realtime pcr的原理和應(yīng)用release

1、Realtime PCR的原理和應(yīng)用Yang Sun, PhDProduct Specialist主要內(nèi)容Realtime PCR的原理Realtime PCR的應(yīng)用Realtime PCR的問題及解決方法Real Time PCR的概念Real time PCR在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)累積實(shí)現(xiàn)了實(shí)時(shí)監(jiān)測整個(gè)PCR進(jìn)程，對起始模板進(jìn)行定量分析的方法。Ct值擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)過的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)。此時(shí)擴(kuò)增是呈對數(shù)期增長。理想的PCR反應(yīng)：X=X0*2n非理想的PCR反應(yīng)：X=X0(1+Ex)nn：擴(kuò)增反應(yīng)的循環(huán)次數(shù)X：第n次循環(huán)后的產(chǎn)物量X0：初始模板量Ex：擴(kuò)

2、增效率Real time PCR的原理在擴(kuò)增產(chǎn)物達(dá)到閾值線時(shí):XCt=X0(1+Ex)Ct=M (1)XCt:熒光擴(kuò)增信號(hào)達(dá)到閾值強(qiáng)度時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物的量. 在閾值線設(shè)定以后,它是一個(gè)常數(shù),我們設(shè)為M方程式(1)兩邊同時(shí)取對數(shù)得:log M=log X0(1+Ex)Ct(2)整理方程式(2)得:log X0= -log(1+Ex) *Ct+ log M (3) 最后結(jié)論：Log X0與Ct呈線性關(guān)系，根據(jù)樣品擴(kuò)增的Ct值就可計(jì)算出樣品中所含的模板量Real time PCR的原理Real Time PCR的方法染料法 使用內(nèi)摻式染料 SYBR Green I 探針法 使用序列特異性探針 Taqman

3、 Molecular Beacons Dual Probes(FRET)SYBR GREEN法Real Time PCR的方法SYBR-Green 的優(yōu)點(diǎn) 使用方便 不必設(shè)計(jì)復(fù)雜的引物 沒有序列特異性 可以用于不同的模板 便宜 靈敏 SYBR-Green 的缺點(diǎn) 特異性差，會(huì)與非特異性產(chǎn)物結(jié)合 Taqman 的優(yōu)點(diǎn) 對目標(biāo)序列有很高的特異性 特別適合于SNP檢測 與Molecular Beacons 相比設(shè)計(jì)相 對簡單Taqman 的缺點(diǎn) 價(jià)格較高 只適合于一個(gè)特定的目標(biāo) 不能進(jìn)行融解曲線分析 Real Time PCR的方法分子信標(biāo)的優(yōu)點(diǎn)對目標(biāo)序列有很高的特異性 用于SNP檢測的最靈敏的試劑

4、之一 熒光背景低 分子信標(biāo)的缺點(diǎn) 設(shè)計(jì)困難 無終點(diǎn)分析功能 只能用于一個(gè)特定的目標(biāo) 價(jià)格較高 Real Time PCR的方法Real time PCR數(shù)據(jù)處理方法絕對定量檢測起始模板數(shù)的精確拷貝數(shù)，標(biāo)準(zhǔn)曲線法Log起始拷貝量與Ct呈線性關(guān)系，通過已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品Ct值，就可以計(jì)算出樣品中所含的模板量log X0= -log(1+Ex) *Ct+ log M將正對照模板按照10倍進(jìn)行稀釋并且進(jìn)行PCR，將所得的Ct值進(jìn)行作圖，所得的斜率為S，則：影響效率的因素為：引物、鎂離子以及探針的濃度PCR效率的計(jì)算方法Real time PCR數(shù)據(jù)處理方法絕對定量的標(biāo)準(zhǔn)樣品

5、：已知拷貝數(shù)的質(zhì)粒DNA，做系列稀釋。標(biāo)準(zhǔn)樣品的種類：含有和待測樣品相同擴(kuò)增片段的克隆質(zhì)粒含有和待測樣品相同擴(kuò)增片段的cDNAPCR的產(chǎn)物含有已知數(shù)目的與待測樣品相同的擴(kuò)增片段的細(xì)胞Cited from Clinical Chemistry 48:811781185 (2002)Real time PCR數(shù)據(jù)處理方法Real time PCR數(shù)據(jù)處理方法2 delta-delta Ct 主要內(nèi)容Realtime PCR的原理Realtime PCR的應(yīng)用Realtime PCR的問題及解決方法Realtime PCR的應(yīng)用定量起始模板濃度 基因型分析 產(chǎn)物鑒定 SNP分析病原菌檢測藥廠GMP認(rèn)

6、證突變測定物種鑒定主要內(nèi)容Realtime PCR的原理Realtime PCR的應(yīng)用Realtime PCR的問題及解決方法Real time PCR的問題及解決方案該選擇絕對定量還是相對定量？絕對定量的問題：費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而且也有相當(dāng)多的問題，目前廣泛使用的在260nm波長下定量的方法與眾多因素有關(guān)，如水、緩沖液、儀器性能，乃至于核酸的抽提過程都會(huì)影響到結(jié)果的穩(wěn)定性。標(biāo)準(zhǔn)品的穩(wěn)定保存很難獲得成功，高濃度的核酸物質(zhì)易于被降解，而每次配制新的標(biāo)準(zhǔn)品又會(huì)增加批間差異。每次測定樣本都要同時(shí)測定標(biāo)準(zhǔn)品，而熱循環(huán)儀的樣本孔往往有限，所以使得不能在單批內(nèi)測定更多的樣本，這樣也就使實(shí)時(shí)PCR的高通量有所降低。

7、由于樣本來源存在極大的差異，所以很難保證標(biāo)準(zhǔn)品與目的基因的擴(kuò)增效率一致。這樣會(huì)大大增加結(jié)果的變異，即使是各樣本的DNA（或cDNA）有極小的差異或模板片斷不均一，都會(huì)對定量的結(jié)果造成很大的差異。 若選擇絕對定量則應(yīng)該注意：選擇與樣品具有完全相同序列的標(biāo)準(zhǔn)品每次進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)盡量使用新鮮配制的標(biāo)準(zhǔn)品盡量選用完全相同的體系若選擇相對定量則應(yīng)該注意：選擇合適的看家基因，通?？晒┻x擇的看家基因包括GAPDH 、-actin、2-微球蛋白和rRNA盡可能測定擴(kuò)增效率Real time PCR的問題及解決方案Realtime PCR引物設(shè)計(jì)原則引物應(yīng)該非常特異Tm在5865之間GC含量在3080不要有連續(xù)的相

8、同的堿基，尤其是G如果有超過4個(gè)連續(xù)的G則此引物不可用3末端最后5個(gè)堿基中不能含有超過兩個(gè)的G或C兩條引物的退火溫度應(yīng)該盡量接近避免引物二聚體以及發(fā)夾結(jié)構(gòu)產(chǎn)物在100150bp之間最大不能超過200250bp若測定cDNA的含量時(shí)設(shè)計(jì)的探針最好時(shí)跨內(nèi)含子的應(yīng)該選擇至少時(shí)經(jīng)過PAGE純化的引物Tm比引物高810度G不能在5端堿基C的數(shù)量要大于G的數(shù)量G連續(xù)必須小于4個(gè)GC含量2080%探針長度9到40個(gè)堿基探針不能自身形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)或者不能和引物形成二聚體Realtime PCR探針設(shè)計(jì)原則雜交探針需要注意什么？在使用雜交探針進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)，必須注意防止探針引物二聚體的形成和其本身在反應(yīng)過程中的延伸。

9、引物探針二聚體的形成，主要是因?yàn)樘结樋膳c引物的3末端雜交，其形成以后，會(huì)致使此二聚體擴(kuò)增，從而同目的基因競爭反應(yīng)的原料，致反應(yīng)的效率下降。探針其本身能同目的基因相結(jié)合，且其解鏈溫度高于引物，所以它可能作為引物而引發(fā)延伸反應(yīng)，為了防止發(fā)生這種現(xiàn)象，通常是將其3末端完全磷酸化，使之不能延伸，若此磷酸化不完全或是沒有磷酸化，就會(huì)產(chǎn)生目的基因的副產(chǎn)品，從而干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。鑒于以上這兩點(diǎn)，所以應(yīng)對探針精心設(shè)計(jì)，并將其末端完全磷酸化。 Real time PCR的問題及解決方案循環(huán)數(shù)為多少比較合適？一般的實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)只須2530個(gè)循環(huán)便可獲得滿意的結(jié)果，但是對于那些極微量的待測樣本而言，適當(dāng)增加循環(huán)數(shù)

10、可以提高反應(yīng)的檢出限，有文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)當(dāng)循環(huán)數(shù)從25增加到34個(gè)循環(huán)時(shí)，實(shí)時(shí)定量PCR的最低檢出限可從106增加到103。但是并非循環(huán)數(shù)增加得越多，其敏感性就會(huì)越高，實(shí)際上，當(dāng)循環(huán)數(shù)增加到某一值時(shí)，敏感性便不再升高，因?yàn)檠h(huán)數(shù)并不是影響敏感性的唯一因素，而且在實(shí)驗(yàn)過程中，也不可能因?yàn)樵黾用舾行远鵁o限制地增加循環(huán)數(shù)，這不僅是實(shí)踐中行不通，而且在理論上也不可行，因?yàn)殡S著循環(huán)數(shù)的增加，一方面，聚積的產(chǎn)物會(huì)抑制Taq酶的活性，另一方面，也會(huì)增加形成異源二聚體的可能性，這些都會(huì)影響到最終的定量結(jié)果。 Real time PCR的問題及解決方案Mg2的濃度如何進(jìn)行優(yōu)化？Mg2+濃度對敏感性的影響主要存在于兩方面

11、，首先， Mg2+是影響Taq酶活性的關(guān)鍵因素，如果Mg2+的濃度無法達(dá)到使Taq酶發(fā)揮最佳活性，無疑將會(huì)影響到實(shí)時(shí)定量的敏感性；其次， Mg2+的濃度過高，會(huì)增加引物二聚體的形成，從而導(dǎo)致敏感性降低。不僅如此，合適的MgCl2的濃度還能在反應(yīng)中得到較低的Ct值，較高的熒光信號(hào)強(qiáng)度以及良好的曲線峰值。所以對其的深度選擇應(yīng)慎重。一般來說，對以DNA或cDNA為模板的PCR反應(yīng)，應(yīng)選擇25mM濃度的MgCl2，對以mRNA為模板的RTPCR而言，則應(yīng)選擇的濃度為48mM。 Real time PCR的問題及解決方案模板的濃度多少合適？如果研究者是進(jìn)行首次實(shí)驗(yàn)，那么應(yīng)選擇一系列稀釋濃度的模板來進(jìn)行實(shí)

12、驗(yàn)，以選擇出最為合適的模板濃度，如果條件困難，也至少要選擇兩個(gè)稀釋度（高和中、低濃度）來進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。一般而言，使Ct位于1530個(gè)循環(huán)比較合適，若大于30則應(yīng)使用較高的模板濃度，如果Ct小于15則應(yīng)選擇較低的模板深度。對于Ct值的確定，經(jīng)驗(yàn)上是SYBR Green I探針的熒光信號(hào)比本底高2倍，雜交探針的熒光強(qiáng)度比本底高0.3倍?；蚪MDNA在50ng-5pg之間選擇，質(zhì)粒DNA在106拷貝數(shù)左右選擇。 Real time PCR的問題及解決方案引物的濃度如何選擇？引物的濃度是一個(gè)影響PCR反應(yīng)的關(guān)鍵因素，其濃度太低，會(huì)致使反應(yīng)不完全，若引物太多，則發(fā)生錯(cuò)配以及產(chǎn)生非特異的產(chǎn)物的可能性會(huì)大大增加

13、。對于大多數(shù)PCR反應(yīng)，0.5uM是個(gè)合適的濃度，若初次選用這個(gè)濃度不理想，可在0.31.0uM之間進(jìn)行選擇，直至達(dá)到滿意的結(jié)果。退火溫度怎么設(shè)計(jì)？首次實(shí)驗(yàn)設(shè)置的退火溫度應(yīng)比計(jì)算得出的Tm值小5，然后在12內(nèi)進(jìn)行選擇。一般地，退火溫度要根據(jù)經(jīng)驗(yàn)來確定，這個(gè)經(jīng)驗(yàn)值往往會(huì)同計(jì)算得到的Tm值有較大的差距。 Real time PCR的問題及解決方案雜交探針的濃度如何設(shè)置？初實(shí)驗(yàn)用0.2 uM，如果熒光信號(hào)強(qiáng)度不足，可以增加至0.4uM。熒光域值（threshold）如何設(shè)定？PCR反應(yīng)的前15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)作為熒光本底信號(hào)，熒光域值的缺省設(shè)置是3-15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍，即：thr

14、eshold = 10*SD(cycle 3-15) Real time PCR的問題及解決方案Real time PCR的問題及解決方案Realtime PCR所使用的核酸的純度要求要求盡量的純可以使用市售的試劑盒進(jìn)行純化如果使用酚氯仿的方法需要注意：殘余的酚會(huì)影響逆轉(zhuǎn)錄的效率并且使RNA的值偏高（使用紫外測定的時(shí)候）可以使用DNAase來處理RNA但是如果使用一些探針進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的時(shí)候需要注意后續(xù)的去除或者滅活。Real time PCR的問題及解決方案利用Realtime PCR定量RNA的時(shí)候需要注意什么?反轉(zhuǎn)錄最好使用基于MMLV使用隨機(jī)引物的方法來反轉(zhuǎn)錄總RNA。隨機(jī)引物的傾向性最小，

15、如果使用序列特異性的引物或者OligodT的話RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)以及PolyA的長度會(huì)影響其偏向性。并且限制了18sRNA在相對定量中的應(yīng)用。盡量采取兩步法而不要使用一步法反轉(zhuǎn)錄因?yàn)閮刹椒軌虮M量少操作容易降解的RNA。一步法由于酯的堆積以及溶液成分的缺少會(huì)造成低表達(dá)量的基因的轉(zhuǎn)錄被高表達(dá)量的基因的轉(zhuǎn)錄抑制。設(shè)計(jì)的引物和探針需要跨內(nèi)含子Real time PCR的問題及解決方案Realtime PCR的重現(xiàn)性很差怎么辦？ PCR 反應(yīng)擴(kuò)增的效率，如果在反應(yīng)體系中擴(kuò)增效率不一致，就會(huì)影響到目的基因在單位時(shí)間內(nèi)的產(chǎn)量發(fā)生差異，從而影響到結(jié)果的穩(wěn)定，要解決這個(gè)問題，必須盡量優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，使反應(yīng)體系達(dá)到

16、最佳擴(kuò)增效率。目的基因的初始濃度，初始拷貝數(shù)越低，結(jié)果的重復(fù)性越差，為了保證獲得精確的結(jié)果，應(yīng)使用初始濃度具有較高數(shù)量級(jí)的樣本，如果待測樣本中目的基因的量處于反應(yīng)體系的檢出限附近，那么最好是使用復(fù)孔以保證結(jié)果的可靠性。標(biāo)準(zhǔn)曲線的影響，對于必須進(jìn)行絕對定量的研究，標(biāo)準(zhǔn)曲線是必不可少的，雖然標(biāo)準(zhǔn)品和樣本之間的差異始終存在，但是制作一個(gè)好的標(biāo)準(zhǔn)曲線對定量結(jié)果至關(guān)重要，在制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，應(yīng)至少選擇5個(gè)稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)品，涵蓋待測樣本中目的基因量可能出現(xiàn)的全部濃度范圍，理想的標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)與樣本具有高同源性，最好是選擇純化的質(zhì)粒DNA 或是體外合成、轉(zhuǎn)錄的RNA（用于RT-PCR），在制備過程中，應(yīng)使用規(guī)范的步驟

17、或是根據(jù)所購買的試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)操作手冊進(jìn)行。 Real time PCR的問題及解決方案Realtime PCR的重現(xiàn)性很差怎么辦？ 如果有可能盡量選擇體積較大的測試體積（50l)。避免人為地失誤（錯(cuò)加，漏加等)如果可能盡量選擇板子中間作為實(shí)驗(yàn)孔反應(yīng)之前進(jìn)行離心以便消除泡沫和粘掛在管壁上的樣品重復(fù)孔，并且使用Master mix加入管家熒光ROXReal time PCR的問題及解決方案非特異性的信號(hào)怎么解決？ 反應(yīng)體系中形成的引物二聚體非特異性擴(kuò)增由于SYBR Green I可以與所有的雙鏈DNA結(jié)合,所以會(huì)在反應(yīng)體系中出現(xiàn)特異性產(chǎn)物與引物二聚體競爭SYBR Green I的現(xiàn)象,從而降低了實(shí)時(shí)PCR的敏感性。要解決這個(gè)問題，有多種方案可供選擇，首先可以用水解探針代替SYBR Green I，雖然水解探針并不能消除引物二聚體的或者非特異性擴(kuò)增的形成，但是在定量檢測時(shí)，它卻可以避開二者的干擾，專一地測定來自于特異產(chǎn)物的熒光信號(hào)?？梢允褂脽釂?dòng)辦法，所謂熱啟動(dòng)是指在反應(yīng)體系達(dá)到引物退火溫度時(shí)才加入某一反應(yīng)成分，因?yàn)橐锒垠w和非特異性擴(kuò)增是在各種試劑一經(jīng)混合便開始形成的，所以用這種方法能有效地減少二者的形成要盡可能地優(yōu)化引物設(shè)計(jì)，例如所設(shè)計(jì)的兩條引物不能互補(bǔ)（尤其在3端），使兩條引物的GC含量大致一致