實(shí)驗(yàn)十三動(dòng)物組織核酸的分離、鑒定和含量測(cè)定課件

1、動(dòng)物組織核酸的分離純化及鑒定1. 豬肝DNA和RNA的分離2. 核糖和脫氧核糖的顯色實(shí)驗(yàn)3. 核酸的定量和純度測(cè)定核酸是一類生物高分子化合物，存在于一切生物體內(nèi)，是組成細(xì)胞的重要成分。它以與蛋白質(zhì)結(jié)合的形式核蛋白存在于細(xì)胞中，是生命的基本物質(zhì)之一，具有儲(chǔ)存、復(fù)制生物體遺傳信息的功能，也是蛋白質(zhì)合成不可缺少的物質(zhì)，因此它對(duì)于生物體的生長(zhǎng)、遺傳、變異等現(xiàn)象起著重要的決定作用。核酸分為兩大類核糖核酸(RNA)和脫氧核糖核酸(DNA) 。核酸完全水解產(chǎn)生嘌呤和嘧啶等堿性物質(zhì)、戊糖（核糖或脫氧核糖）和磷酸的混合物。核酸部分水解則產(chǎn)生核苷和核苷酸。每個(gè)核苷分子含一分子堿基和一分子戊糖，一分子核苷酸部分水解

2、后除產(chǎn)生核苷外，還有一分子磷酸。核酸的各種水解產(chǎn)物可用層析或電泳等方法分離鑒定。DNA和RNA的結(jié)構(gòu)組成核酸的戊糖有兩種。DNA所含的糖為 -D-2-脫氧核糖；RNA所含的糖則為-D-核糖。RiboseDeoxyribose1. 豬肝DNA和RNA的分離 核酸分離的原則 核酸存在于多種細(xì)胞，因此分離方法復(fù)雜而多樣。又因各種DNA、RNA的含量差異，各種分析方法對(duì)核酸的純度及量的要求有差異，因此在實(shí)驗(yàn)前應(yīng)對(duì)所采用的方法有所了解和選擇。總的說(shuō)來(lái)核酸的分離與純化是在溶解細(xì)胞的基礎(chǔ)上，利用苯酚等有機(jī)溶劑抽提（核酸溶于緩沖液，即水相），分離，純化；利用乙醇、丙酮等有機(jī)溶劑沉淀，收獲。核酸分離的一般步驟

3、1.溶解細(xì)胞 溶解細(xì)胞的方法因樣品不同而不同。有的是用十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate,SDS）加NaOH，有的是用蛋白酶，有的用超聲波破碎等方法。2有機(jī)溶劑抽提 利用苯酚提取主要使蛋白質(zhì)變性沉淀于有機(jī)相，而核酸保留在水相，達(dá)到分離核酸的目的。實(shí)際上生物樣品中含量最多的就是蛋白質(zhì)。3.純化 為了得到純的核酸，可用蛋白酶除去蛋白；用RNA酶除去RNA，得到純的DNA；用DNA酶除去DNA，得到純的RNA。4.沉淀 為了除去分離過(guò)程中殘留的有機(jī)溶劑，常用的方法是加冷乙醇和鹽沉淀核酸，再通過(guò)離心回收核酸，然后用80%乙醇洗滌沉淀，除去多余的鹽，以免影響核酸溶解和抑制后續(xù)步

4、驟的酶促反應(yīng)。目前開(kāi)發(fā)了許多商品化的核酸分離柱，試劑盒,可簡(jiǎn)單、快速地分離得到純度很高的DNA或RNA，其分離原理有的是利用核酸的分子量差異，有的是利用所需分離的核酸的特點(diǎn)將其特異性結(jié)合達(dá)到分離、回收的目的。DNA和RNA分離的基本原理根據(jù)核糖核蛋白與脫氧核糖核蛋白在一定濃度的氯化鈉溶液中的溶解度不同進(jìn)行分離，然后用蛋白質(zhì)變性沉淀劑去除蛋白，使核酸釋放出來(lái)，再利用核酸不溶于乙醇的性質(zhì)將核酸析出，達(dá)到分離DNA和RNA的目的。在0.14mol/L的氯化鈉溶液中，RNA核蛋白溶解度大，而DNA核蛋白溶解度小；相反在1mol/L的氯化鈉溶液中，DNA核蛋白的溶解度大，而RNA核蛋白的溶解度小，從而使

5、DNA和RNA核蛋白分開(kāi)。酚：氯仿：異戊醇抽提酚：有效的使蛋白質(zhì)變性，不能完全的抑制RNA酶的活性，能溶解帶有長(zhǎng)poly(A)的RNA分子。使用前必須用水飽和并用Tris平衡至pH7.8，以防止DNA分配到有機(jī)相。結(jié)晶酚要在182度下重蒸去除醌類等氧化產(chǎn)物，這些物質(zhì)能夠引起磷酸二酯鍵的斷裂或促進(jìn)核酸交聯(lián)。純酚的比重為1.07，有機(jī)相和水相有時(shí)很難分開(kāi)。氯仿：純酚的比重為1.07，有機(jī)相和水相有時(shí)很難分開(kāi)。加入氯仿（比重為1.47）可以避免這一問(wèn)題。同時(shí)，酚有時(shí)會(huì)微溶于水?？梢杂寐确聦⑺嘀械姆尤コ．愇齑迹簻p少泡沫的產(chǎn)生。實(shí)驗(yàn)步驟2. 核糖和脫氧核糖的顯色實(shí)驗(yàn)加熱條件下：D核糖濃鹽酸苔黑酚 綠

6、色D2脫氧核糖酸二苯胺 藍(lán)紫色DNA：1ml SC溶液溶解DNA，然后轉(zhuǎn)移到50ml離心管中，用9ml 0.01M NaOH溶液溶解，4000rpm離心10分鐘，上清轉(zhuǎn)移到試管中備用。各取上述1mlDNA溶液于兩個(gè)試管中，其中一個(gè)里面加入3ml地衣酚試劑，然后在沸水中20min，觀察顏色反應(yīng)；另外一只試管中加入2ml二苯胺試劑，60 條件下反應(yīng)1h，觀察顏色反應(yīng)。RNA：將RNA沉淀用2ml蒸餾水溶解，然后轉(zhuǎn)移至2只試管中，每只1ml。其中一只試管中加入3ml地衣酚試劑，然后在沸水中20min，觀察顏色反應(yīng)；另外一只試管中加入2ml二苯胺試劑，60 條件下反應(yīng)1h，觀察顏色反應(yīng)。3. 核酸的定

7、量和純度測(cè)定紫外分光光度法（此法要求核酸純度很高，1個(gè)Abs相當(dāng)于50ug/ml雙螺旋DNA,除了定量測(cè)定以外還可進(jìn)行核酸純度的檢測(cè)，A260/A280比值，純的DNA為1.8，RNA為2.0，樣品中含有蛋白質(zhì)和苯酚時(shí)， A260/A280 比值降低。）定糖法（DNA糖部分為脫氧核糖，RNA糖部分為核糖，分別可以進(jìn)行二苯胺顯色法和地衣酚顯色法）定磷法（核酸的磷酸部分）二苯胺顯色法原理 DNA在酸性條件下加熱，其嘌呤堿與脫氧核糖間的糖苷鍵斷裂，生成嘌呤堿、脫氧核糖和脫氧嘧啶核苷酸，而2-脫氧核糖在酸性環(huán)境中加熱脫水生成-羥基-酮基戊糖，與二苯胺試劑反應(yīng)生成藍(lán)色物質(zhì)，在595nm波長(zhǎng)處有最大吸收。

8、DNA在40400g范圍內(nèi)，光吸收與DNA的濃度成正比。在反應(yīng)液中加入少量乙醛，可以提高反應(yīng)靈敏度。實(shí)驗(yàn)方法A260測(cè)定:以H2O作為空白，取上清測(cè)A260值后確定稀釋倍數(shù)，使A260值在2.0左右（DNA此時(shí)的濃度約為100ug/ml。（由于二苯胺法的測(cè)定范圍是40-400ug/mlDNA，所以DNA濃度如果太小會(huì)影響測(cè)定結(jié)果）A280測(cè)定： A260/A280比值計(jì)算。純的DNA為1.8，RNA為2.0。如果樣品中混有RNA，則比值大于1.8；如果樣品中混有蛋白質(zhì)，則比值小于1.8。所用的DNA溶液為前面提取后溶解的DNA樣品。DNA標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作和樣品測(cè)定試 劑管 號(hào)0對(duì)照12345樣品1樣品2DNA標(biāo)準(zhǔn)溶液,ml0.00.40.81.21.62.02.02.0蒸餾水，ml2.01.61.20.80.4000二苯胺試劑,ml4.04.04.04.04.04.04.04.0OD595注： 待測(cè)溶液中的DNA含量應(yīng)調(diào)整至標(biāo)準(zhǔn)曲線的可讀范圍內(nèi)。 樣品1和樣品2為不同稀釋倍數(shù)的DNA溶液。按上表加完各試劑后，充分混勻。于60水浴中保溫1h，冷卻后于595nm波長(zhǎng)處以0管為空白調(diào)零，測(cè)定各管光密度（OD595nm）。以DNA的含量為橫坐標(biāo)，光密度（吸收值）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 DNA含量計(jì)算 DNA含量計(jì)算：以樣品的光密度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)