脯氨酸含量測定

1、逆境脅迫下植物體脯氨酸含量測定【實驗?zāi)康摹苛私飧彼嵩谥参锟鼓嫘詻Q定中的作用。掌握脯氨酸提取和測定的方法?！緦嶒炘怼磕婢硹l件下(干旱、鹽堿、熱、冷害、凍害)，植物體內(nèi)脯氨酸含量會顯著增加，并且積累 指數(shù)與植物的抗逆性有關(guān)，因此脯氨酸可作為植物抗逆性的一項生化指標。測定脯氨酸含量目前一般使用的方法是茚三酮法。酸性條件下，茚三酮和脯氨酸反應(yīng)生成穩(wěn)定的紅色化合物,產(chǎn)物在520nm波長下具有最大吸 收峰。用磺基水楊酸提取植物樣品時，脯氨酸便游離于磺基水楊酸的溶液中，然后用酸性茚三 酮加熱處理后，溶液即成紅色,再用甲苯萃取，則色素全部轉(zhuǎn)移至甲苯中，顏色的深淺即表示 脯氨酸含量的高低?！緦嶒灢牧稀坎牧希?/p>

2、小麥幼苗：對照100mM、200mM NaCl 處理 48h5%、15% PEG-6000 處理 48h 試劑：3%磺基水楊酸；冰醋酸；甲苯；2.5%酸性茚三酮溶液；脯氨酸母液50 g/ml器材：天平，燒杯，分光光度計，研缽，容量瓶，具塞試管，移液管，膠頭滴管，水浴 鍋酸性茚三酮溶液：稱取1.25g茚三酮溶于30mL冰乙酸和20mL 6M磷酸溶液中，攪拌 加熱(低于70C )溶解，冷卻后置棕色瓶中，4C保存可使用23天?！緦嶒瀮?nèi)容】脯氨酸標準曲線的測定分別吸取1ml系列標準濃度的脯氨酸溶液于6個試管中,加入1ml水、1ml冰乙酸、2ml 2.5%的酸性茚三酮，于沸水浴中加熱30min。冷卻后準

3、確加入4ml甲苯，振蕩30S，靜置片刻,使色素全部轉(zhuǎn)至甲苯溶液。輕輕吸取各管上層甲苯溶液至比色杯中，以甲苯為空白對照，于520nm進行比色。樣品的測定稱取不同處理的小麥葉片各0.5 g，于2.5 ml 3%磺基水楊酸試管中，沸水浴中提取10 min。吸取1ml上清于另一試管中，加入1 ml水、1 ml冰乙酸、2 ml 2.5%的酸性茚三酮， 混合液于沸水中顯色30 min。冷卻后加入4 ml甲苯，搖蕩30S，萃取完全后用吸管輕輕吸取上層紅色甲苯溶液于比 色杯中，以甲苯為空白對照，在520nm比色?！緦嶒灲Y(jié)果】查標準曲線，得脯氨酸含量c (gg)脯氨酸含量(gg.g-1) = c X(v/a )

4、 / w其中V為提取液總體積ml; a為測定液體積ml； W為樣品質(zhì)量g。1.標準曲線濃度(pg/mL)246810OD52010.0700.1400.2010.2930.33120.0870.1320.1930.3040.34130.0880.1510.2230.3180.344平均0.0820.1410.2060.3050.339脯氫酸含量標準曲線0. 3000. 2000. 100系列11015濃度(ne/L)2.樣品測定處理平行質(zhì)量OD520對照10.20180.20430.1570.17320.20680.188100mM NaCl10.20180.20260.6150.65720.

5、20330.698200mM NaCl10.20060.20201.0080.94220.20340.8755%10.20960.20950.0990.167PEG-600020.20930.23415%10.20280.20410.5860.587PEG-60002020530.587將測得樣品的OD520值帶入標準曲線，得到的幾種處理的脯氨酸含量分別為:處理OD520脯氨酸濃度(pg/mL)質(zhì)量(g)脯氨酸含量(Pg/g)對照0.1734.7640.2043233.2100mM NaCl0.65719.0410.2026940.1200mM NaCl0.94227.4480.2020135

6、8.85%PEG-60000.1674.5870.2095219.015%PEG-60000.58716.9760.2041832.0【實驗討論】采用磺基水楊酸提取植物體內(nèi)的游離脯氨酸，不僅大大減小了其他氨基酸的干擾，快速簡 便，而且不受樣品狀態(tài)（干或鮮樣）限制。實驗中甲苯的作用主要是萃取，以排除其他可能和茚三酮產(chǎn)生顯色反應(yīng)的物質(zhì)使得測量值 偏高。但同時有研究顯示，未經(jīng)甲苯萃取和經(jīng)甲苯萃取后所得的脯氨酸含量值得趨勢是相同 的，即應(yīng)該高的數(shù)值兩種方法都會高，因此，從污染小，經(jīng)濟，簡便的方向考慮，如果不對 脯氨酸進行精確的定量，只是用于作為一個植物抗性的生化指標，可以不使用甲苯的萃取。實驗中在繪制

7、標準曲線時，所設(shè)置的濃度范圍不太合適，因為沒能把樣品的OD520值包 含進去。因此標準曲線并不是很可靠。應(yīng)該將濃度繼續(xù)增加，盡量使樣品測定的OD520值 能夠包含進入曲線的濃度范圍內(nèi)，所得結(jié)果才準確。從實驗結(jié)果中可以觀察到，隨著脅迫程度的增加，脯氨酸的含量也會顯著增加。因此，可 以說明脯氨酸的含量在一定程度上是植物遭受脅迫大小的反映。而通過比較，發(fā)現(xiàn)鹽脅迫比 干旱脅迫對小麥造成的影響更大。實驗結(jié)果中，經(jīng)過5%PEG-6000（輕度干旱脅迫）處理的小麥葉片內(nèi)的脯氨酸含量甚至比對 照組的脯氨酸含量還要低（但相差不多）。而其他幾種脅迫均有顯著的使脯氨酸增加的效果， 因此，除了操作過程中的一些誤差外，

8、最重要的是輕度干旱可能不會對小麥造成太大的影響， 或者其他的代謝機制可以幫助小麥抵抗輕微干旱，脯氨酸增加不明顯。脯氨酸是水溶性最大的氨基酸，具有極強的親水性及水合作用。因此干旱時脯氨酸的積累 能夠有效地防止脫水。脯氨酸是植物在鹽脅迫下的主要滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)之一，它不僅是生物大分子的保護劑和羥基 的清除劑，還是植物從脅迫條件恢復(fù)正常過程中迅速、有效的氮源、碳源和還原劑。脯氨酸 能夠防止質(zhì)膜透性的變化，對質(zhì)膜的完整性有保護作用，原因可能是脯氨酸與膜磷脂及轉(zhuǎn)運 蛋白相互作用，以穩(wěn)定其結(jié)構(gòu)。高等植物中脯氨酸的合成有兩種途徑：谷氨酸途徑和鳥氨酸 途徑，兩者的主要區(qū)別在于初始底物分別為谷氨酸（Glu）和鳥氨酸

9、（Orn）。在滲透脅迫和 氮素缺乏情況下，谷氨酸途徑是合成脯氨酸的主要來源；而在氮素供應(yīng)充足的情況下，鳥氨 酸途徑占主導(dǎo)地位。脯氨酸合成發(fā)生在細胞質(zhì)中，P5CR（毗咯啉-5，-羥酸還原酶）和P5CS（毗咯啉-5,-羥酸氧化酶）是脯氨酸生物合成過程中的兩個重要酶，后者是限速酶。除了高鹽和干旱脅迫外，脯氨酸在低溫脅迫時也起到重要作用。脯氨酸的親水性極強，能 穩(wěn)定原生質(zhì)膠體及組織內(nèi)的代謝過程，因而能降低冰點，有防止細胞脫水的作用。另外，脯氨酸的積累與植物的代謝表現(xiàn)出一定的正相關(guān)性，同時能促進酶核細胞膜的滲透調(diào) 節(jié)。有些植物中，脯氨酸的質(zhì)量分數(shù)的變化會引起代謝酶的變化；當植物細胞受到逆境脅迫 時，脯氨酸通過保護生物大分子的功能結(jié)構(gòu)為生理生化反應(yīng)提供足夠的自由水和活性物質(zhì)，