生物信息學(xué)在高通量測(cè)序數(shù)據(jù)分析中應(yīng)用課件

1、生物信息學(xué)在高通量測(cè)序數(shù)據(jù)分析中的應(yīng)用主 講 人：李廣林提 綱高通量測(cè)序技術(shù)的介紹高通量測(cè)序技術(shù)的主要應(yīng)用生物信息學(xué)在高通量測(cè)序數(shù)據(jù)中的主要應(yīng)用高通量測(cè)序簡(jiǎn)介高通量測(cè)序:一次性對(duì)幾百萬(wàn)到十億條DNA分子進(jìn)行并行測(cè)序，又稱(chēng)為下一代測(cè)序技術(shù)，其使得可對(duì)一個(gè)物種的轉(zhuǎn)錄組和基因組進(jìn)行深入、細(xì)致、全貌的分析，所以又被稱(chēng)為深度測(cè)序。 High-throughput Sequencing Next Generation Sequencing Deep Sequencing3主要測(cè)序技術(shù) 第一代測(cè)序技術(shù)Sanger sequencing (1980s)第二代測(cè)序技術(shù)(next generation seque

2、ncing, NGS)Roche/454 (2005)Illumina/Solexa (2006)Life/APGs SOLiD (2007)Life/APGs Ion torrent (2010)第三代測(cè)序技術(shù)Pacific Biosciences single molecule sequencing (2011)Nanopore sequencing測(cè)序的基本反應(yīng)原理：DNA聚合反應(yīng)第一代測(cè)序技術(shù) Sanger 法結(jié)合熒光標(biāo)記和毛細(xì)管電泳測(cè)序峰圖ABI 3730 sequencerRead length: 1,000 bpAccuracy: 99.999%Cost: $0.5/kbThro

3、ughput: 6x105 bp/daySanger vs NGSSangerNGS樣品量大小是否需要電泳是否通量低高單位成本高低準(zhǔn)確率高偏低讀長(zhǎng)長(zhǎng)短高通量測(cè)序技術(shù)Roche/454 pyrosequencing以固化了引物的玻璃微球?yàn)橹行男纬捎桶Y(jié)構(gòu)的乳滴，每個(gè)乳滴都是一個(gè)PCR反應(yīng)的微量反應(yīng)器（通過(guò)控制測(cè)序文庫(kù)DNA的濃度和微球懸濁液的濃度，保證大多數(shù)微球只結(jié)合一條DNA模板）。經(jīng)過(guò)多輪循環(huán)反應(yīng)，每個(gè)微球表面都結(jié)合了數(shù)千個(gè)相同的拷貝。變性后，使微球上結(jié)合的都是單鏈DNA片段。富集微球，轉(zhuǎn)移到刻有大規(guī)模微孔陣列的微孔板上，每個(gè)微孔只容納一個(gè)微球。高通量測(cè)序技術(shù)Roche/454 pyros

4、equencing順次向流通池中加入4種dNTP中的一種，流過(guò)微孔板的一面。當(dāng)dNTP與脫氧核糖骨架連接后釋放出焦磷酸，在與dNTP一起加入的ATP硫?；负蜔晒馑孛缸饔孟庐a(chǎn)生一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)，放出不同的光信號(hào)。每個(gè)微孔中光信號(hào)的有無(wú)，就表明對(duì)應(yīng)的dNTP是否連接到了片段上。454測(cè)序的原理：焦磷酸測(cè)序逐次加入dATP等，每加入一種，檢測(cè)信號(hào)，清洗再加下一種。ATP硫酸化酶5-磷酰硫酸熒光素酶高通量測(cè)序技術(shù)Roche/454 pyrosequencing優(yōu)勢(shì)：讀長(zhǎng)長(zhǎng)(max 1 kb, GS FLX Titanium XL+)，運(yùn)行時(shí)間短(10-23 hours)主要錯(cuò)誤來(lái)源：難以準(zhǔn)確判定連續(xù)堿

5、基（經(jīng)過(guò)3次級(jí)聯(lián)化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生的熒光信號(hào)與連接上堿基的數(shù)量線性關(guān)系較差），容易產(chǎn)生Indel劣勢(shì)：通量相對(duì)偏低(max 700M)，單位成本高GS FLX+ SystemGS Junior System高通量測(cè)序技術(shù)Illumina/Solexa單鏈DNA兩端加上非對(duì)稱(chēng)的通用接頭(包括測(cè)序引物)，接頭與事先固定在固相芯片表面的序列互補(bǔ)單鏈DNA結(jié)合到芯片表面形成橋式結(jié)構(gòu)。然后使用接頭引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增變性后在一個(gè)芯片上可以形成上億個(gè)不相關(guān)的單鏈DNA分子簇，其一端固定在芯片表面，另一端是自由的高通量測(cè)序技術(shù)Illumina/Solexa使用測(cè)序引物從自由的通用接頭一側(cè)開(kāi)始測(cè)序反應(yīng)。測(cè)序使用的dN

6、TP每種堿基被不同的熒光基團(tuán)標(biāo)記，同時(shí)脫氧核糖的3-OH被封閉，這樣每輪測(cè)序循環(huán)只能延伸一個(gè)核苷酸。讀取堿基熒光信號(hào)，就能知道這一輪每個(gè)簇結(jié)合上的是什么核苷酸然后切除熒光基團(tuán)，打開(kāi)被封閉的3-OH，繼續(xù)進(jìn)行下一輪反應(yīng)Solexa測(cè)序的原理：可逆阻斷高通量測(cè)序技術(shù)Illumina/Solexa優(yōu)勢(shì)：通量最高 (max 600Gb, HiSeq 2500)主要錯(cuò)誤來(lái)源：同一個(gè)簇內(nèi)不同DNA鏈延伸情況不同（相位差），導(dǎo)致讀取錯(cuò)誤劣勢(shì)：讀長(zhǎng)較短 (max 250bp, HiSeq 2500)，運(yùn)行時(shí)間長(zhǎng)(1-14 days，HiSeq 2500大幅提升了運(yùn)行速度)，數(shù)據(jù)存儲(chǔ)和分析難度大。MiSeqHi

7、Seq 2000Genome Analyzer II高通量測(cè)序技術(shù)AB/SOLiDSOLiD System5500 seriesSOLiD 測(cè)序探針介紹類(lèi)似454的微球反應(yīng)體系，但使用連接反應(yīng)。SOLiD Sequencing 每次測(cè)序反應(yīng)的第1輪，測(cè)序引物1與接頭序列互補(bǔ)形成平末端，然后與探針連接。當(dāng)探針1,2位與待測(cè)序列模板互補(bǔ)并連接上之后，獲取熒光信息。然后在探針的5,6位之間切開(kāi)探針，進(jìn)行下一個(gè)連接反應(yīng)。這樣重復(fù)多次，可以獲得模板序列的第1-2, 6-7, 11-12位置的信息。高通量測(cè)序技術(shù)Life/APGs SOLiD優(yōu)點(diǎn)：由于使用雙堿基編碼技術(shù)（two-base encoding

8、），準(zhǔn)確率最高，通量高 (max 300 Gb)缺點(diǎn)：讀長(zhǎng)最短 (max 75 bp)，運(yùn)行時(shí)間長(zhǎng)(7-10 day)，數(shù)據(jù)儲(chǔ)存和分析難度大5500 Series Genetic Analysis Systems高通量測(cè)序技術(shù)Life/APGs Ion torrent PGM454發(fā)明者的新作品測(cè)序反應(yīng)在微陣列芯片上的微反應(yīng)池中進(jìn)行。每個(gè)dNTP結(jié)合到延伸鏈上，會(huì)釋放出一個(gè)H+，pH值變化會(huì)導(dǎo)致電位變化。檢測(cè)每次dNTP流過(guò)的電位差變化，就能知道該dNTP是否連接上去。高通量測(cè)序技術(shù)Life/APGs Ion torrent PGM優(yōu)點(diǎn)：速度快(5%）的單核苷酸變異群體SNP callingA

9、 T C G A T C G A A T T C G T A C G A T G C T T A G C T A G C A T A C GReferenceReadsA T C G A T C G C G T A C G A T G C T T A G C T A G C A T A C GShort InDel 檢測(cè)尋找SV (structure variation)Copy number variation (CNV)需要一定的測(cè)序覆蓋度 (10 x)，mapping depth也需要仔細(xì)檢查轉(zhuǎn)錄組Small RNA降解組TextRNADGE生物信息學(xué)在RNA omics方面的應(yīng)用RNA

10、高通量測(cè)序轉(zhuǎn)錄組Small RNA降解組TextRNADGERNA測(cè)序轉(zhuǎn)錄組測(cè)序轉(zhuǎn)錄組測(cè)序簡(jiǎn)介轉(zhuǎn)錄組即特定細(xì)胞在某一功能狀態(tài)下所能轉(zhuǎn)錄出來(lái)的所有RNA的總和，包括mRNA和非編碼RNA(Non-codingRNA)。 第二代測(cè)序系統(tǒng)可精確檢測(cè)單個(gè)堿基，并且不受到研究中先驗(yàn)信息的干擾，科研人員能夠快速地獲得某一物種特定器官或組織在某一狀態(tài)下幾乎所有mRNA轉(zhuǎn)錄本序列，從而能夠開(kāi)展：UTRs區(qū)域界定、可變剪切研究、低豐度新轉(zhuǎn)錄本發(fā)現(xiàn)、融合基因鑒定、cSNP（編碼序列單核苷酸多態(tài)性）研究等。 轉(zhuǎn)錄組研究?jī)?nèi)容轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)評(píng)估基因表達(dá)注釋差異表達(dá)基因鑒定、聚類(lèi)、Gene ontology 、KEGG pa

11、thway分析基因結(jié)構(gòu)優(yōu)化新轉(zhuǎn)錄本可變剪接融合基因SNP轉(zhuǎn)錄組測(cè)序流程無(wú)參考序列測(cè)序流程有參考序列測(cè)序流程轉(zhuǎn)錄組主要分析內(nèi)容無(wú)參考序列轉(zhuǎn)錄組分析內(nèi)容有參考序列轉(zhuǎn)錄組分析內(nèi)容1 測(cè)序數(shù)據(jù)產(chǎn)量統(tǒng)計(jì)，數(shù)據(jù)成分和質(zhì)量評(píng)估；2 Contig及Scaffold組裝、長(zhǎng)度分布3 Unigene的長(zhǎng)度分布和功能注釋?zhuān)珿O分類(lèi)，Pathway分析，差異表達(dá)分析4 蛋白功能預(yù)測(cè)與分類(lèi)，差異表達(dá)基因GO富集和 Pathway富集分析。 1 基本數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，比對(duì)參考序列2 序列在基因組上在分布3 測(cè)序深度分析、隨機(jī)性評(píng)估和基因差異表達(dá)分析4 新基因預(yù)測(cè)，基因可變剪接鑒定和基因融合鑒定等。基因融合分析基因嵌合分析流程 M

12、IPOL1-DGKB基因融合模式 Genomic intergenic regionReadsclusterPaired Readsdistribution優(yōu)化基因結(jié)構(gòu)鑒定新的轉(zhuǎn)錄本Paired-End (PE) ReadsReads 比對(duì)到參考序列基因間區(qū)域鑒定可變剪接（ Alternative Splicing ）exon1exon2exon3exon1exon2exon3exon1exon3common readsjunction readsmRNA分析RNA水平SNP轉(zhuǎn)錄組重測(cè)序比對(duì)軟件：SOAPDe novo 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序: 組裝軟件：SoapDenovo比對(duì)軟件： SoapSNP轉(zhuǎn)錄

13、組Small RNA降解組TextRNADGERNA測(cè)序小RNA測(cè)序Small RNA:是長(zhǎng)度在18-40nt的非編碼RNA，在基因表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮著重要的作用。小RNA的產(chǎn)生總RNA通過(guò)切膠回收CATGGCTGAAGTCAAGGATGTCATGGAAGGCAATCCCACATACATGCTAGAAAACATTTAATACATGCTAGAAAACATTTAATACATGGTTGAATCTGAAACCCTCATGGTTGAATCTGAAACCCTCATGGCTGAATCTGAGGCTCTCATGGCTGAATCTGAGGCTCTCATGCTAGAAAACATTTAATACATGCTAGAAAACA

14、TTTAATACATGGAAGGCAATCCCACATACATGGAAGGCAATCCCACATACATGGCTGAAGTCAAGGATGTCATGGCTGAAGTCAAGGATGT測(cè)序CATGCTAGAAAACATTTAATACATGCTAGAAAACATTTAATACATGCTAGAAAACATTTAATACATGCTAGAAAACATTTAATACATGGTTGAATCTGAAACCCT CATGGTTGAATCTGAAACCCTCATGGAAGGCAATCCCACATACATGGAAGGCAATCCCACATACATGGAAGGCAATCCCACATACATGGAAGGCAATCCCA

15、CATACATGGAAGGCAATCCCACATACATGGAAGGCAATCCCACATACATGGAAGGCAATCCCACATACATGGAAGGCAATCCCACATAmiRNAsiRNArepeatunann比對(duì)注釋和預(yù)測(cè)Small RNA測(cè)序Small RNA分析small RNA 的長(zhǎng)度分布；rRNA、tRNA、snRNA、snoRNA、miRNA、piRNA、siRNA的注釋?zhuān)晃锓N特有的miRNA預(yù)測(cè)；miRNA的靶基因預(yù)測(cè)；對(duì)預(yù)測(cè)的靶基因進(jìn)行GO分析和KEGG分析；對(duì)已知miRNA進(jìn)行樣品間差異分析和聚類(lèi)分析。Small RNA研究技術(shù)比較技術(shù)小 RNA 克隆芯片小RNA測(cè)序

16、原理Sanger 測(cè)序雜交新一代測(cè)序通量低高高小 RNA 數(shù)據(jù)庫(kù)依賴(lài)性無(wú)高有時(shí)背景噪音低高低表達(dá)譜鑒定新小RNAX檢測(cè)低拷貝小RNAX鑒定SNVX轉(zhuǎn)錄組Small RNA降解組TextRNADGERNA測(cè)序降解組測(cè)序降解組：含有5單磷酸的mRNA降解片段的集合。降解組測(cè)序高通量測(cè)序在RNA研究中的應(yīng)用測(cè)序技術(shù)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(Transcriptome)數(shù)字基因表達(dá)譜DGESmall RNA降解組測(cè)序研究對(duì)象mRNAmRNASmall RNAmRNARead 長(zhǎng)度90 PE50SE50SE50SE鑒定新分子OXOO表達(dá)譜研究OOOO基因結(jié)構(gòu)分析OXOX篩選分子標(biāo)記OXXXbiomarkerOOOO融合基因OXXX64PE, paired-end sequencing; SE, single-end sequencing; O, yes; X, noChIP-SeqChIP-Chromatin Immunoprecipitation染色質(zhì)免疫共沉淀，是指通過(guò)蛋白免疫相互作用，用抗體把和染色質(zhì)相互作用的蛋白，如組蛋白、轉(zhuǎn)錄因子等，沉淀下來(lái)，從而獲取與其相結(jié)合的DNA序列。ChIP-Seq就是通過(guò)高通量測(cè)序?qū)hIP所得到的序列進(jìn)行測(cè)序，從而進(jìn)行蛋白和DNA相互作用研究。ChIP