發(fā)酵工程復習資料

1、緒論如何理解發(fā)酵技術處于生物工程產(chǎn)業(yè)化的基礎地位？答：Q發(fā)酵工程是生物技術產(chǎn)業(yè)化的基礎和關鍵技術，是生物技術四大支柱的核心。Q是生物技術產(chǎn)品走向工業(yè)化的必由之路。2為什么微生物發(fā)酵能成為一種工業(yè)，微生物發(fā)酵工程的特點是什么？答：Q.微生物發(fā)酵產(chǎn)物種類多樣，需求量大，廣泛應用于醫(yī)藥、食品、農(nóng)業(yè)等。Q.微生物發(fā)酵產(chǎn)量高、培養(yǎng)周期短、成本低、可控制、可大規(guī)?；?、完全性好等使發(fā)酵能實現(xiàn)工業(yè)化。Q催化作用由細胞完成。Q巨大的比表面積。Q原料廣、價格低廉天然。Q反應過程溫和、生產(chǎn)安全。Q設備多能性、代謝途徑多樣化。Q易變異性,通過菌種改良，提高產(chǎn)量和生活特性。3現(xiàn)代微生物發(fā)酵工程研究的內(nèi)容Q菌種的選育和擴

2、大Q最經(jīng)濟地利用營養(yǎng)物，按需確定培養(yǎng)基Q滅菌Q微生物在最優(yōu)條件下產(chǎn)物的大規(guī)模生產(chǎn)Q發(fā)酵產(chǎn)物的提取純化Q廢物的處理、再生和生產(chǎn)環(huán)境的凈化初級代謝產(chǎn)物：初級代謝產(chǎn)物是與菌體生長相伴隨的產(chǎn)物。主要是構成細胞高分子物質(zhì)（蛋白質(zhì)、核酸、多糖、脂類）的單體物質(zhì)。次級代謝產(chǎn)物：次級代謝產(chǎn)物是以初級代謝產(chǎn)物、中心代謝產(chǎn)物等為原料而進行合成的，與生長不相伴隨，生物功能不明確，其合成易受環(huán)境影響，結構遠比初級代謝復雜。發(fā)酵工程：（微生物工程，發(fā)酵技術），是指利用微生物的特定代謝，通過現(xiàn)代工程技術，在生物的反應器中生產(chǎn)有用物質(zhì)的一種技術系統(tǒng)。發(fā)酵工程是“研究利用微生物的工業(yè)，即微生物參與的工藝過程”微生物菌種及其復

3、壯與保藏1.菌種退化有哪些原因?如何避免？答：原因：基因突變、連續(xù)移代、質(zhì)粒的脫落、培養(yǎng)和保藏條件的影響避免：（1）盡量減少傳代（2）菌種經(jīng)常純化（2）創(chuàng)造良好的培養(yǎng)條件（3）用單核細胞移植傳代（4）采用有效的菌種保藏方法2列舉出3種微生物保藏法并說出其適用范圍答：斜面保藏法一特點：簡便有效，易變異，退化甚至死亡。適合：不要求長期保藏的及不適合冷凍干燥的。保存期:3個月液體石蠟油保藏一特別適合:在固體培養(yǎng)基上不能形成抱子的絲狀擔子菌,如大型食用真菌和藥用真菌以及鐮刀菌、紅曲霉等.注意：保藏溫度，液體石蠟需滅菌和除水保存期：2-3年，甚至5年傳代一次.冷凍干燥保藏一特點：不易發(fā)生變異，5-10年

4、。需要凍干機。適用：除了一些不產(chǎn)抱子的絲狀真菌外。真空干燥一適于：預凍后易受凍傷的菌株液氮超低溫法一適合于各種微生物的保藏。干燥保藏法一沙土適于:能產(chǎn)生抱子或芽抱的微生物。麥麩適合產(chǎn)抱子的霉菌和放線菌。硅膠適合絲狀真菌和酵母菌。3作為工業(yè)生產(chǎn)用的菌種必須具備哪些條件答：（1）不是病原菌（2）純凈、健壯、產(chǎn)量質(zhì)量穩(wěn)定（3）易于控制培養(yǎng)條件,周期短（4）對誘變劑敏感（5）抗污染力強（6）原料廉價，生長迅速，目的產(chǎn)物產(chǎn)量高（7）產(chǎn)物分泌型菌種退化：生產(chǎn)菌種或選育過程中篩選出來的較優(yōu)良的菌株，由于進行一種傳代或保藏之后，群體中某些生理特征和形態(tài)特征逐漸減退或完全喪失的現(xiàn)象。冷凍干燥：用保護劑制備菌懸液

5、，然后將含菌樣快速降至冰凍狀態(tài)，減壓抽真空，使冰升華成水蒸汽排出，從而使含菌樣脫水干燥，并在真空狀態(tài)立即密封瓶口隔絕空氣，造成無氧的真空環(huán)境，然后置于低溫下保存。復壯：從大量退化的菌株中分離篩選到那些仍保持優(yōu)良性狀的個體或在菌種的生產(chǎn)性能尚未退化前就經(jīng)常有意識地進行純種分離與生產(chǎn)性能的測試工作。工業(yè)微生物菌種的選育1請設計一個從土壤中篩選含纖維素酶的微生物的實驗方案答：Q.從可能含有產(chǎn)纖維素酶菌株的地方采集樣品（如腐葉較多的森林）。Q.將樣品在三角瓶中稀釋，搖勻并過濾除去大顆粒物質(zhì)。Q.將3中得到的清液在試管0-5中按濃度梯度稀釋。Q在4-6中取適量菌液，分別涂布平板，培養(yǎng)。用影印平板法，分別

6、轉移到以纖維素為唯一碳源的培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，觀察。Q分別選取能生長的菌株培養(yǎng)后進行液體培養(yǎng)。Q選取纖維素產(chǎn)量高的菌株進行發(fā)酵條件的研究。Q選取有商業(yè)價值的菌株進行各項試驗。Q選擇合乎生產(chǎn)菌株初步要求的菌株進行菌種鑒定和改良。Q逐步放大試驗，產(chǎn)品檢驗合格此為生產(chǎn)菌株。2在增殖培養(yǎng)時,根據(jù)微生物生理特性采用哪些方法，可能獲得你所需要的菌株答：生化分離法（分離培養(yǎng)基法）、透明圈法、變色法、生長圈法、抑菌圈法、3.發(fā)酵生產(chǎn)中如果遭雜菌污染,你可通過什么方法獲得純種答：適當?shù)募尤霘⒕鷦┗蚩股匾约罢５陌l(fā)酵液，以抑制雜菌的生長速度，也可降低培養(yǎng)溫度、降低通風量、停止攪拌、少量補糖等。微生物誘變育種：以人

7、工誘變手段誘發(fā)基因突變、改變遺傳結構和功能，通過篩選，從多種多樣的變異體中篩選出產(chǎn)量高、性狀優(yōu)良的突變株，并且找出發(fā)揮這個變株最佳培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，使其在最適的環(huán)境條件下合成有效產(chǎn)物。同步培養(yǎng)：通過一定方法控制細胞的生長使其處于同一生長階段，所有細胞都能同時分裂紫外線的生物學效應：能引起DNA結構產(chǎn)生多種形式的變化。DNA鏈的斷裂，DNA交聯(lián)，核酸和蛋白質(zhì)的交聯(lián)，胞嘧啶和尿嘧啶的水和作用，以及嘧啶二聚體的形成紫外線誘發(fā)的突變主要是：G：CA：T的轉換。紫外線損傷DNA遺傳活性的作用，能被可見光恢復一光復活。能被光復活的菌種，經(jīng)誘變處理后，要避免長波紫外線和短波可見光的照射1誘變作用是有方向性的

8、嗎？在育種中怎樣解決這一問題？試舉二個方法。答：沒有方向性；基因工程育種；定向篩選：搖瓶篩選法；瓊脂塊篩選法；濃度梯度法2營養(yǎng)缺陷型菌株有何用處？答：（1）生產(chǎn)實踐中，營養(yǎng)缺陷型可用于工業(yè)微生物育種，協(xié)助解除代謝反饋調(diào)節(jié)機制，從而達到大量積累終產(chǎn)物的目的（2）也可以將營養(yǎng)缺陷型菌株作為生產(chǎn)菌種雜交、重組育種時的遺傳標記。（3）在基礎理論中，廣泛應用于闡明微生物代謝途徑上，遺傳學上有特殊的地位。在遺傳規(guī)律中的轉化、轉導、原生質(zhì)體融合、質(zhì)粒和轉座因子等研究中，營養(yǎng)缺陷型是最常用的標記菌種。3試設計一抗生素篩選方案。誘變洗滌抗生素JJJ出發(fā)株I/完全培養(yǎng)基基本高滲培養(yǎng)基二殺菌涂皿原生質(zhì)體育種原生質(zhì)體

9、：誘發(fā)、融合、再生、轉化、轉導再生一優(yōu)勢：敏感易變、淘汰弱勢種、細胞壁變化、無需標記機理：于質(zhì)粒脫落有關；解除調(diào)節(jié)基因對合成的調(diào)控轉化：融合一優(yōu)勢：Q.大幅提高親本間重組頻率：霉菌、放線菌可達1%；酵母10-4-10-5Q.擴大重組的親本范圍：種間、屬間、門間Q.親本整套染色體參與，遺傳物質(zhì)轉移和重組性狀多，集中雙親優(yōu)良性狀機會多步驟：標記菌株的篩選；原生質(zhì)體的制備；原生質(zhì)體的融合；原生質(zhì)體的再生；融合子的選擇；實用性菌株的篩選特點：遠緣、重組率高、多倍體、核酸的好材料、易接受外來遺傳物質(zhì)。工程菌的構建：目的基因；表達載體的構建與篩選；基因重組；轉化、篩選和鑒定鳥槍法分離基通過表達載體導入DN

10、A連接方式：重組基因導入宿主細因外源基因不帶間隔序列粘性末端胞：氯化鈣轉化法和電基因文庫的建利用原核細胞的強啟動平末端穿孔法立子和SD序列等調(diào)控元件人工接頭轉化子的篩選與鑒定：和基因分離連接后形成正確的開放同聚物加尾抗藥性；a-互補；限制性基因的化學合閱讀框架影響連接的因素：內(nèi)切酶酶切圖譜；PCR成利用宿主菌的調(diào)控系統(tǒng)連接酶的量法；核苷酸序列測定等PCR或RT-PCR非融合型pBV220作用溫度與時間融合型pGEX系統(tǒng)底物濃度分泌型pin卩系統(tǒng)利用基因工程技術改良微生物藥物生產(chǎn)菌種：1、解除限速步驟，提高抗生素產(chǎn)量2、阻斷支路代謝，增加有效組份含量3、引入血紅蛋白基因增加抗生素產(chǎn)量4、引入抗性

11、基因和調(diào)節(jié)基因，提高抗生素產(chǎn)量雜交育種雜交育種：一般是指人為利用原核微生物的接合，轉化和轉導及真核微生物的有性生殖或準性生殖等過程，促使兩個具有不同遺傳性狀的菌株發(fā)生基因重組，以獲得性能優(yōu)良的生產(chǎn)菌株。意義：擴大變異范圍；降低誘變疲勞效應；克服誘變的缺陷步驟：原始親本直接f親本親和力鑒定雜交-分亠離篩選重組體分析鑒定代謝控制發(fā)酵和育種代謝控制發(fā)酵過程:以生物化學和遺傳學為基礎，研究代謝產(chǎn)物的生物合成途徑和調(diào)節(jié)機制，選擇巧妙的技術路線，通過遺傳育種技術獲得解除或繞過微生物正常代謝途徑的突變株，從而人為地使有用產(chǎn)物選擇性地大量合成和積累.能荷調(diào)節(jié)：受細胞內(nèi)能量水平的控制.在葡萄糖氧化過程中，中間產(chǎn)

12、物積累或減少，進而引起荷能的變化，造成代謝終產(chǎn)物ATP的過?；驕p少。初級代謝:微生物產(chǎn)生的對自身生長和繁殖必須的物質(zhì)稱為初級代謝產(chǎn)物。而產(chǎn)生這些物質(zhì)的代謝體系稱次級代謝：通常把以初級代謝產(chǎn)物為前體，合成次生產(chǎn)物的代謝體系稱初級代謝產(chǎn)物：必需的、與生長相伴隨、主要構成高分子單體、正常情況不過量積累次級代謝產(chǎn)物：不必需、與生長不相伴隨、結構復雜、功能不明確、易受環(huán)境影響初級代謝與次級代謝的關系:生化一次級代謝產(chǎn)物是以初級代謝產(chǎn)物為母體衍生出來的，次級代謝產(chǎn)物合成途徑并不是獨立的，而是與初級代謝產(chǎn)物合成途徑密切相關。遺傳一初級代謝與次級代謝同樣受到核內(nèi)DNA的調(diào)節(jié)控制。同時，次級代謝產(chǎn)物還受到與初級

13、代謝產(chǎn)物合成無關的遺傳物質(zhì)的控制，即受到核內(nèi)遺傳物質(zhì)和核外遺傳物質(zhì)的控制。初級代謝調(diào)節(jié)-細胞調(diào)節(jié)：酶合成調(diào)節(jié)、酶活性調(diào)節(jié)、細胞滲透次級代謝調(diào)節(jié)：誘導調(diào)節(jié)、營養(yǎng)物濃度調(diào)節(jié)、反饋調(diào)節(jié)、細胞膜透性調(diào)節(jié)誘導調(diào)節(jié)：代謝流、酶的合成營養(yǎng)物濃度調(diào)節(jié)：Q凡是調(diào)節(jié)和控制分化過程的因素都會對抗生素的生物合成產(chǎn)生影響.Q對于極大多數(shù)抗生素生產(chǎn)菌而言，若在營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，只有當生長完全停止時，才會開始積累次級代謝產(chǎn)物但當營養(yǎng)物的濃度受到限制時，這兩個階段也會互相覆蓋。（碳分解產(chǎn)物、氮分解產(chǎn)物、磷酸鹽調(diào)節(jié)誘導物阻遏物失活阻遏物PlRNA聚合酶反饋調(diào)節(jié)：Q.自身產(chǎn)物的反饋調(diào)節(jié)。.分支代謝中初級代謝物的反饋調(diào)節(jié)。細

14、胞膜透性調(diào)節(jié)：產(chǎn)物分泌、營養(yǎng)的吸收代謝控制育種：通過特定突變型的選育，達到改變代謝通路、降低支路代謝終產(chǎn)物的產(chǎn)生或切斷支路代謝途徑及提高細胞膜透性，使代謝流向目的產(chǎn)物積累方向進行。組成型突變株是指操縱基因或調(diào)節(jié)基因突變引起酶合成誘導機制失靈，菌株不經(jīng)誘導也能合成酶，或不受終產(chǎn)物阻遏的調(diào)節(jié)突變型，稱為組成型突變株營養(yǎng)缺陷突變株的應用、滲漏突變株的應用滲漏缺陷型就是指遺傳性代謝障礙不完全的缺陷型。由于這種突變是使它的某一種酶的活性下降而不是完全喪失，因此，滲漏缺陷型能夠少量合成某一種代謝終產(chǎn)物，能在基本培養(yǎng)基上進行少量生長?？狗纸庹{(diào)節(jié)突變株的選育(包括抗分解阻遏和抗分解抑制)微生物的抗分解代謝阻遏

15、現(xiàn)象指代謝過程中酶的合成往往受高濃度的葡萄糖或其他易被迅速分解利用的碳源或氮源及磷酸鹽所抑制?？狗答佌{(diào)節(jié)突變株的選育:是一種解除合成代謝反饋調(diào)節(jié)機制的突變型菌株。細胞膜透性突變株的選育存在誘導物(乳糖)時，mRNA得到轉錄調(diào)節(jié)基因控制部分結構基因不存在誘導物時，mRNA無法轉錄誘導物和輔阻遏物(葡萄糖)都存在時DNA代謝工程進、通、節(jié)、堵、出。微生物代謝網(wǎng)絡中的途徑的交叉點（代謝流的集散處）叫做節(jié)點（node）,微生物自動抵制節(jié)點處代謝物流量分配比率的改變的特性叫做節(jié)點的剛性。把這種按特殊的經(jīng)濟規(guī)律運行的有利于生存競爭（生存保障）的新陳代謝特性叫做細胞經(jīng)濟性。微生物自動抵制代謝網(wǎng)絡中代謝物流量

16、分布的改變的特性叫做代謝網(wǎng)絡的剛性。代謝工程:把量化代謝流及其控制的工程分析方法與根據(jù)分析結果制定的遺傳修飾方案付之實施的分子生物學技術結合起來，以反復分析、校驗和修正的方式進行實際操作，改善微生物的產(chǎn)物形成的能力和微生物的細胞性能，從而滿足人類對生物的特定需求的生物工程的分支。代謝工程的研究策略：（一）在現(xiàn)存途徑中提高目標產(chǎn)物的代謝流；1增加代謝途徑中限速步驟酶編碼基因的拷貝數(shù)；2改造以啟動子為主的關鍵基因的表達系統(tǒng)，強化其表達；3提高目標途徑激活因子的合成速率；4滅活目標途徑抑制因子的編碼基因；5阻斷與目標途徑相競爭的代謝途徑。（二）在現(xiàn)存途徑中改變物質(zhì)流的性質(zhì)；1利用某些代謝途徑中酶對底

17、物的相對專一性，投入非理想型初始底物（如結構類似物）參與代謝轉化反應，進而合成細胞內(nèi)原本不存在的化合物；2在酶對底物專一性較強的情況下，通過蛋白質(zhì)工程技術修飾酶分子的結構域或功能域，以擴大酶對底物的識別和催化范圍。（三）利用已有途經(jīng)構建新的代謝旁路。1修補完善細胞內(nèi)部分途徑，以利用新的底物或合成新的產(chǎn)物。2轉移多步途徑以構建雜和代謝網(wǎng)絡。將編碼某一完整生物合成途徑的基因轉移到受體細胞中，可以構建具有何大經(jīng)濟價值的生產(chǎn)菌株。逆代謝工程：從限制生物活性的主要因素入手，在相關生物種類中鑒別所希望得到的表型，并確定該表型的決定基因，然后利用基因重組技術將該基因克隆到宿主菌中，并使之表達，使宿主菌得到所

18、希望的表型的技術。分批發(fā)酵：是一種準封閉式系統(tǒng)。一次投料，一次接種，一次收獲的間歇式培養(yǎng)方式。培養(yǎng)過程中，接種物要經(jīng)過5個時期。即延遲期、對數(shù)生長期、減速期、穩(wěn)定期和衰亡期。特點：操作簡單、周期短、染菌機會少和生產(chǎn)過程、產(chǎn)品質(zhì)量易掌握。但是生產(chǎn)率相對較低。連續(xù)發(fā)酵：連續(xù)發(fā)酵是指在培養(yǎng)過程中，連續(xù)地向發(fā)酵罐中加入培養(yǎng)基，同時以相同的流速從發(fā)酵罐中排出含有產(chǎn)品的培養(yǎng)基的發(fā)酵方式。最大特點：微生物細胞的生長速率、產(chǎn)物的代謝均處于恒定狀態(tài)，可達到穩(wěn)定、高速培養(yǎng)微生物細胞或生產(chǎn)大量的代謝產(chǎn)物的目的。生產(chǎn)率得以提高。補料分批發(fā)酵:在分批培養(yǎng)過程中，間歇或連續(xù)地補加新鮮培養(yǎng)基，而不從發(fā)酵罐中間斷地放出培養(yǎng)液的培養(yǎng)方法。工業(yè)上利用分批補料培養(yǎng)以消除阻遏并保持通氣條件。分批補料培養(yǎng)還可以防止培養(yǎng)基中某一組分的毒性?；蚬こ叹牟环€(wěn)定性：質(zhì)粒不穩(wěn)定：分裂不穩(wěn)定：工程菌分裂時出現(xiàn)一定比例的不含質(zhì)粒的子代菌的現(xiàn)象結構不穩(wěn)定：由于DNA從質(zhì)粒上丟失或堿基重排、缺失所致工程菌性能的改變合適的宿主；合適的載體；選擇壓力；分階段控制培養(yǎng)；控制培養(yǎng)條件；固定化無菌保障污染危害