組織培養(yǎng)的步驟

1、組織培養(yǎng)的步驟一、Ms培養(yǎng)基配制1.各種母液的配置（1）配制MS大量元素母液一般將大量元素分別配制成100倍的母液，使用時再分別稀釋100倍。分別稱取NH4NO3 165gKH2PO4 17gKNO3 190gCaCl22H2O 44gMgSO47H2O 37g各自配成1L的母液。倒入1L試劑瓶中，存放于冰箱中。（2） 配制MS微量元素母液一般將微量元素配制成100倍母液。依次稱取KI 0.083gNa2MoO42H2O 0.025gH3BO3 0.62gCuSO45H2O 0.0025gMnSO4H2O 1.69g 或 MnSO44H2O 2.23gCoCl26H2O 0.0025gZnSO

2、47H2O 0.86g配成1L母液，倒入1L試劑瓶中，存放于冰箱中。CuSO4.5H2O和CoCl26H2O由于稱取量很小，如果天平精確度沒有達到萬分之一，可先 配成調(diào)整液。分別稱取CuSO45H2O 0.05gCoCl26H2O 0.05g各自配成100ml的調(diào)整液，然后取5ml就還有0.0025g的量。（3） 配制MS有機母液一般配制成100倍MS有機母液。依次稱取肌醇10g鹽酸硫胺素（VB1）0.01g煙酸0.05g甘氨酸0.2g鹽酸毗哆醇（VB6）0.05g配成1L母液，倒入1L試劑瓶中，存放于冰箱中。（4） 配制MS鐵鹽母液一般配制成100倍MS鐵鹽母液。依次稱取EDTA 二鈉 3.

3、73gFeSO47H2O 2.78g配成1L母液，倒入1L試劑瓶中，存放于冰箱中。所以MS母液有5種大量元素母液，加上MS微量元素母液、MS有機母液和MS鐵鹽母液， 共8種母液。（5）激素母液的配制各種生長素和細胞分裂素要單獨配制，不能混合在一起，生長素 類一般要先用少量95%的酒精或0.1ml/L的NaOH溶解，細胞分裂素一般要先用0.1ml/L的 鹽酸溶解，然后再加蒸餾水定容。一般取100mg配成100ml母液。2、配制培養(yǎng)基以配置1L MS培養(yǎng)基為例，按順序進行如下操作：（1）先在燒杯中放入一些蒸餾水。（2）分別取上面八種母液10ml倒入。（3）一般稱取30g蔗糖倒入，攪拌溶解。（4）加

4、蒸餾水用量筒定溶至1L。（5）按設(shè)計好的方案添加各種激素，由于激素的用量很小，而且激素對組培植物的生長至 關(guān)重要。所以有條件的話最好用微量可調(diào)移液器吸取，減少誤差。（6）用精密試紙或酸度計調(diào)整PH至5.7-5.8。（有條件的話使用酸度計，比較精確）可配0.1ml/L的HCL和0.1ml/L的NaOH用來調(diào)溶液PH值。0.1ml/LHCL配制：用量筒量取8.3ml配成100ml溶液。 0.1ml/LNaOH配制：稱取NaOH 4g配成100ml溶液。（7）稱取610g左右瓊脂粉（質(zhì)量好的瓊脂粉），倒入上面配好的溶液中，放在電爐上加熱 至沸騰，直到瓊脂粉熔化。（8）稍微冷卻后，分裝入培養(yǎng)容器中。無

5、蓋的培養(yǎng)容器要用封口膜或牛皮紙封口，用橡皮 筋或繩子扎緊。（9）放入消毒滅菌鍋滅菌，滅菌20分鐘左右。常用方法是：關(guān)閉放氣閥，通電后，待壓力上升到0.05MPa時，打開放氣閥，放出空氣，待壓力表指針歸零后，再關(guān)閉放氣閥。關(guān)閥再通電后，壓力表上升達到0.1MPa時，開始計時，維持壓力0.1-0.15MPa，20分鐘。（10）滅菌后從滅菌鍋中取出培養(yǎng)基，平放在實驗臺上令其冷卻凝固。二、接種2.1成熟種子的表面消毒選取成熟飽滿、顏色和大小相對一致的成熟小麥，用70%（v/v）酒精浸泡5 min，無菌 水沖洗23次，再經(jīng)0.1%的升汞（HgCl2）浸泡20 min，無菌水沖洗68次后，置于無 菌保濕濾

6、紙上，33r黑暗條件下預(yù)培養(yǎng)2 h。2.2成熟胚愈傷組織的誘導(dǎo)和繼代待種子露白，用解剖刀在胚上縱切一刀，橫切兩刀，腹溝向下接種在誘愈培養(yǎng)液浸潤的 濾紙上，（261）C暗培養(yǎng)8 d。挑選胚性愈傷組織，每23周繼代一次。2.3胚性愈傷組織的分化再生選取胚性愈傷組織轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基，（261）C暗培養(yǎng)10 d后，轉(zhuǎn)入同溫條件下光培養(yǎng)， 光照強度為40 gmol/（m2-s），光照時間16h/d。經(jīng)過40 d的分化培養(yǎng)（每10天更換1次 新鮮培養(yǎng)基），形成綠芽原基和綠芽。待分化出的綠芽長至23cm時，切取綠芽轉(zhuǎn)至生根培 養(yǎng)基，使之生根。2.4再生植株的春化及移栽具有正常根系的再生植株長至68 cm時，4

7、C冰箱春化68 w （16 h光周期，光照強 度為40 pmol/（m2s），然后敞開培養(yǎng)瓶瓶口，溫室中煉苗1 w，移栽入溫室花盆中（262）C， 16 h光周期，光照強度為80 gmol/（m2-s），生長至成熟。三無菌操作（1）在接種4小時前用甲醛熏蒸接種室，并打開其內(nèi)紫外線燈進行殺菌；（2）在接種前20分鐘，打開超凈工作臺的風機以及臺上的紫外線燈；（3）接種員先洗凈雙手，在緩沖間換好專用實驗服，并換穿拖鞋等；4）上工作臺后，用酒精棉球搽拭雙手，特別是指甲處。然后搽拭工作臺面；5）先用酒精棉球搽拭接種工具，再將鑷子和剪刀從頭至尾過火一遍，然后反復(fù)過火尖端 處，對培養(yǎng)皿要過火烤干；（6）接種

8、時，接種員雙手不能離開工作臺，不能說話、走動和咳嗽等；（7）接種完畢后要清理干凈工作臺，可用紫外線燈滅菌30分鐘，若連續(xù)接種，每5天要大 強度滅菌一次。無菌接種步驟：（1）將初步洗滌及切割的材料放入燒杯，帶入超凈臺上，用消毒劑滅菌，再用無菌水沖洗， 最后瀝去水分，取出放置在滅過菌的紗布上或濾紙上。（2）材料吸干后，一手拿鑷子、一手拿剪刀或解剖刀，對材料進行適當?shù)那懈?。如葉片切 成0.5cm平方的小塊；莖切成含有一個節(jié)的小段。微莖尖要剝成只含1-2片幼葉的莖尖大小 等。在接種過程中要經(jīng)常灼燒接種器械，防止交叉污染。（3）用灼燒消毒過的器械將切割好的外植體插植或放置到培養(yǎng)基上。具體操作過程（以試 管為例）是：先解開包口紙，將試管幾乎水平拿著，使試管口靠近酒精燈火焰，并將管口在 火焰上方轉(zhuǎn)動，使管口里外灼燒數(shù)秒鐘。若用棉塞蓋口，可先在管口外面灼燒，去掉棉塞， 再燒管口里面。然后