藥物的抗病毒實驗課件

1、第六節(jié) 藥物的抗病毒實驗一、目的和要求1.掌握藥物體外抗病毒的實驗方法和操作步驟。2.熟悉病毒感染性動物模型的建立和評價。媽液啥輿姑茸跪香孩贊匙陛廓熟露執(zhí)亭蒙淀冠秉客瞳烤跪怪葛嬸痰矣遷羹第六節(jié)藥物的抗病毒實驗第六節(jié)藥物的抗病毒實驗第1頁，共42頁。二、內容（一）原理 病毒是一類結構簡單、非細胞形態(tài)的專性細胞內寄生的微生物，必須在易感的活的動物、雞胚或細胞內才能進行復制增殖。因此可用動物、雞胚或細胞來進行病毒培養(yǎng)和藥物的抗病毒試驗?？赏ㄟ^觀察細胞培養(yǎng)液酸堿度的變化、病毒致細胞病變效應（CPE）、病毒滴度（PFU）改變、病毒基因組mRNA水平變化、雞胚尿囊液或動物血清等相應指標的改變，來判斷藥物的

2、抗病毒試驗效果。榔頁韭撬霞痊分約塘曝芭綁磊眺軸柄文擦撼蒸魂霄稈睡甲蟹嫩?？枭吣诹?jié)藥物的抗病毒實驗第六節(jié)藥物的抗病毒實驗第2頁，共42頁。（二）材料1. 910 d日齡雞胚，殼白凈且厚薄均勻的雞卵（萊亨雞的受精卵由于卵殼薄，在孵育過程中便于檢查，為首選）2. Hep-2細胞或MDCK細胞3.病毒：如IFV（FM1株）、RSV（Long株）4.藥物：試驗藥物，陽性對照藥5.動物：小鼠等（三）操作方法亨卷鬧毖窟歡泉屬哉饒異廉郡只辣管橫試遏涉漚瘍介良薦舀爆顧溝鐐如吹第六節(jié)藥物的抗病毒實驗第六節(jié)藥物的抗病毒實驗第3頁，共42頁。 雞胚培養(yǎng)為常用的病毒培養(yǎng)法之一，目前主要用于痘類病毒、粘病毒、皰疹病

3、毒的分離、鑒定、制備抗原和疫苗的生產(chǎn)等。1.接種方法病毒的雞胚培養(yǎng)法主要有四種接種途徑，即尿囊腔、絨毛尿囊膜、羊膜腔和卵黃囊，不同的病毒應選擇各自適宜的接種途徑，并根據(jù)接種途徑確定雞胚的孵育日齡（見表）。下面將以流感病毒為例進行說明。一）雞胚法肋征蓮停澤顏種洶冗窒槳鉗麓鑒擄惦汾吝研頁俄侗賄綿理淫污癰躊露徐歧第六節(jié)藥物的抗病毒實驗第六節(jié)藥物的抗病毒實驗第4頁，共42頁。表6-1雞胚孵育日齡及接種途徑選擇接種病毒名稱接種部位雞胚日齡收獲材料痘類病毒、單純皰疹病毒絨毛尿囊膜9-10絨毛尿囊膜流感病毒、腮腺炎病毒尿囊腔9-11尿囊液流感病毒初次分離羊膜腔12-14羊水某些嗜神經(jīng)性病毒卵黃囊5-6卵黃液

4、亭苛彈溪虛夾扒誼疼泡疾罷壇牽臂磕骨糧劃歐辮怠寂灌鍺牟壺獵絆腮氰膊第六節(jié)藥物的抗病毒實驗第六節(jié)藥物的抗病毒實驗第5頁，共42頁。2. IFV-FM1的50%雞胚感染量（EID50）測定 用生理鹽水將病毒作10倍系列稀釋，分別接種雞胚，0.1ml /胚，同時設正常對照，共6組，每組5胚。35孵育72 h，置4冰箱過夜，收集尿囊液做血凝試驗，按Reed-Muench法計算FM1的EID50。窺嘿眾米臣扔并豪矚趁創(chuàng)淳煮雇內屎貼陜摧炭幅袋減摸蘋縱梳舶漾嫂竣蔡第六節(jié)藥物的抗病毒實驗第六節(jié)藥物的抗病毒實驗第6頁，共42頁。3. 藥物對雞胚的毒性作用 選用健康的911日齡雞胚，消毒備用。將受試藥和對照藥作10

5、倍系列稀釋56個濃度，如100mg/ml、10mg/ml、1mg/ml、100g/ml、10g/ml，每個濃度接種5胚，0.25ml /胚。35培養(yǎng)5 d后觀察結果（死亡/存活）。確定兩種藥物對雞胚的最大無毒劑量（TC0），用于正式實驗。衫熏況婦歌繁喘爪慷苑升齲姨謀擺瞻榆燼襯絨策脈憫測種坍錯衍挽鍋駿鉀第六節(jié)藥物的抗病毒實驗第六節(jié)藥物的抗病毒實驗第7頁，共42頁。4. 藥物對FM1的抑制作用 雞胚隨機分為14組，每組5胚，即試驗藥的六個劑量組（從TC0開始作10倍系列稀釋）、陽性對照藥六個劑量組（同前）、生理鹽水和病毒對照組。將不同濃度的藥液注入雞胚中，0.25ml /胚，30 min后經(jīng)相同途

6、徑注入100 EID50病毒0.1ml，對照組以生理鹽水代替。35溫箱孵育5 d。收獲尿囊液，測其血凝效價，以能抑制32倍以上所注射的最小藥物量，即為其最小抑制劑量（MIC）。校煌稀注裙爾擬劈寬甘造撥香購掂海倔程蓉扎輕釀鼠搐夯胖羊刷椎獅毋愈第六節(jié)藥物的抗病毒實驗第六節(jié)藥物的抗病毒實驗第8頁，共42頁。4.1雞胚接種（1）孵育910 d左右的雞胚，在照蛋燈下用蠟筆標出氣室和胎位。（2）雞胚直立于固定架上，氣室端向上，按常規(guī)以碘酒，酒精消毒。（3）用磨蛋器在氣室中央磨一小孔，再用碘酒擦拭。（4）用lml注射器吸取病毒懸液，針頭從氣室小孔刺入，沿胚胎的長軸刺入0.51.0cm深度；此時針頭已在尿囊腔

7、中，注入0.2ml病毒懸液。（5）拔出針頭，用鑷子將膠布沾酒精燒灼后將小孔封閉，置于3536溫箱內培養(yǎng)二天，每天翻動兩次，用照蛋燈檢視一次。培養(yǎng)二天后。置 -20冰箱2 h后，無菌操作收獲尿囊液。篆擒權眷怨業(yè)壞厲譴梆滇廢法妹灶夫兄蜒晃斂棗手巴丸戌謎摔芯摘劣渠舀第六節(jié)藥物的抗病毒實驗第六節(jié)藥物的抗病毒實驗第9頁，共42頁。4.2尿囊液的收獲（1）從冰箱中取出雞胚，用碘酒，酒精消毒氣室部位。（2）用無菌鑷子除去膠布并去除氣室部分的卵殼。（3）用無菌的毛細吸管插入尿囊腔中輕輕吸取尿囊液（避免血管破裂），置于無菌試管中。（4）獲得的尿囊液取一部分做血凝和血凝抑制試驗（定性），判斷病毒的增殖情況并對病毒

8、進行鑒定；同時做無菌實驗。楚楞爵瑟晤掌臂勉戒瘧桔惰斡票瀕泅易謾并盔雌向辭豢孺夫菱退修診繼攙第六節(jié)藥物的抗病毒實驗第六節(jié)藥物的抗病毒實驗第10頁，共42頁。4.3血凝和血凝抑制實驗（1）血凝實驗血凝實驗的具體操作方法，參照本教材的第四章第四節(jié)內容：病毒的分離培養(yǎng)鑒定和血清學檢測。 結果判斷 以“+”號多少表示血凝程度： + 100的RBC發(fā)生血凝，形成花邊拉網(wǎng)狀，紅細胞呈薄層均勻鋪于板孔底，呈細沙狀或薄膜狀； + 75的RBC發(fā)生血凝，紅細胞雖鋪于孔底，呈細沙狀，但邊緣不整有下沉趨勢； + 50的RBC發(fā)生血凝，紅細胞在孔底呈一環(huán)狀，四周有小凝集塊； + 25的RBC發(fā)生血凝，紅細胞在孔底沉聚呈

9、小圓點，邊緣不光滑，周圍有小凝集塊； - 100的RBC沉積，紅細胞于孔底呈一小圓點，邊緣光滑整齊，無凝集現(xiàn)象。以使50的RBC發(fā)生凝集的最高稀釋倍數(shù)，為病毒的血凝效價。計算藥物的MIC。梗攀迪煽桔鏟鴨事垢墻體擄絢非蒼絨僅騷茵帆綢蓬伸紉漬遷隅沸頗醛級宏第六節(jié)藥物的抗病毒實驗第六節(jié)藥物的抗病毒實驗第11頁，共42頁。（2）病毒血凝抑制實驗 根據(jù)血凝試驗滴定的病毒血凝效價，以“2”的凝集者含有1個病毒血凝單位。如流感病毒的血凝效價為1:160，即病毒液稀釋至1:160時，每0.25ml中含1個血凝單位，若要將0.25ml病毒液配制成含4個血凝單位時，應稀釋成1:（1604），即1:40稀釋。在做血

10、凝抑制試驗時用4個血凝單位。 將病毒液配成4個血凝單位。血凝抑制實驗的方法，參照本教材的第四章第四節(jié)內容：病毒的分離培養(yǎng)鑒定和血清學檢測。叭薩守們蓖葛奮扭擂勞忠嗚彤南公旭氰械糕儀床鼻爬鑒閻瘦噓形散費楚兒第六節(jié)藥物的抗病毒實驗第六節(jié)藥物的抗病毒實驗第12頁，共42頁。 主要根據(jù)細胞對病毒的敏感性選擇適宜細胞株。人類病毒用人或猴的組織較敏感，因此，研究人的病毒性疾病常用人胚腎、人胚肺或人羊膜細胞。組織培養(yǎng)的方法中以單層細胞培養(yǎng)是最常用的方法，它又有原代和次代細胞培養(yǎng)、二倍體細胞株和傳代細胞系三種類型。本實驗僅介紹對傳代細胞的操作方法。二）細胞培養(yǎng)法事股薪唁息筷穆逼閻蛇憐岔湛遣寐吉癌筒丑叢旺譯坤綴朱

11、搜鞠瞇忌孟洼甘第六節(jié)藥物的抗病毒實驗第六節(jié)藥物的抗病毒實驗第13頁，共42頁。1.病毒TCID50滴定（1）原理 多數(shù)病毒感染體外培養(yǎng)的細胞后，常引起細胞形態(tài)學改變，如細胞團縮、裂解和細胞腫大等，這種改變稱為病毒致病變效應（cytopathic effect，CPE），可以直接通過顯微鏡觀察，亦可通過染色得以識別和判斷。CPE的程度可間接反映病毒的毒力，因此利用這種特征可以用來測定病毒的毒力。即能在半數(shù)細胞培養(yǎng)板孔或試管內引起細胞發(fā)生病變所需的病毒量，定義為病毒的50組織細胞感染指數(shù)（50tissue culture infectious dose，TCID50）。在從事藥物的抗病毒試驗中，常

12、用100 TCID50的病毒感染量進行。撕吻銳踐陋瘴脊麗郊糕熟窩欠愚扣歇腿喘鶴詩苗哺啤弗弊凳酪蕭墓心洲祁第六節(jié)藥物的抗病毒實驗第六節(jié)藥物的抗病毒實驗第14頁，共42頁。 測定時，首先在微量細胞板上培養(yǎng)敏感細胞，待細胞貼壁形成單層，棄上清。將待測病毒用維持液做連續(xù)10倍系列稀釋后加入細胞單層，逐日觀察，直至病毒產(chǎn)生的CPE不再進展為止。具體時間根據(jù)病毒的增殖特點而定，如腸道病毒增殖迅速，一般48 h即可；RSV、VSV增殖也較快，因此4872 h也可以觀察、染色、計算?；钫`逗砷全個托肇別身媚舜傻娶渭碉販宙箍予漳呀簡耽級江辨僅嫡郭紹翱第六節(jié)藥物的抗病毒實驗第六節(jié)藥物的抗病毒實驗第15頁，共42頁。

13、（2）實驗材料細胞：MDCK細胞或Hep-2細胞，或其它敏感細胞。病毒：流感病毒（IFV）或呼吸道合胞病毒（RSV）。試劑：DMEM細胞培養(yǎng)基，新生小牛血清，胰蛋白酶或VTP消化液，PBS，青霉素100U/ml、鏈霉素100 U/ml，MTT (4,5-二甲基噻唑-2,5-二苯基四唑溴化物)，結晶紫染液等。材料：細胞培養(yǎng)板（1塊/組），tip頭（2盒/排），微量移液器，5ml或10ml吸管（2支/組），青霉素瓶帶塞（10個/組），酒精缸，鑷子（2個/組），1ml注射器，毛細吸管等。置萄懦姐燭營拍雨弛擻閘刑鷹氫鋤唇啃晉弟蘆榆礬曳捐侍窯仗鈞乒任容繩第六節(jié)藥物的抗病毒實驗第六節(jié)藥物的抗病毒實驗第16

14、頁，共42頁。（3）操作步驟1）制備細胞將細胞生長面朝上，輕輕倒掉瓶中培養(yǎng)液，用PBS小心洗滌2次，注意吸管尖頭不要伸到細胞瓶中。用上述吸管吸取1ml VTP加入細胞瓶中，鋪滿整個細胞生長面即可；室溫或手握住消化，約35min。當細胞胞質回縮、細胞間隙增大呈拉網(wǎng)狀后，即可停止消化，盡可能棄盡消化液，繼續(xù)利用殘余的消化液消化，直至細胞大部分易在外力作用下從細胞瓶表面脫落下來為止。沃庭兵傷地示艷寢孫佰敞況得吏褒姆氨考目嚏亞粵笑吊墅祥傘葬諷臟逆憐第六節(jié)藥物的抗病毒實驗第六節(jié)藥物的抗病毒實驗第17頁，共42頁。加入適量營養(yǎng)液到細胞瓶中，用小頭吸管吹打瓶壁細胞以及脫落細胞充分使細胞均勻，吹打時動作要輕柔

15、不要用力過猛，盡可能不要出現(xiàn)泡沫。吸一滴細胞懸液于Ep管中。計數(shù)：用吸管吹打細胞懸液，取少許細胞懸液與等量0.04臺盼蘭混勻，在計數(shù)板上蓋玻片的一側加該細胞懸液，加樣量不要溢出蓋玻片，也不要過少或帶氣泡。當細胞密度為106/ml時即可。 一瓶細胞消化后加入適量營養(yǎng)液制成所需細胞懸液，濃度約為1106/ml。用微量移液器將細胞懸液加入40孔板微孔中，每孔100l，37、5%CO2孵育箱培養(yǎng)24 h，形成單層后，做病毒滴定用。城嫁航得春廂叮揣剮工鋒娶轟斥昆輔晝浩甕閃焉事傅陌田立鈉至霞坑甘支第六節(jié)藥物的抗病毒實驗第六節(jié)藥物的抗病毒實驗第18頁，共42頁。2）50%組織細胞感染量（TCID50）測定稀

16、釋病毒液：取無菌青霉素瓶9支，各管分別加3%小牛血清的維持液2.7ml，然后向第一管加IFV病毒液0.3ml，反復吹吸混合三次，從第一管內吸液0.3ml加入第二管內，反復混合三次，從第二管內吸液0.3ml加入第三管內，反復混合三次，依此類推將待測的病毒液做連續(xù)10倍稀釋，使病毒稀釋為10-1，10-2，10-3 10-9。蹭倘毋奸音哥徹嘯根子卻侵削峭暢的倫嘉抹竣霓帝反河美膠屢嗎誕紳答歲第六節(jié)藥物的抗病毒實驗第六節(jié)藥物的抗病毒實驗第19頁，共42頁。病毒接種：將長好單層細胞的培養(yǎng)板各孔細胞液全部傾棄，用微量移液器把各稀釋度的IFV病毒從低濃度開始依次加入各微孔中，每稀釋度平行加2孔，每孔100l

17、。細胞對照孔不加病毒液，只加維持液。置37、5%CO2孵育箱中孵育。結果觀察：于孵育后18、24、36、48、72h在倒置顯微鏡下觀察CPE，病毒可引起細胞圓縮、堆聚及脫落等現(xiàn)象?！?”表示細胞正常；“+”表示有25%細胞產(chǎn)生病變、圓縮、破碎脫落；“2+”有50%細胞產(chǎn)生病變；“3+”有75%細胞產(chǎn)生病變；“4+”有75%以上細胞產(chǎn)生病變（實驗時，有的觀察24h48 h即可染色計算；或逐日觀察CPE，直至病毒產(chǎn)生的CPE不再進展為止）。惋恍摯怒劈闡產(chǎn)恐師足誤冤此矯獵臟置恿甄鉗洗滔較喜圍筏銀膀猿啃裝恕第六節(jié)藥物的抗病毒實驗第六節(jié)藥物的抗病毒實驗第20頁，共42頁。3）按Reed-Muench法計

18、算TCID50，參見下表：10-38/810010/1010010-42/8262/82510-50/80140/14010-60/80220/22010-70/80300/30010-80/80380/380累積數(shù)（孔）病變細胞孔病毒稀釋度 病變孔數(shù)/接種孔數(shù)有病變無病變比例百分比%材走長腎蔑終度污睡讓掘肖健伶鯨鈍匿龍抹翠粱脾資滔凌酗憑沙棄鯨撒徘第六節(jié)藥物的抗病毒實驗第六節(jié)藥物的抗病毒實驗第21頁，共42頁。 按表中可見，10-3稀釋的病變高于50%；10-4稀釋的病變低于50%；50%病變分布于10-3與10-4之間，計算公式如下： 高于50%病變率 -（50%） 距離比例= - 高于50

19、%的病變率-低于50%的病變率 lg稀釋倍數(shù) 100-50 = - 100-25 lg10= -0.67lg TCID50 =高于50%病變的低稀釋度對數(shù)+距離比= -3+(-0.67)=-3.67 即1個TCID50=10-3.67，查0.67的反對數(shù)為4.68，即病毒做4.68103倍稀釋時取0.1ml接種細胞，可使50%細胞產(chǎn)生病變。死鄙阻促濱炸繭攙圾慧豪渤卜空蹋逞童捷蘭妮傻線恐娛游廂灑讀火劇勒英第六節(jié)藥物的抗病毒實驗第六節(jié)藥物的抗病毒實驗第22頁，共42頁。附錄：如何計算200個TCID50？4.68103200=23.4，將病毒作23.4倍稀釋時即得200個TCID50。 按計算結果

20、，用100個TCID50病毒進行藥物的體外抗病毒試驗。腥蔣寥慢壘鄭破邢節(jié)史骨燥住咀臻供借寅瑰酵辦稽窄象榜寬愚嚇南端攙草第六節(jié)藥物的抗病毒實驗第六節(jié)藥物的抗病毒實驗第23頁，共42頁。2.病毒增殖及病毒感染單位量測定2.1病毒增殖 將凍存的病毒株復蘇后接種于敏感細胞進行增殖，23 d后出現(xiàn)典型細胞病變，待病變達8090時收獲病毒。反復凍融3次并低速離心取上清，分裝后用空斑形成單位實驗（plaque forming unit, PFU）測定病毒的感染量，保存于-80備用。在進行藥物的抗病毒試驗中，亦可用該實驗測定藥物對病毒增殖的影響，而且結果可能更準確、可靠。吏穗膨痕徊干跌域肝僻廄糞姿羚企拉誣紐痢

21、蔣汝陪諒賀冉怪燼骸刷笑列財?shù)诹?jié)藥物的抗病毒實驗第六節(jié)藥物的抗病毒實驗第24頁，共42頁。2.2病毒感染單位量測定用 PFU 表示。 以5.0105 /ml的密度接種敏感細胞于6孔細胞板中。置37、5CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，使其24 h內長成單層； 在冰盤上操作，用維持液將病毒作10倍連續(xù)系列稀釋（10-110-8）（操作如下圖所示）；唯誦匡鏈燈侖游冠革島紳虛居廄坊酞銅置綏擱窯柳尼檔銑奄娟析忽叼攏榜第六節(jié)藥物的抗病毒實驗第六節(jié)藥物的抗病毒實驗第25頁，共42頁。注：即在一系列2ml的Ep管中先加入1.8ml維持液，取0.2ml病毒加入第一只Ep管中，充分混勻后病毒稀釋度為10-1，取混合后的0

22、.2ml病毒懸液加入第二只Ep管中作為稀釋度10-2，依此類推作系列稀釋，則得到連續(xù)10倍稀釋的病毒懸液。嗣詣朋脹擅蕾吏亨喇繩蓮往兢抽嚷鹼弊鞏忻瑣耗幀堪媚釋量愧雷慎課席液第六節(jié)藥物的抗病毒實驗第六節(jié)藥物的抗病毒實驗第26頁，共42頁。 棄去細胞培養(yǎng)板中各孔中的營養(yǎng)液，每孔接種相應稀釋度的病毒懸液0.5ml，每個稀釋度重復3孔。37吸附2 h，每15min搖動數(shù)下以保證病毒吸附分布均勻； 棄去各孔中的病毒液，PBS輕輕洗滌一次。每孔加入2ml覆蓋層（含6新生牛血清的DMEM與1.5瓊脂糖等體積混勻，配好后立即使用，以免凝固），水平放置15min使其凝固；艙騎瑟謠落艇典瞥配船正痢哆孽撞但你枕寢馱擾

23、裔渙瘤境咋辨建嫡數(shù)軀補第六節(jié)藥物的抗病毒實驗第六節(jié)藥物的抗病毒實驗第27頁，共42頁。 33，5CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d。剔除覆蓋層，每孔加入1ml 0.5結晶紫染色10min，自來水沖洗后選擇空斑數(shù)清晰且易于分辨的稀釋度計數(shù)空斑，根據(jù)空斑數(shù)計算病毒的PFU。下圖顯示的是RSV的空斑形成實驗結果。PFU的計算方法： ab PFU v（PFU：空斑形成形成單位/ml； a：空斑均數(shù)；b：病毒稀釋度的倒數(shù)；v：病毒量/ml）芹粕鄉(xiāng)酋子撓磋皖肛砰駭茶掘摔足洲鉀尺稀第去程軌置佯巍蘭耙澎饞倉苑第六節(jié)藥物的抗病毒實驗第六節(jié)藥物的抗病毒實驗第28頁，共42頁。1：正常對照；26：病毒稀釋度分別為 104

24、，105，106，107，108病毒的空斑形成實驗結果示意圖3 2 16 5 4銳敢失貝饅兜鬃耪鑰翻柞梗侵袋斬皮叼衙鞘涕姓盼措霹盒板娟哼瘸詐支憾第六節(jié)藥物的抗病毒實驗第六節(jié)藥物的抗病毒實驗第29頁，共42頁。2.藥物對細胞的毒性測定 已長成單層的細胞（96孔板），傾去培養(yǎng)液，用PBS洗滌2次，加入用無血清1640作連續(xù)10倍系列稀釋的受試藥物，100l/孔，每個濃度重復4孔，并設正常細胞對照。整個實驗重復3次。37、5%CO2孵箱中培養(yǎng)3 d，觀察細胞病變效應（CPE），按Reed-Muench法計算藥物的半數(shù)中毒濃度（TD50）和最大無毒濃度（TD0）。陽性對照藥的毒性測定，與受試藥物同法同

25、步在同一板中進行。凱鈔偉資熱餃黎造北躺詭事遣團內墟瘓待唐東龐代嘛候畫查撅滓洛譜鐳幀第六節(jié)藥物的抗病毒實驗第六節(jié)藥物的抗病毒實驗第30頁，共42頁。4.藥物的抗病毒實驗4.1微量細胞病變抑制法 已長成單層的細胞（96孔板），傾去培養(yǎng)液，用PBS洗2次，加入100 TCID50病毒，100l/孔，375%CO2下吸附2h，使病毒進入細胞內。棄病毒液，用DMEM液洗2次，洗去游離病毒。加入受試藥的TD0濃度作連續(xù)2倍系列稀釋的6個濃度，每個濃度均重復3孔，并分別設立細胞對照、病毒對照和空白對照孔，陽性對照藥同上。37、5%CO2下培養(yǎng)3 d，記錄CPE，按Reed-Muench法計算能抑制50%CP

26、E產(chǎn)生的藥物有效濃度（EC50）。整個實驗重復3次。秦旦樹齒百遭啼隅陣襯匹舅莢獰奄鎖謙掘攤改比伍戰(zhàn)諺鴦捎秘獵羔為闊锨第六節(jié)藥物的抗病毒實驗第六節(jié)藥物的抗病毒實驗第31頁，共42頁。4.2中性紅染色法 基本步驟同上，加入藥物培養(yǎng)3 d后待CPE不再進展時，棄維持液，用PBS洗2次，每孔加入0.2ml中性紅染液（0.04%），避光，37、5%CO2孵育1.5 h。棄染色液，用PBS洗2次，控干，每孔加入0.2ml的90%乙醇（無水乙醇：0.2M，pH4.2枸櫞酸緩沖液=9：1），室溫放置23 h，搖勻，以空白對照孔調零，在酶標儀546nm處比色，測定其吸光度A值。根據(jù)各組的平均A值，計算藥物的抑制

27、百分率，再按Reed-Muench法計算50%抑制濃度（IC50）等各項結果。整個實驗重復3次。 實驗組平均A值-病毒對照組平均A值抑制百分率 =細胞對照組平均A值-病毒對照組平均A值 100%渣促兢遍叔疆嘿蘑惕單織窿熟桑開著讓寅販快悟議航慧剁枯晝媽努照竣恐第六節(jié)藥物的抗病毒實驗第六節(jié)藥物的抗病毒實驗第32頁，共42頁。4.3 MTT法 基本步驟同上，當病毒對照組細胞CPE在(+ + +)(+ + + +)時棄培養(yǎng)液上清，每孔加入含5gL MTT的培養(yǎng)液50l，繼續(xù)培養(yǎng)23 h后棄去MTT上清，每孔加DMSO 100l，混勻5min后，用酶標儀測570nm波長處的吸光度A值。按下述公式計算藥物

28、對病毒的抑制率：病毒抑制率(%)=(藥物處理組A均值-病毒對照組A均值)/(細胞對照組A均值-病毒對照組A均值) 100%，結合細胞毒性實驗的結果，用統(tǒng)計軟件SPSS13.0的Probit回歸法，或按Reed-Muench法，計算受試藥的半數(shù)中毒濃度TD50和半數(shù)有效濃度EC50，并計算藥物的治療指數(shù)（TI）。紋嚙駝淹玖花晦吐牛逸湯燭元困伙梨媒榜廈于憎慧旅賣孔甭舵胰吝蹤甸酚第六節(jié)藥物的抗病毒實驗第六節(jié)藥物的抗病毒實驗第33頁，共42頁。4.4空斑抑制法 參照上述方法進行（略），與病毒對照組比較，計算藥物的50%抑制濃度IC50。4.4藥物對RSV侵入細胞的阻斷作用 根據(jù)藥物毒性實驗的結果，從藥

29、物的最大無毒濃度開始，將不同濃度受試藥100l預先處理細胞2 h, 以PBS洗滌2次后用100 TCID50 的病毒每孔100l攻擊,吸附2 h，每隔15min搖晃 1次，使病毒均勻吸附。棄病毒液,加100l細胞維持液，置37、5%CO2培養(yǎng)，每日觀察并記錄CPE。實驗設正常細胞對照組、病毒對照組、陽性對照組和藥物組。當病毒對照組CPE在75%100%時棄培養(yǎng)液上清，每孔加入含5gL MTT的培養(yǎng)液50l，繼續(xù)培養(yǎng)23h后棄去MTT上清，每孔加100l DMSO，混勻5min后，用酶標儀測490nm波長處的A值。按Reed-Muench法計算藥物的半數(shù)中毒濃度TD50和半數(shù)有效濃度EC50。照

30、驅審鉗蹈完擦吭梢雖夕歧臨垃扛廬玩瑣蝸盒綁個哀京菏佰程腕嘴扭綠硝第六節(jié)藥物的抗病毒實驗第六節(jié)藥物的抗病毒實驗第34頁，共42頁。4.5藥物對RSV的直接殺傷作用 根據(jù)藥物毒性實驗的結果，從藥物的最大無毒濃度開始，將不同濃度的含藥維持液與100l的100 TCID50病毒等體積混合，37、5% CO2條件下作用2 h后，再將其感染Hep-2細胞，100l/孔，吸附2 h后用PBS洗滌2次，每日觀察并記錄細胞病變效應（CPE）。實驗設正常細胞對照組、病毒對照組、陽性對照組和藥物組。當病毒對照組細胞CPE在75%100%時棄培養(yǎng)液上清，每孔加入含5gL MTT的培養(yǎng)液50l，繼續(xù)培養(yǎng)23h后棄去MTT

31、上清，每孔加DMSO100l，混勻5min后，用酶標儀測490 nm波長處的A值。按Reed-Muench法計算藥物的半數(shù)中毒濃度TD50和半數(shù)有效濃度EC50。5.治療指數(shù)（TI） 按TI= TD50/EC50 或TD50/IC50進行計算。藥理學實驗規(guī)定，TI4表示藥物有效?？h本飾襲槐迢堰湍估銀桂埠絆征執(zhí)燦唇等唉靈蜀謹晤笨瘡鞋秋戍砰鹼豈乏第六節(jié)藥物的抗病毒實驗第六節(jié)藥物的抗病毒實驗第35頁，共42頁。三）體內抗病毒試驗1.實驗動物的選擇 試驗動物在病毒學研究中的用途主要有：分離與鑒定病毒、制備疫苗及診斷抗原、制備免疫血清、研究病毒的致病性、免疫性、發(fā)病機理及有效藥物療法等。病毒接種于何種動

32、物以及選擇何種接種途徑，主要取決于病毒的種類和實驗研究的目的。應根據(jù)實驗需要選擇最敏感動物作為實驗對象，常用的動物有小鼠、大鼠、豚鼠、家兔、乳鼠和猴子等，接種時要根據(jù)病毒對動物及組織細胞的親嗜性而選擇特定的部位，常用接種途徑有鼻腔、腹腔、腦內、皮下、肌肉、靜脈及小鼠經(jīng)口接種、家兔角膜注射等。給藥方式亦可有腹腔、灌胃、靜脈注射、肌肉注射、吸入等。幢杏啪頸瑩號鉚謀餡徐勵展剎癰唾疙駛兇跋響憲寡坪療涵產(chǎn)材什乖勇聯(lián)粱第六節(jié)藥物的抗病毒實驗第六節(jié)藥物的抗病毒實驗第36頁，共42頁。 采集全血、血漿、血清、組織臟器或細胞等標本，進行相應指標的檢測。為減少個體差異，一般試驗選擇成年動物，動物體重盡可能一致；如

33、無特殊要求，實驗動物的性別應先選雄性動物或雌雄各半，且動物要健康，雌性動物懷孕及授哺期不宜采用。此外，根據(jù)實驗研究不同的精確程度要求，選擇標準化試驗動物。標準化試驗動物是指按遺傳控制方法和微生物控制標準培育而成的動物。按遺傳學控制原理可分為近交系、遠交系、突變系、雜交一代等，按微生物學控制原理可分為無菌動物、悉生動物、無特定病原體動物、清潔動物等。病毒接種完成后，按一定級別的動物飼養(yǎng)標準飼養(yǎng)，對照組與實驗組分籠飼養(yǎng)。姨痰靳痘小伴松四拖擺藕渭熔就仁鋸氟詩貧簿祖單礦渺研薩搭拓躺卿輕誓第六節(jié)藥物的抗病毒實驗第六節(jié)藥物的抗病毒實驗第37頁，共42頁。2.病毒接種方法2.1鼻腔接種法 實驗組小鼠先用乙醚淺麻后，將小鼠頭部仰起，向鼻腔內緩慢滴入一定感染量的病毒懸液100l左右，正常對照組鼻腔滴入等量不含病毒的PBS或生理鹽水，要掌握麻醉的深淺度。麻醉太深，小鼠能將病毒懸液直接吸入肺中，引起肺水腫，往往于接種后1d內死亡；麻醉太淺，小鼠又試圖將接種物咳出。山晴巫蜒淚設點棗翟泉惺悄甫垃陜圖寸困兼焙霜娜俘漫鳥牽倉瞥壇配躲纓第六節(jié)藥物的抗病毒實驗第六節(jié)藥物的抗病毒實驗第38頁，共42頁。2.2小白鼠腹腔接種（1）用無菌注射器以無菌操作法吸取病毒懸液，排除氣泡（將注射器針頭朝上，使氣泡上升，在針頭上裹以消毒棉球，然后輕輕將氣泡推出）。（2）右手輕拖小白鼠尾，使其爬行于粗糙面上，迅速以左手拇指和食指