融合酶技術(shù)的應(yīng)用

1、融合酶技術(shù)的應(yīng)用摘要：為了獲取自然界中并不存在的具有更多催化活性的酶蛋白，采 用酶融合技術(shù)，通過構(gòu)建重組融合基因，導(dǎo)入表達(dá)載體，轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)，經(jīng)分離純化獲得目的融合酶。關(guān)鍵字：基因融合 DNA合成 重組質(zhì)粒 表達(dá)系統(tǒng)融合酶指一條多肽鏈上含有2種或2種以上催化活性的酶。其往 往是基因融合的產(chǎn)物。它可以是單體酶，也可以是寡聚酶或更復(fù)雜的 多酶體系。例如E. coli天冬氨酸激酶I 一商絲氪酸脫氫酶I融合體， 在天冬氨酸到絲氨酸生物合成中催化兩步反應(yīng)，該酶是四聚體.每條 肽鏈含有兩個(gè)活性tN-端部分的天冬氨酸激酶和C 一端部分的高絲氨 酸脫氫酶，所以又稱雙頭酶。為了得到具有多種活性或者條件

2、耐受性 更大的目標(biāo)酶。一般所采用融合酶技術(shù)，即通過DNA重組技術(shù)得到的 兩個(gè)目標(biāo)酶表達(dá)基因重組后的表達(dá)產(chǎn)物。這一新技術(shù)可以用于組建自 然界原先并不存在的、結(jié)構(gòu)和功能全新的酶蛋白。這一技術(shù)是通過構(gòu) 建融合酶基因及其表達(dá)質(zhì)粒，再由表達(dá)系統(tǒng)（如：大腸桿菌BL21） 表達(dá)獲得目標(biāo)物。融合酶表達(dá)技術(shù)主要通過以下幾步完成。實(shí)驗(yàn)材料的準(zhǔn)備酶和試劑：在構(gòu)建融合基因和表達(dá)載體的步驟中，會(huì)用到相應(yīng) 的酶與試劑。限制性內(nèi)切酶：主要用于對(duì)目標(biāo)基因的剪切。聚合酶， 連接酶:用于對(duì)DNA合成基因片段的連接上（PrimeSTAR聚合酶、T4DNA 連接酶）?？股赜糜谠谀繕?biāo)基因插入的檢測(cè)（氨芐青霉素、卡那霉 素、氯霉素）。

3、誘導(dǎo)物：用于誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)。菌種和質(zhì)粒：異源蛋白質(zhì)在細(xì)菌中表達(dá)是目前使用的主要的蛋 白生產(chǎn)系統(tǒng)。大腸桿菌一直是最經(jīng)濟(jì)的系統(tǒng)之一(如：大腸桿菌 (Escherichiacoli)EPI100 購自 Epicentre 公司)。質(zhì)粒：作為目標(biāo) 基因的載體導(dǎo)入到表達(dá)系統(tǒng)中去(質(zhì)粒pET30a(+)。根據(jù)目標(biāo)基因特性及相應(yīng)的情況選擇相應(yīng)的酶、試劑，并確定表 達(dá)菌株，以跟好的構(gòu)建融合基因、表達(dá)載體的重組，并最終表達(dá)、分 離、純化得到相應(yīng)的融合酶。融合目標(biāo)基因與重組表達(dá)載體的構(gòu)建融合基因的構(gòu)建為基因擴(kuò)增、基因的核苷酸序列改造及基因的融合做好準(zhǔn)備，以 及防止表達(dá)蛋白由于直接相連而造成空間折疊時(shí)構(gòu)想發(fā)生改變

4、，影響 活性；如果純化后要將融合蛋白切開的話，需要在蛋白的相連處設(shè)計(jì) 蛋白酶的酶切位點(diǎn)，但酶切位點(diǎn)的選擇也要注意不能在蛋白內(nèi)部有酶 切位點(diǎn)，所以要查閱相關(guān)資料，了解掌握相關(guān)酶表達(dá)基因的信息。一 般通過從目標(biāo)菌株中提取目的基因片段，在從Genbank中查詢相關(guān)目 的DNA序列，如果為了更好的使是融合基因能夠在表達(dá)系統(tǒng)菌體中得 到高效表達(dá)，根據(jù)相應(yīng)的表達(dá)系統(tǒng)菌株的對(duì)密碼子偏好性對(duì)該基因的 核苷酸序列進(jìn)行改造，但要保證其翻譯后的氨基酸序列不發(fā)生變化。 除此之外也可人工合成目標(biāo)基因。設(shè)計(jì)引物對(duì)獲得的基因進(jìn)行擴(kuò)增。 例如：將TfxA的前31個(gè)氨基酸連接在XynII的N端，構(gòu)建出融合木 聚糖酶TPL的研究

5、中，用中心模板法合成融合基因。重組表達(dá)質(zhì)粒將擴(kuò)增后的經(jīng)過雙酶切純化后的各目標(biāo)基因與相應(yīng)選定的載體 質(zhì)粒，按照適當(dāng)?shù)谋壤旌?，用DNA連接酶反應(yīng)過夜（一般加入T4DNA Ligase ,16笆）。把鏈接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到表達(dá)系統(tǒng)中去，一邊采用感受態(tài) 的大腸桿菌，并在含有相應(yīng)抗生素的平板上篩選轉(zhuǎn)化子，從而獲得含 有重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子。融合基因在表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)將構(gòu)建篩選出的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞中去，獲得重組的表達(dá) 細(xì)胞系。表達(dá)系統(tǒng)根據(jù)要求可以采用原核細(xì)胞，例如用大腸桿菌作為 宿主，也可用動(dòng)植物細(xì)胞。用抗性標(biāo)記或其他的方法篩選含重組質(zhì)粒 的菌株或細(xì)胞系。培養(yǎng)過程中采用相應(yīng)的誘導(dǎo)物誘導(dǎo)目的酶蛋白的表 達(dá)。表達(dá)產(chǎn)物的純化、性質(zhì)鑒定采用相應(yīng)的分離技術(shù)對(duì)原始酶及融合酶分離純化，從而從各個(gè)角 度對(duì)比原始酶與融合酶的性質(zhì)變化。一般從以下幾點(diǎn)去做綜合的分 析。1.酶活力的測(cè)定：測(cè)定融合酶所具有原始酶活力的比，對(duì)各底物 的催化活性。以及酶與底物結(jié)合