HPLC-DAD法同時測定抗感顆粒中15個活性成分含量#

1、中國科技論文在線- PAGE 9 - FORMTEXT HPLC-DAD法同時測定抗感顆粒中15個活性成分含量基金項目：教育部博士點基金新教師類(20133519120001) FORMTEXT 許春芳， FORMTEXT 林新強， FORMTEXT 謝心月， FORMTEXT 許文， FORMTEXT 黃鳴清作者簡介：許春芳(1992-)，女，碩士研究生，中藥藥效物質研究通信聯(lián)系人：黃鳴清（1980-），男，副教授，中藥藥效物質基礎研究. E-mail: SET version 1.5 * MERGEFORMAT1.5SET bkCompanyEN School of Pharmacy, F

2、ujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350122;School of Pharmacy, Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350122;School of Pharmacy, Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350122;School of Pharmacy, Fujian University of Traditional Chinese Medic

3、ine, Fuzhou 350122;School of Pharmacy, Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350122 * MERGEFORMATSchool of Pharmacy, Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350122;School of Pharmacy, Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350122;School of Pha

4、rmacy, Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350122;School of Pharmacy, Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350122;School of Pharmacy, Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350122SET bkCompanyCHN 福建中醫(yī)藥大學藥學院，福州 350122;福建中醫(yī)藥大學藥學院，福州 350122;

5、福建中醫(yī)藥大學藥學院，福州 350122;福建中醫(yī)藥大學藥學院，福州 350122;福建中醫(yī)藥大學藥學院，福州 350122 * MERGEFORMAT福建中醫(yī)藥大學藥學院，福州 350122;福建中醫(yī)藥大學藥學院，福州 350122;福建中醫(yī)藥大學藥學院，福州 350122;福建中醫(yī)藥大學藥學院，福州 350122;福建中醫(yī)藥大學藥學院，福州 350122SET bkPostcode 350122;350122 * MERGEFORMAT350122;350122SET bkMobile15980296606 * MERGEFORMA159

6、80296606SET bkTelphone0591-22861217 * MERGEFORMA0591-22861217SET bkAddress 福建福州閩侯上街大學城邱陽路1號福建中醫(yī)藥大學藥學院;福建福州閩侯上街大學城邱陽路1號福建中醫(yī)藥大學藥學院 * MERGEFORMAT福建福州閩侯上街大學城邱陽路1號福建中醫(yī)藥大學藥學院;福建福州閩侯上街大學城邱陽路1號福建中醫(yī)藥大學藥學院SET bkEmail 215190465283075608; * MERGEFORMAT215190465;1835914

7、6156;283075608;SET bkIntroduction 許春芳(1992-)，女，碩士研究生，中藥藥效物質研究;黃鳴清（1980-），男，副教授，中藥藥效物質基礎研究 * MERGEFORMAT許春芳(1992-)，女，碩士研究生，中藥藥效物質研究;黃鳴清（1980-），男，副教授，中藥藥效物質基礎研究SET bkAuthorCHN 許春芳;林新強;謝心月;許文;黃鳴清 * MERGEFORMAT許春芳;林新強;謝心月;許文;黃鳴清SET bkAuthorEN XU Chunfang;Lin Xinqiang;XIE Xinyue;XU Wen;HUANG Mingqing * M

8、ERGEFORMATXU Chunfang;Lin Xinqiang;XIE Xinyue;XU Wen;HUANG MingqingSET bkContact 黃鳴清 * MERGEFORMAT黃鳴清SET bkFund 教育部博士點基金新教師類(20133519120001) * MERGEFORMAT教育部博士點基金新教師類(20133519120001)SET version 1.5 * MERGEFORMAT1.5SET version 1.5 * MERGEFORMAT1.5SET version 1.5 * MERGEFORMAT1.5SET version 1.5 * MERG

9、EFORMAT1.5SET version 1.5 * MERGEFORMAT1.5SET version 1.5 * MERGEFORMAT1.5SET version 1.5 * MERGEFORMAT1.5SET version 1.5 * MERGEFORMAT1.5SET version 1.5 * MERGEFORMAT1.5SET version 1.5 * MERGEFORMAT1.5SET version 1.5 * MERGEFORMAT1.5SET version 1.5 * MERGEFORMAT1.5SET bkReferencesInfo 1*|*技術標準*|*國家

10、藥典委員會.中華人民共和國藥典：2015年版一部S.北京: 中國醫(yī)藥科技出版社，2015.2*|*期刊*|*郭東曉,林林,汪冰,等. HPLC波長切換法同時測定抗感顆粒中7個成分的含量J. 藥物分析雜志,2015,35(10):1796-1800.3*|*期刊*|*劉元媛,胡佳,何濤. 抗感顆粒的HPLC指紋圖譜研究J. 遼寧醫(yī)學院學報,2013,34(06):11-13+104-106.4*|*期刊*|*張亞明. HPLC-ELSD法測定抗感顆粒中綠原酸含量J. 實用臨床醫(yī)藥雜志,2011,15(5):89-90.5*|*期刊*|*劉元媛,盧靜華,郭偉英,等. RP-HPLC法測定抗感顆粒中

11、芍藥苷和綠原酸的含量J. 中國藥房,2011,22(40):3820-3821.6*|*期刊*|*李錦,王建,張麗娟,等. 抗感顆粒指標成分含量測定及揮發(fā)油成分鑒別方法研究J. 天津藥學,2007,19(3):6-8.7*|*專利*|*石建功,李 帥,王素娟,等.金銀花提取物,其制備方法和應用P. 中國，CN 01085795A,2007-12-12.8*|*期刊*|*馬雙成,劉 燕,畢培曦,等. 金銀花藥材中抗呼吸道病毒感染的環(huán)烯醚萜苷類成分的定量研究J.藥物分析雜志,2006,26(8)1039-1042.9*|*期刊*|*Chen ChunYun,Qi Lianwen, Li Huiju

12、n, et al.Simultaneous determination of iridoids, phenolic acids, flavonoids, and saponins in Flos Lonicerae and Flos Lonicerae Japonicae by HPLC-DAD-ELSD coupled with principal component analysisJ.J Sep Sci,2007,30(18)：3181-3192.10*|*期刊*|*ZHANG MH, LIANG F, ZHU MM, et al. Antioxidative and anti-infl

13、ammatory activities of paeoniflorin and oxypaeoniflora on AGEs-induced mesangial cell damageJ. Planta Med, 2013, 79(14):1319-1323.11*|*期刊*|*LI SL, SONG JZ, CHOI FF, et al. Chemical profiling of Radix Paeoniae evaluated by ultra-performance liquid chromatography/photo-diode-array/quadrupole time-of-f

14、light mass spectrometryJ. J Pharm Biomed Anal, 2009, 49(2):253-259.12*|*期刊*|*SHI DY, JIN XB, ZHU J, et al. Progress in critical nodes in signaling networks as pharmaceutical targets for penta-galloyl-glucose J. Chin J Pharmacol Toxicol, 2011, 25(4):407-411.13*|*期刊*|*Huang MQ, Xu SY, Xu W, et al. qua

15、litative and quantitative analysis of the major constituents in jin-mu-gan-mao tablet by high-performance liquid chromatography with diode-array detection and quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometry J. J Sep Sci, 2014, 1: 1-12. * MERGEFORMAT1*|*技術標準*|*國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：2015年版一部S.北京: 中國醫(yī)藥科

16、技出版社，2015.2*|*期刊*|*郭東曉,林林,汪冰,等. HPLC波長切換法同時測定抗感顆粒中7個成分的含量J. 藥物分析雜志,2015,35(10):1796-1800.3*|*期刊*|*劉元媛,胡佳,何濤. 抗感顆粒的HPLC指紋圖譜研究J. 遼寧醫(yī)學院學報,2013,34(06):11-13+104-106.4*|*期刊*|*張亞明. HPLC-ELSD法測定抗感顆粒中綠原酸含量J. 實用臨床醫(yī)藥雜志,2011,15(5):89-90.5*|*期刊*|*劉元媛,盧靜華,郭偉英,等. RP-HPLC法測定抗感顆粒中芍藥苷和綠原酸的含量J. 中國藥房,2011,22(40):3820-

17、3821.6*|*期刊*|*李錦,王建,張麗娟,等. 抗感顆粒指標成分含量測定及揮發(fā)油成分鑒別方法研究J. 天津藥學,2007,19(3):6-8.7*|*專利*|*石建功,李 帥,王素娟,等.金銀花提取物,其制備方法和應用P. 中國，CN 01085795A,2007-12-12.8*|*期刊*|*馬雙成,劉 燕,畢培曦,等. 金銀花藥材中抗呼吸道病毒感染的環(huán)烯醚萜苷類成分的定量研究J.藥物分析雜志,2006,26(8)1039-1042.9*|*期刊*|*Chen ChunYun,Qi Lianwen, Li Huijun, et al.Simultaneous determination

18、 of iridoids, phenolic acids, flavonoids, and saponins in Flos Lonicerae and Flos Lonicerae Japonicae by HPLC-DAD-ELSD coupled with principal component analysisJ.J Sep Sci,2007,30(18)：3181-3192.10*|*期刊*|*ZHANG MH, LIANG F, ZHU MM, et al. Antioxidative and anti-inflammatory activities of paeoniflorin

19、 and oxypaeoniflora on AGEs-induced mesangial cell damageJ. Planta Med, 2013, 79(14):1319-1323.11*|*期刊*|*LI SL, SONG JZ, CHOI FF, et al. Chemical profiling of Radix Paeoniae evaluated by ultra-performance liquid chromatography/photo-diode-array/quadrupole time-of-flight mass spectrometryJ. J Pharm B

20、iomed Anal, 2009, 49(2):253-259.12*|*期刊*|*SHI DY, JIN XB, ZHU J, et al. Progress in critical nodes in signaling networks as pharmaceutical targets for penta-galloyl-glucose J. Chin J Pharmacol Toxicol, 2011, 25(4):407-411.13*|*期刊*|*Huang MQ, Xu SY, Xu W, et al. qualitative and quantitative analysis

21、of the major constituents in jin-mu-gan-mao tablet by high-performance liquid chromatography with diode-array detection and quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometry J. J Sep Sci, 2014, 1: 1-12.SET bkAuthorsInfo |1|許春芳|XU Chunfang|福建中醫(yī)藥大學藥學院，福州 350122|School of Pharmacy, Fujian University o

22、f Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350122|許春芳(1992-)，女，碩士研究生，中藥藥效物質研究|福建福州閩侯上街大學城邱陽路1號福建中醫(yī)藥大學藥學院|350122|21519046515259149357|2|林新強|Lin Xinqiang|福建中醫(yī)藥大學藥學院，福州 350122|School of Pharmacy, Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 3501223|謝心月|XIE Xinyue|福建

23、中醫(yī)藥大學藥學院，福州 350122|School of Pharmacy, Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350122|283075608|4|許文|XU Wen|福建中醫(yī)藥大學藥學院，福州 350122|School of Pharmacy, Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350122|*|5|黃鳴清|HUANG Mingqing|福建中醫(yī)藥大學藥學院，福州 350122|School of Pharmacy, Fuji

24、an University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350122|黃鳴清（1980-），男，副教授，中藥藥效物質基礎研究|福建福州閩侯上街大學城邱陽路1號福建中醫(yī)藥大學藥學院|35012215980296606 * MERGEFORMAT|1|許春芳|XU Chunfang|福建中醫(yī)藥大學藥學院，福州 350122|School of Pharmacy, Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350122|許春芳(1992-)，女，

25、碩士研究生，中藥藥效物質研究|福建福州閩侯上街大學城邱陽路1號福建中醫(yī)藥大學藥學院|350122|21519046515259149357|2|林新強|Lin Xinqiang|福建中醫(yī)藥大學藥學院，福州 350122|School of Pharmacy, Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 3501223|謝心月|XIE Xinyue|福建中醫(yī)藥大學藥學院，福州 350122|School of Pharmacy, Fujian University of

26、 Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350122|283075608|4|許文|XU Wen|福建中醫(yī)藥大學藥學院，福州 350122|School of Pharmacy, Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350122|*|5|黃鳴清|HUANG Mingqing|福建中醫(yī)藥大學藥學院，福州 350122|School of Pharmacy, Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 35012

27、2|黃鳴清（1980-），男，副教授，中藥藥效物質基礎研究|福建福州閩侯上街大學城邱陽路1號福建中醫(yī)藥大學藥學院|35012215980296606SET bkTitleInfo HPLC-DAD法同時測定抗感顆粒中15個活性成分含量|Determination of fifteen active contents in KangGan granules by HPLC-DAD|教育部博士點基金新教師類(20133519120001) * MERGEFORMATHPLC-DAD法同時測定抗感顆粒中15個活性成分含量|Determination of fifteen

28、 active contents in KangGan granules by HPLC-DAD|教育部博士點基金新教師類(20133519120001)（福建中醫(yī)藥大學藥學院，福州 350122）SET bkTitleInfo * MERGEFORMAT SET bkAuthorsInfo * MERGEFORMAT 摘要： FORMTEXT 本研究建立一種高效液相色譜-光電二極管陣列檢測器（HPLC-DAD）法同時測定抗感顆粒中15個活性成分（沒食子酸、新綠原酸、原兒茶酸、對羥基苯甲酸、氧化芍藥苷、綠原酸、獐牙菜苷、隱綠原酸、芍藥內酯苷、芍藥苷、蘆丁、五沒食子酰葡萄糖、異綠原酸B、異綠原酸

29、A、異綠原酸C）的含量，以Ultimate C18 (150 mm 4.6 mm, 5m)為色譜柱；以乙腈（B）-0.1%甲酸水（A）為流動相，梯度洗脫；流速：0.8 mL/min；柱溫：25 ；進樣量：10 l。結果表明HPLC-DAD定量分析抗感顆粒中15種成分在考察的濃度范圍內，與峰面積之間呈良好的線性關系(r 0.9990); 回收率均在95.70% 104.74%范圍，RSD在1.90% 4.96%；所建立的HPLC-DAD同時測定抗感顆粒中15個活性成分的定量分析方法簡便、快捷、準確，為綜合評價抗感制劑的質量提供參考。關鍵詞： FORMTEXT 中藥學；抗感顆粒；HPLC-DAD；

30、質量控制中圖分類號： FORMTEXT R284.1SET bkAuthorsInfo * MERGEFORMAT SET bkTitleInfo * MERGEFORMAT FORMTEXT Determination of fifteen active contents in KangGan granules by HPLC-DAD FORMTEXT XU Chunfang, FORMTEXT Lin Xinqiang, FORMTEXT XIE Xinyue, FORMTEXT XU Wen, FORMTEXT HUANG Mingqing(School of Pharmacy, Fuj

31、ian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350122)Abstract: FORMTEXT In this study, an HPLC-DAD method for simultaneous determination of 15 active contents in KanGan granules. 15 active contents: Gallic acid, Neochlorogenic acid, Protocatechuic acid, 4-Hydroxybenzoic acid, Oxypaeoniflora

32、, Chlorogenic acid, Swertiamarin, Cryptochlorogenin acid, Albiflorin, Paeoniflorin, Rutin, Pentagalloylglucose, Isochlorogenic acid B, Isochlorogenic acid A, Isochlorogenic acid C were simultaneously separated by Ultimate C18 (150 mm 4.6 mm, 5 m) column; Acetonitrile (B) -0.1% formic acid (A) as the

33、 mobile phase and chosed gradient elution mode; flow rate: 0.8 mL/min; column temperature: 25 ; injection volume: 10 L. And HPLC-DAD quantitative methodology was validated: satisfactory linearity was achieved with wide linear range and fine determination coefficient (r 0.999 0), the overall recoveri

34、es were ranged from 95.70% 104.74% with the RSD ranging from 1.90% 4.96%. It is the first report about simultaneous analysis of 15 major components in KangGan granules by using HPLC-DAD method, which affords highly simply, specific, speedy and accurately for quality control of KangGan granules.Key w

35、ords: FORMTEXT Traditional chinese medicine; KanGan granules; HPLC-DAD; quality control引言抗感顆粒是由金銀花、赤芍和綿馬貫眾三味中藥組成，具有清熱解毒之功效，用于外感風熱引起的感冒，癥見發(fā)熱、頭痛、鼻塞、噴嚏、咽痛、全身乏力、酸痛1?？垢蓄w粒目前已被收錄在2015版中國藥典1中，但是其僅僅針對赤芍中一個成分（芍藥苷）進行質量控制，很明顯該質量評價方法不夠全面。同時查閱國內外文獻，發(fā)現對于抗感顆粒的質量控制除了芍藥苷外，僅僅針對復方中單味中藥的綠原酸類或揮發(fā)油等12個成分的含量進行測定2-6，不能全面的反映抗

36、感顆粒復方的整體作用。因此，為提高該方的質量標準，本文采用HPLC-DAD法對抗感顆粒中所含的3種中藥著手，對機酸類、黃酮、單萜苷類等共計15個主要活性成分（沒食子酸、新綠原酸、原兒茶酸、對羥基苯甲酸、氧化芍藥苷、綠原酸、獐牙菜苷、隱綠原酸、芍藥內酯苷、芍藥苷、蘆丁、五沒食子酰葡萄糖、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C）進行同時定量研究，為其綜合質量評價提供依據。儀器與材料Shimadzu LC-20A高效液相色譜儀（日本島津公司）配備SPD-M20A光電二極管陣列DAD檢測器、LCsolution工作站；Ultimate XB-C18 (4.6 mm150 mm，5 m)色譜柱；DV215C

37、D型十萬分之一分析天平（美國奧豪斯公司Ohaus）；KQ-500E臺式超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Milli-Q超純水儀(美國Millipore公司)。對照品沒食子酸，原兒茶酸，綠原酸購自中國食品藥品檢定研究院；新綠原酸、對羥基苯甲酸、氧化芍藥苷購自成都曼斯特生物科技有限公司；獐牙菜苷、隱綠原酸、芍藥內酯苷、芍藥苷、蘆丁購自北京賽百草科技有限公司，五沒食子酰葡萄糖、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C購自上海TAUTO公司。抗感顆粒，規(guī)格5g/袋，收集3個不同生產企業(yè)6批的樣品：S1(120501)，S2(121102)，S3(130408)，S4(131203)，S5(140209

38、)，S6(141204)。乙腈、甲醇及甲酸(色譜級，德國Merck公司)，水為Milli-Q超純水，其余試劑均為分析純。方法與結果色譜條件 色譜柱：Ultimate C18（150 mm4.6 mm，5 m），流動相：乙腈（B）-0.1%甲酸水（A）梯度洗脫，0-10 min A 97%90%，10-20 min A 90%81%，20-35 min A 81%80%，35-39 min A 80%74%，39-45 min A 97%97%。柱溫：25 ；流速：0.8 mL/min，進樣量：10 L。該色譜條件下15個待測成分均基線分離，色譜圖見圖1。注：1. 沒食子酸(Gallic aci

39、d); 2. 新綠原酸(Neochlorogenic acid); 3. 原兒茶酸(Protocatechuic acid); 4. 對羥基苯甲酸(p-hydroxybenzoic acid); 5. 氧化芍藥苷(Oxypaeoniflora); 6. 綠原酸(Chlorogenic acid); 7. 獐牙菜苷(Sweroside); 8. 隱綠原酸(Cryptochlorogenic acid); 9. 芍藥內酯苷(Albiflorin); 10. 芍藥苷(Paeoniflorin); 11. 蘆丁(Rutin); 12. 五沒食子酰葡萄糖(Pentagalloylglucose); 13

40、. 異綠原酸B(Isochlorogenic acid B); 14. 異綠原酸A(Isochlorogenic acid A); 15. 異綠原酸C(Isochlorogenic acid C)圖 1 混合對照品（A）、抗感顆粒樣品（B）、金銀花陰性樣品（C）、赤芍陰性樣品（D）、綿馬貫眾陰性樣品（E）的HPLC-DAD色譜圖Fig. 1 HPLC-DAD chromatograms of reference substances and KangGan granules 溶液的制備供試品溶液制備精密稱取本品粉末1.0 g于50 mL容量瓶中，加入30%甲醇約40 mL，超聲處理30分鐘(功

41、率250 W，頻率50 kHz)，靜置，放冷，30%甲醇定容，搖勻后稍靜置，離心，取上清液通過0.22 m微孔濾膜，取續(xù)濾液，即為供試品試液。對照品溶液制備 分別取對照品沒食子酸、新綠原酸、原兒茶酸、對羥基苯甲酸、氧化芍藥苷、綠原酸、獐牙菜苷、隱綠原酸、芍藥內酯苷、芍藥苷、蘆丁、五沒食子酰葡萄糖、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C，精密稱定，分別加入甲醇制備成含量為0.614 mg/mL，1.153 mg/mL，0.333 mg/mL，0.572 mg/mL，0.308 mg/mL，1.980 mg/mL，0.429 mg/mL，0.618mg/mL，1.54 mg/mL，0.598 mg/m

42、L，0.146 mg/mL，1.95 mg/mL，0.826 mg/mL，1.395 mg/mL，1.520 mg/mL的單一對照品儲備液。其余不同質量濃度的混合對照品溶液由30%甲醇稀釋儲備液配置得到。陰性樣品對照溶液制備赤芍陰性：按照抗感顆粒處方量取綿馬貫眾、金銀花，按照處方工藝制成缺赤芍的抗感顆粒，按“2.2.1”項下供試品制備方法制備得赤芍陰性樣品溶液。金銀花陰性：按照抗感顆粒處方量取綿馬貫眾、赤芍，按照處方工藝制成缺金銀花的抗感顆粒，按 “2.2.1”項下供試品制備方法制備得金銀花陰性樣品溶液。綿馬貫眾陰性：按照抗感顆粒處方量取赤芍、金銀花，處方工藝制成缺綿馬貫眾的抗感顆粒，按“2.

43、2.1”項下供試品制備方法制備得綿馬貫眾陰性樣品溶液。HPLC-DAD定量方法學驗證系統(tǒng)適應性及專屬性試驗分別精密吸取混合對照品溶液、供試品溶液及陰性樣品溶液各10 L，在“2.1”色譜條件下分析，沒食子酸、新綠原酸、原兒茶酸、對羥基苯甲酸、氧化芍藥苷、綠原酸、獐牙菜苷、隱綠原酸、芍藥內酯苷、芍藥苷、蘆丁、五沒食子酰葡萄糖、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C 15個分析物在相應波長下測定，結果顯示，相鄰色譜峰的分離度均大于1.5，拖尾因子在0.90-1.10，理論塔板數以各色譜峰計均在10 000以上。而陰性樣品在各色譜峰的位置上未見干擾，說明其他組分不影響15個成分的測定，說明該方法專屬性良

44、好。線性和范圍考察依據“2.2.2”項下方法制備的各對照品儲備液，分別用30%甲醇稀釋，配制成系列梯度濃度的對照品混合溶液。精密吸取10 L，依次注入液相色譜儀，在“2.1”項色譜條件下測定峰面積，記錄色譜圖。以對照品峰面積為縱坐標（Y），分析物濃度（X）為橫坐標，繪制標準曲線，得出線性回歸方程和相關系數，結果見表1。表 1 抗感顆粒15個分析物的回歸方程Tab. 1 Calibration curves, linear ranges, of 15 detected compounds of KangGan granulesAnalytesCalibration curveslinear ra

45、nges (gmL-1)linear relationship (r)沒食子酸Y = 10787X 982.968.01-160.271.000 0原兒茶酸Y= 21434X + 168.250.05-8.010.999 5新綠原酸Y = 6417.6X - 47.5940.40-8.010.999 9對羥基苯甲酸Y = 48573X- 24.3220.05-8.020.999 4氧化芍藥苷Y = 7028.7X + 18.7791.00-19.001.000 0綠原酸Y= 6797.0 X - 150.104.02-80.401.000 0獐牙菜苷Y = 4966.0X - 59.4670.

46、40-8.010.999 2隱綠原酸Y = 5904.3X + 33.3630.62-12.420.999 9芍藥內酯苷Y = 737.17X + 81.8592.43-24.320.999 6芍藥苷Y= 797.23X - 2236.917.97-359.490.999 9蘆丁Y = 11567X - 127.840.40-8.000.999 8五沒食子酰葡萄糖Y = 3817.7X - 189067.99-159.870.996 9異綠原酸BY = 8990.2X - 523.080.30-5.980.999 6異綠原酸AY = 8709.3X - 608.180.79-15.841.00

47、0 0異綠原酸CY = 10272X - 2461.80.80-16.000.999 8精密度試驗取同份對照品中分別精密吸取混合溶液10 L，在“2.1”項色譜條件下1天內連續(xù)6次進樣，連續(xù)測定6天，分別記錄15個分析物的峰面積，計算峰面積的RSD，結果表明日內、日間精密度良好，均小于2.0%，數據記錄見表2。穩(wěn)定性試驗取本品依法制備供品溶液，分別于0、2、6、10、12和24 h進行分析，記錄15個分析物峰面積，計算RSD，結果均小于3.95%，見表2，表明供試品溶液在24 h內穩(wěn)定。重復性試驗精密稱取同一批號的抗感顆粒樣品6份，依法制備供試品溶液，測定15個分析物的峰面積，計算含量，RSD

48、均小于5.0%，見表2，結果說明本方法重復性良好。表 2 供試品15個分析物的精密度、重復性、穩(wěn)定性試驗Tab. 2 Precision, repeatability, stability of 15 detected compounds.AnalytesIntra-day(RSD)Inter-day(RSD)Repeatability (RSD)Stability(RSD)沒食子酸0.230.040.780.87原兒茶酸1.400.803.212.51新綠原酸0.961.122.931.17對羥基苯甲酸1.550.574.802.37氧化芍藥苷0.390.241.461.76綠原酸0.190

49、.212.961.06獐牙菜苷1.410.842.863.94隱綠原酸1.001.062.342.81芍藥內酯苷1.382.001.851.81芍藥苷0.910.062.160.82蘆丁0.891.173.973.25五沒食子酰葡萄糖0.290.213.482.38異綠原酸B0.981.252.061.38異綠原酸A0.580.681.401.80異綠原酸C0.861.001.390.67回收率試驗精密稱取“2.3.5”項條件下已知含量的供試品6份，約0.50 g，加入近似等量的15個對照品，依法制備供試品溶液，測定含量，見表3，結果表明本方法的準確度良好。表 3 抗感顆粒中15個分析物的回收

50、率試驗結果(n=6)Tab. 3 Recoveries of 15 detected compounds (n = 6)Analytesoriginal(mg)Added (mg)Detected (mg)Recovery (%)RSD(%)沒食子酸3.8723.8017.7510.217102.12.80原兒茶酸0.011220.0100.0210.001102.13.31新綠原酸0.095450.1010.1940.00698.893.03對羥基苯甲酸0.0032520.0030.0060.00099.464.95氧化芍藥苷0.021280.0190.040.00195.732.50綠原酸

51、0.39710.4050.8010.02499.693.06獐牙菜苷0.0061970.0060.0120.000103.92.95隱綠原酸0.092670.0910.1870.005104.32.42芍藥內酯苷0.20930.2010.4170.008103.91.90芍藥苷4.1044.0018.2930.185104.72.23蘆丁0.0099710.0100.0200.00196.654.10五沒食子酰葡萄糖0.14100.1410.2820.010100.43.65異綠原酸B0.087820.0910.1810.004103.02.12異綠原酸A0.045400.0450.0890.

52、00297.922.45異綠原酸C0.067290.0650.1300.00496.343.43樣品含量測定分別精密稱取不同批次的抗感顆粒樣品粉末1.00 g，按“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，進樣10 L，按“2.1”項色譜條件下測定各峰面積，根據標準曲線計算樣品含量，結果見表4。表 4 抗感顆粒中15個分析物含量（n=3，mg/g） Tab. 4 Determination of 15 detected compounds in KangGan granules samplesAnalytes / SampleS1S2S3S4S5S6Ave.（mg/g）沒食子酸12.3512.347

53、.6137.4439.5679.4769.800原兒茶酸0.05770.06370.07360.07400.07950.06600.0691新綠原酸0.27450.29200.50340.51480.47040.46430.4199對羥基苯甲酸0.01310.01240.03810.04420.02370.01720.0248氧化芍藥苷0.08370.08680.39740.43280.33060.28140.2688綠原酸1.3191.3053.1453.1802.3652.3522.278獐牙菜苷0.02720.04130.03820.10610.02690.03220.0453隱綠原酸0

54、.22940.23220.52670.56800.45920.45550.4118芍藥內酯苷2.3412.2641.2901.1681.1671.5631.632芍藥苷16.2714.6919.6918.8816.0116.0616.93蘆丁0.04170.04440.01030.02800.01910.02670.0284五沒食子酰葡萄糖3.4503.4210.60160.52690.71712.1451.810異綠原酸B0.19940.21670.34340.32870.32180.34280.2921異綠原酸A0.24680.25320.30720.23990.26970.53920.3

55、093異綠原酸C0.24890.24690.41970.36310.36170.55010.3651討論提取條件選擇由于中藥復方化學成分具復雜多樣性，為了優(yōu)化抗感顆粒的提取條件，本文首先考察比較了回流、超聲、索氏提取法，結果表明回流和超聲法優(yōu)于索氏提取法，并且回流和超聲提取法15個成分基本一致，考慮超聲提取方法具簡單、快速、高效的特點，因此最終采用超聲提取法。其次，本研究通過考察不同提取溶劑對15個成分提取的影響，比較了乙腈、甲醇、乙醇不同溶劑提取，結果表明甲醇優(yōu)于乙腈及乙醇。第三，分別考察提取因素包括甲醇濃度(10%、30%、50%、70%、100%甲醇)，提取時間（15、30、45、60

56、min），溶劑倍量（10、25、50、100倍量）和提取次數（1、2、3次）。最終優(yōu)化結果表明，以30%甲醇作為提取溶劑時，15個待測物的響應值總體上優(yōu)于其它溶劑（10%甲醇、50%甲醇、100%甲醇）；超聲提取時間考察了15 min、30 min、45 min、60 min，發(fā)現15 min提取不夠充分，30 min、45 min、60 min提取結果無顯著性差異，故認為超聲提取30 min即可，次數和倍量考察結果表明以50倍量的提取溶劑，提取1次即可。綜上所述，提取條件選擇以30%甲醇作為提取溶劑，50倍量溶劑超聲提取30 min，提取1次。色譜條件選擇由于新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸及異綠

57、原酸A,B,C等均為同分異構體，色譜峰容易重疊，對各成分的分離造成一定困難。本實驗通過比較Inetsil-ODS-SP C18(4.6 mm 250 mm, 5 m)、Hypersil ODS ( 4. 6 250 mm, 5 m )、Ultimate C18（150 mm4.6 mm，5 m）色譜柱對抗感顆粒15個活性成分的分離效果，最終選擇Ultimate C18（150 mm4.6 mm，5 m）色譜柱。同時，本實驗也對流動相系統(tǒng)的選擇進行了考察，實驗先后試用了4 種流動相系統(tǒng)：乙腈-水，甲醇-水，乙腈-0.1%甲酸，甲醇-0.1%甲酸，結果表明，乙腈系統(tǒng)優(yōu)于甲醇系統(tǒng)，且以0.1%甲酸為

58、水相時，可以進一步改善各成分峰的峰形，效果最佳。不同化合物最大吸收波長不同，因此檢測時需要進行不同檢測化合物的波長切換：經比較沒食子酸(1)，新綠原酸(2)，原兒茶酸(3)，對羥基苯甲酸(4)，氧化芍藥苷(5)、綠原酸(6)、隱綠原酸(8)在280 nm下有較好的吸收，而獐牙菜苷(7)、芍藥內酯苷(9)、芍藥苷(10)最大吸收波長為232 nm，蘆丁(11)、五沒食子酰葡萄糖(12)、異綠原酸B(13)、異綠原酸A(14)及異綠原酸C(15)在320 nm處吸收較好。綜合考慮今后多組分同時測定的實際應用，在020.5 min采用波長280 nm下采集（檢測1-6號化合物），20.526 min

59、采用232 nm測定（檢測7-10號化合物），2645 min 采用320 nm測定（檢測11-15號化合物）。測定指標選擇金銀花主要有效成分為有機酸類，如異綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸，具有抗炎、抗菌的藥理作用7。其另一種有效成分為環(huán)烯醚萜苷類，如獐牙菜苷也具有抗炎、抗菌、抗病毒的作用8，故也應作為抗感顆粒中金銀花含量測定的指標之一。此外，蘆丁是金銀花中黃酮類的主要成分，具有抗炎、抗菌作用9，故認為應選擇作為抗感顆粒中金銀花含量測定指標。芍藥苷、氧化芍藥苷、芍藥內酯苷是赤芍的主要單萜苷類的代表性有效成分，具有調節(jié)免疫、抗炎等作用10，因此選擇這三個化合物應該選擇作為抗感顆粒中赤芍含量測定的指標。另外，赤芍中含有的酚酸類成分如沒食子酸、五沒食子酰葡萄糖同樣也具有消炎、抗感冒、抗氧化等功效11-12，因此將沒食子酸、五沒食子酰葡萄糖作為抗感顆粒中赤芍的另一類含量測定的指標。對于綿馬貫眾化學成分研究報道較少，其有機酸類成分原兒茶酸和對羥基苯甲酸是其有機酸的主要成分13，也具有抗炎和抗氧化等作用，可能也是抗感顆粒的藥效成分之一，因此選擇原兒茶酸和對羥基苯甲酸作為抗感顆粒中綿馬貫眾的含量測定指標。樣品成分測定結果分析6批抗感顆粒含量測定結果表明，各廠家批次15個成分含量差異較大。首先，金銀花中主要的綠原酸類成分，如綠原酸在S1-S2含量僅為1.3051.319 mg/g，而在S3-