雙水相分離蛋白酶

1、雙水相分離蛋白酶1實驗?zāi)康?. 掌握雙水相的概念；2. 掌握雙水相技術(shù)的概念；3. 掌握雙水相提取酶與蛋白質(zhì)的原理；4. 了解影響雙水相技術(shù)提取效率的因素。2 1956年,瑞典Lund大學(xué)學(xué)者Albertson首次利用雙水相萃取技術(shù)(ATPE)分離生物分子。 20世紀(jì)70年代以后，Hustedt、Kula和Johansson等人又將雙水相萃取技術(shù)應(yīng)用于生物產(chǎn)品分離。 自20世紀(jì)80 年代初期起，雙水相萃取技術(shù)開始應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)，國內(nèi)也開展了相關(guān)研究。3 人們已經(jīng)陸續(xù)考察了蛋白質(zhì)、核酸、病毒、細(xì)胞及細(xì)胞顆粒在ATPS中的分配行為，從工藝流程、操作參數(shù)、成本分析等方面對雙水相萃取技術(shù)的工業(yè)應(yīng)用進(jìn)行

2、了分析和嘗試，為發(fā)展雙水相萃取技術(shù)奠定了堅實的基礎(chǔ)。4 當(dāng)一定濃度的某種有機(jī)物水溶液與其它有機(jī)物水溶液，或者有機(jī)物水溶液與無機(jī)鹽水溶液以一定體積比混合時，能夠自然分相并形成互不相溶的雙水相或者多水相體系，這就是雙水相體系。5 雙水相的形成機(jī)理很復(fù)雜。 不同的成相原理可以解釋不同組成的雙水相體系，但各種原理并不能普遍適用，而且各種原理間的相互關(guān)系也十分復(fù)雜。6 雙水相萃取與一般的水/有機(jī)物萃取的原理相似，都是依據(jù)物質(zhì)在兩相間的選擇性分配。 當(dāng)萃取體系的性質(zhì)不同，物質(zhì)進(jìn)入雙水相體系后，由于分子間的范德華力、疏水作用、分子間的氫鍵、分子與分子之間電荷的作用，目標(biāo)物質(zhì)在上、下相中的濃度不同，從而達(dá)到分

3、離的目的。7 溶質(zhì)(包括蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)、稀有金屬以及貴金屬的絡(luò)合物、中草藥成分等) 在雙水相體系中服從Nernst分配定律: K = Ct / Cb 其中Ct 、Cb 分別代表溶質(zhì)在上相、下相中的濃度。8系統(tǒng)固定時，分配系數(shù)為一常數(shù)，與溶質(zhì)的濃度無關(guān)。 當(dāng)目標(biāo)物質(zhì)進(jìn)入雙水相體系后，在上相和下相間進(jìn)行選擇性分配，這種分配關(guān)系與常規(guī)的萃取分配關(guān)系相比，表現(xiàn)出更大或更小的分配系數(shù)。 如各種類型的細(xì)胞粒子、噬菌體的分配系數(shù)都大于100 或者小于0.01 ，因此為物質(zhì)分離提供了可能。9 影響物質(zhì)在雙水相體系中分配的因素主要包括雙水相體系中有機(jī)相組成(如有機(jī)物的類型、平均分子量等) 、鹽類(包括離子類

4、型和濃度、電荷數(shù)、電解質(zhì)強(qiáng)度、酸堿性等) 、相比R (上下相的體積比) 、溶質(zhì)即待分離物質(zhì)的物理化學(xué)性質(zhì)(包括分子量,等電點)以及體系的溫度、壓力等。10 這些因素不是獨立起作用的，所以要預(yù)測待分離物質(zhì)在雙水相體系間的分配系數(shù)相當(dāng)困難。 目前只能是邊實驗邊確定最佳分配條件。11p H的影響 雙水相體系中的p H 值可以通過影響蛋白質(zhì)分子上可離解基團(tuán)的離解度，從而改變蛋白質(zhì)的表面電荷數(shù)來影響分配，它還可以通過影響緩沖離子如HPO2 -4 、PO3 -4 等的分配，以改變相間電位來達(dá)到改變分配系數(shù)的目的。 不同種類的中性鹽也會由于電位差的不同，而導(dǎo)致分配系數(shù)與p H 值的關(guān)系的不同。12溫度的影響

5、 溫度的變化也會通過影響相物理性質(zhì)（如粘度和密度等）的變化來影響蛋白質(zhì)的分配。 但總的來說，溫度對分配系數(shù)的影響是通過對相圖的影響來間接達(dá)到的。 在臨界點附近，溫度對相圖的影響最顯著，對分配系數(shù)的影響最強(qiáng)。13 當(dāng)遠(yuǎn)離臨界點時，溫度對相圖的影響較小，分配系數(shù)對溫度的變化也不敏感。 這是由于遠(yuǎn)離臨界點時，成相聚合物的濃度增大，對蛋白質(zhì)的穩(wěn)定作用增強(qiáng)。14中性鹽的影響 中性鹽的種類不同，其正負(fù)離子分配系數(shù)也不同。 當(dāng)它在雙水相中電離時，為保持兩相的電中性，產(chǎn)生了不同的相間電位，從而影響蛋白質(zhì)的分配。 如在PEG-Dext ran 體系中加入NaClO4 或KI ，可增加上相對帶正電的蛋白質(zhì)的親和效

6、應(yīng)，并迫使帶負(fù)電的蛋白質(zhì)進(jìn)入下相； 若加入Li3 PO4 ，情況則相反。15 故只要改變界面電勢就可控制荷電蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)入所需要的相中。 鹽的濃度對分配系數(shù)的影響主要反映在對蛋白質(zhì)疏水性的影響上。16有機(jī)共溶劑的影響 在雙水相體系中添加少量有機(jī)共溶劑，使得體系中的一部分水被有機(jī)共溶劑所取代，導(dǎo)致兩相界面處的疏水性能差異發(fā)生變化，同時界面張力以及電位差也隨之改變，從而影響了蛋白質(zhì)的分配。 通常認(rèn)為，有機(jī)共溶劑對被分配物質(zhì)分配行為的影響，更主要的是有機(jī)溶劑和成相高聚物相互作用的結(jié)果。17 添加表面活性劑可以改變界面張力、上下相組成等兩相特性，從而對物質(zhì)的分配行為進(jìn)行調(diào)節(jié)。18雙水相萃取技術(shù)的優(yōu)勢 雙水

7、相萃取通過溶質(zhì)在兩水相之間分配系數(shù)的差異而進(jìn)行萃取。 在蛋白質(zhì)的分離純化過程中，雙水相體系的含水量高，可達(dá)80%以上，萃取環(huán)境和操作條件溫和，蛋白質(zhì)在其中不易失活； 界面張力遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于水-有機(jī)溶劑兩相體系的界面張力，有助于強(qiáng)化相際間的質(zhì)量傳遞； 易于按比例放大和進(jìn)行連續(xù)性操作等。19 雙水相萃取技術(shù)的這些優(yōu)勢，使之被廣泛用于蛋白質(zhì)的分離純化，效果很好。 近年來，雙水相萃取技術(shù)的分離對象已涵蓋了多肽、氨基酸、植物有效成分、重金屬離子和抗生素等方面。20雙水相萃取技術(shù)的種類 在生物分離工程中常用的雙水相萃取技術(shù)（ATPS）有兩類。 第一類是非離子型聚合物/ 非離子型聚合物/ 水系統(tǒng)，第一類體系對生物

8、活性物質(zhì)變性作用低、界面吸附少，但是所用的聚合物(如葡聚糖)成本較高，而且體系黏度大，在工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)時從經(jīng)濟(jì)角度喪失了該系統(tǒng)的優(yōu)勢;21 第二類是非離子型聚合物/無機(jī)鹽/水系統(tǒng)。 第二類成本相對低，黏度小，但是由于高濃度的鹽廢水不能直接排入生物氧化池，使其可行性受到環(huán)保限制，且有些對鹽敏感的生物物質(zhì)會在這類體系中失活。 因此，研究成相材料、建立新型ATPS成為雙水相萃取技術(shù)的主要發(fā)展方向之一。22 菠蘿蛋白酶（bromelain）是從菠蘿的果實和莖中制取分離出的蛋白水解酶的總稱，根據(jù)制取分離部位的不同，分為果菠蘿蛋白酶（fruit bromelain）和莖菠蘿蛋白酶（stem bromelain）。23 1891年，Chittenden等首先用硫酸銨沉淀法從菠蘿果實中分離出了果菠蘿蛋白酶。 1957 年，Heineche 等從菠蘿莖中制取蛋白水解酶，從此菠蘿蛋白酶實現(xiàn)了商品化生產(chǎn)。24 菠蘿蛋白酶中含有多種不同蛋白水解酶組分