（上海）XX公司完成。1.4DNA提取收集供試材料分蘗盛期新鮮幼嫩的葉片，采用CTAB法 20提取水稻基因組 DNA。1.5PCR擴增、酶切和電泳JP2PCR反應(yīng)體系含50 ng/卩L基因組DNA 2.0卩L, 2 a mol/L 引物 F和 R各 2.5 卩 L, 10X緩沖液 2.0 卩 L, 25 mmol/L MgCl2 2.0 a L, 2.5 mmol/L dNTP 1.6 a L, 5 U/ a L Taq D

8、NA 聚合酶（TaKaRaCode： R001C 0.2 a L,滅菌雙蒸餾水補足至 20 a L。PCR反應(yīng)在 Eppendof Master cycler proS PCR 儀上 進行，反應(yīng)條件為 94 C預(yù)變性5 min ; 94 C 30 s , 5560 C 30 s , 72 C 1 min，共35個循環(huán)；72 C再延伸10 min。反應(yīng) 產(chǎn)物在 3.0%的瓊脂糖上分離電泳。利用PCR引物擴增基因GS3的目標(biāo)片段，進一步用于酶切反 應(yīng)。酶切反應(yīng)體系為10 a L,分別包含PCR反應(yīng)產(chǎn)物5 a L, 10X buffer 1a L, 10 U/ a L 酶 0.25 a L, ddH

9、2O 3.75 a L?；?？蠔籩糜？37 C恒溫水浴鍋酶切 34 h,酶切產(chǎn)物在3.0%瓊脂 糖上電泳，EB染色，經(jīng)紫外凝膠成相系統(tǒng)成像。1.6 數(shù)據(jù)分析本研究中所有數(shù)據(jù)的分析和處理利用Excel和SPSS軟件進行。2結(jié)果與分析2.1 基因序列分析和分子標(biāo)記設(shè)計序列比對分析結(jié)果表明，基因GS3包含5個外顯子和4個內(nèi) 含子，編碼區(qū)有 59 處序列變異， 其中 57 個變異發(fā)生在內(nèi)含子區(qū)。 除了 Fan等已報道位于第2外顯子區(qū)的A/C變異與該基因功能密 切相關(guān)外，筆者發(fā)現(xiàn)該基因的第5外顯子還有1個13 bp的In del 變異位點4。以基因GS3的編碼序列DQ355996為參照，本研究 對基因GS

10、3第 2外顯子第1 670 bp處的A/C錯義突變和第5外 顯子第5 354 bp處的13 bp In del 變異分別開發(fā)了 CAPs標(biāo)記 GS3-1 和 GS3-2 （表 1）。對于基因GS3第 2外顯子第1 670 bp處的A/C單堿基變異， 筆者利用分子標(biāo)記GS3-1能夠在水稻品種中擴增出長度為216 bp的PCR產(chǎn)物（如圖1-A的泳道1和2）,經(jīng)過限制性內(nèi)切酶 Pst I 酶切后，能夠被切成 160 bp 條帶的水稻品種日本睛基因型為 C（如圖1-A的泳道4）; PCR產(chǎn)物仍為216 bp的水稻品種明恢 63基因型為A （如圖1-A的泳道3）。對于基因GS3第 5外顯子第5 354

11、bp處的13 bp In del 變 異，利用標(biāo)記GS3-2能夠在水稻品種中擴增出長度為 224 bp或 211 bp的2種類型PCR產(chǎn)物（如圖1-B的泳道1和2）。由于這 2種PCR產(chǎn)物片段差異較小，無法用普通瓊脂糖電泳加以區(qū)別； 但是通過限制性內(nèi)切酶 Nael酶切處理后，224 bp的PCR產(chǎn)物 能夠被切成 176 bp 條帶的水稻品種日本睛基因型為 13 bp 的插 入型（如圖1-B的泳道3）; PCF產(chǎn)物仍為211 bp的水稻品種蘇 粳2號基因型為13 bp的缺失型（如圖1-B的泳道4）。FK（W12TPYCD1.tif2.2基因GS3不同變異位點對水稻粒形的影響為了探明基因GS3第2

12、和第5外顯子的2個序列變異位點對 水稻籽粒相關(guān)性狀的影響，筆者利用上述發(fā)展的分子標(biāo)記 CM（25GS3-1和GS3-2分別對294份水稻微核心種質(zhì)的基因CM）型進行了測定，并對每個位點的不同變異類型進行了 t 測 驗，結(jié)果列于表 2。從表2中可以看出，在基因GS3第 2外顯子的A/C序列變異 中，不論秈稻還是粳稻，相對于基因型C而言，基因型A對增加粒長、減小粒厚、提高長寬比都有著極顯著的影響。在秈稻群體 中，筆者還發(fā)現(xiàn)基因型 A有極顯著減小粒寬的效應(yīng)。對基因 GS3 第5外顯子13 bp的In del序列進行變異，在粳稻群體中，筆者 發(fā)現(xiàn)具有 13 bp 插入的基因型對增加粒長和提高長寬比有著

13、極顯 著的影響，但在秈稻群體中沒有發(fā)現(xiàn) 13 bp 缺失的基因型。從基因型分布頻率來看，在基因GS3第 2外顯子的A/C變異 中，基因型A的頻率在秈稻品種中為 27.85%，在粳稻品種中為 23.53%，表明這種長粒形的基因型在秈稻和粳稻中都已經(jīng)被育種 研究者加以應(yīng)用。但是對于基因GS3第 5外顯子的13 bp In del變異而言，在 136個粳稻品種中，筆者發(fā)現(xiàn) 1 個品種具有 13 bp 缺失的基因型，其分布頻率為 074%，而在 158個秈稻品種中沒 有發(fā)現(xiàn)該基因型，表明 13 bp 缺失的基因型為稀有基因型。另外筆者發(fā)現(xiàn)基因GS3第 2和第5外顯子的2個變異位點對 水稻千粒質(zhì)量的影響

14、都沒有達到顯著水平。2.3近年來江蘇省育成品種中基因GS3的基因型分析為了更好地指導(dǎo)育種研究者在水稻育種中對籽粒相關(guān)性狀的選擇，本研究對20072013年江蘇省審定的65個粳稻品種基 因GS3的2個目標(biāo)變異位點進行了基因型測定，結(jié)果列于表3。在基因GS3第 5外顯子的13 bp In del變異中，65個粳稻品種 都是基因型為13 bp插入類型。在基因GS3第 2外顯子的A/C變 異中，近年來江蘇省審定的粳稻品種內(nèi)， 4 個水稻品種的基因型 為A;其余61個水稻品種的基因型為 C, t測驗結(jié)果表明基因型 A有極顯著增加粒長和提高長寬比的效應(yīng)，這表明江蘇省水稻育 種研究者已經(jīng)將長?；蛐蛻?yīng)用到當(dāng)

15、前的粳稻育種實踐中。FK（W6HT6HJZ 表 3 近年來江蘇省審定水稻品種基因WTHXSTHXGS3WTHZ不同基因型的籽粒粒形性狀HTSSHJ*5BG （！ BHDFG3, WK5 2，WK10 5W基因型樣本數(shù)粒長（mm粒寬（mr）粒厚（mr）長寬比千粒質(zhì)量（g）BHDG1*2， WK5， WK5， WK10。5DWWA47.99 0.19*KG -*3*3.34 0.082.33 0.062.41 0.1 2*KG- *3*28.74 1.46BHDWC617.360.043.38 0.022.38 0.012.18 0.0227.34 0.23BG) F注：“*KG-*3* ”表示差

16、極顯著(P 8Qi P，Lin YS，SongX J，et al. The novel quantitative trait locus GL3.1 controls rice grain size and yield by regulating Cyclin-T1 ； 3J. Cell Research，2012，22（12）： 1666-1680.Shomura A ， Izawa T ，Ebana K， et al. Deletion in a gene associated with grain size increased yields during rice domesticati

17、onJ. Nature Genetics， 2008，40（8）：1023-1028.ZK （#Weng J F，Gu S H，WanX Y，et al. Isolation and initial characterization of GW，5 a major QTLassociated with rice grainwidth and weightJ. Cell Research， 2008，18（12）： 1199-1209.Li Y B，F(xiàn)an C C，Xing Y Z，et al. Natural variation in GS5plays an important role in

18、 regulating grain size and yield in riceJ. Nature Genetics ，2011，43（ 12）：1266-1269.Sun L Y ，Li X J ，F(xiàn)u Y C， et al. GS6 ，a member of the GRAS gene family ， negatively regulates grain size in riceJ. Journal of Integrative Plant Biology， 2013， 55（10）： 938-949.HJ1.67mmZhou Y ，Miao J，Gu H Y，et al. Natura

19、l variations in SLG7 regulate grain shape in riceJ. Genetics， 2015，201（4）： 1591-1599.Ishimaru K ， Hirotsu N ，Madoka Y，et al. Loss of function of the IAA-glucose hydrolase gene TGW6 enhances rice grain weight and increases yieldJ. Nature Genetics ， 2013，45（6）：707-711.Fan C C，Yu S B，WangC R，et al. A c

20、ausal C-A mutation in the second exon of GS3highly associated with rice grain length and validated as a functional markerJ. Theoretical and Applied Genetics ，2009，118（3）：465-472.Wang C R ， Chen S， Yu S B. Functional markers developed from multiple loci in GS3 for fine marker-assisted selection of grain length in riceJ. Theoretical and Applied Genetics ，2011，122（5）：905-913.王?，楊杰，徐祥，等.水稻千粒重基因TGW6功能標(biāo)記 的開發(fā)與利用 J. 中國水稻科學(xué)， 2014， 28（5）： 473-478.Zhang H L ， Zhang D L ， Wang M X， et al. A core collection and mini core colle