血清球蛋白的提純

1、血清球蛋白的提純實驗思路蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)有哪些？蛋白質(zhì)的分離方法有哪些？本次實驗利用了哪個性質(zhì)？ 1.掌握鹽析、凝膠層析、透析法分離純化蛋白質(zhì)的基本原理及操作；2.掌握離心機的操作；3.熟悉蛋白質(zhì)定性檢測的方法；分離蛋白質(zhì)的方法分離方法沉淀法鹽析法有機溶劑沉淀法層析法電學法電泳法等電聚焦超速離心法離子交換層析吸附層析凝膠過濾（分子篩）親和層析 定義：加入大量中性鹽以破壞蛋白質(zhì)的穩(wěn)定因素并 使從溶液中沉淀析出的現(xiàn)象。 原理: 破壞蛋白質(zhì)兩個穩(wěn)定因素：水化膜和電荷層中性鹽：(NH4)2SO4、Na2SO4、NaCl等。優(yōu)點：蛋白質(zhì)不變性，常用。 （一）鹽 析 法 【實驗原理】 （二）層析法待分離物

2、質(zhì)(流動相)經(jīng)過一個固態(tài)物質(zhì)(固定相)時，根據(jù)溶液中待分離物質(zhì)顆粒大小、電荷多少及親和力等，使待分離蛋白組分在兩相中反復分配，并以不同流速流經(jīng)固定相實現(xiàn)分離。凝膠層析法 定義：利用半透膜把大小分子分開的方法。材料：特制的半透膜，截止分子量一般為一萬。（三）透 析 法 臨床應用：血液透析 （四）離心技術 離心技術 是將含有微小顆粒的懸浮液置于離心轉(zhuǎn)子中，利用轉(zhuǎn)子繞軸旋轉(zhuǎn)產(chǎn)生的離心力將微小顆粒按密度或質(zhì)量的差異將其分離的方法。沉降速度(v) 指在強大的離心力作用下，單位時間內(nèi)物質(zhì)顆粒沿半徑方向運動的距離。 v=6.09210-4D2（m）n2r/m D 顆粒直徑 顆粒的密度m 介質(zhì)的密度m 介質(zhì)粘

3、度 r 旋轉(zhuǎn)半徑（物質(zhì)質(zhì)點所處位置與旋轉(zhuǎn)中心的距離） N 轉(zhuǎn)子轉(zhuǎn)速 離心操作要領1、根據(jù)待離心的溶液性質(zhì)及體積選擇合適的離心管。裝載液體時要按各種離心機操作說明進行。無蓋離心管不能裝的太滿。密封的或有蓋離心管常要求裝滿，以免離心管變形。 2、精確地平衡離心管及其內(nèi)容物。3、平衡后的離心管和內(nèi)容物（包括套筒）應對稱放置4、啟動離心時離心速度由慢到快，當?shù)竭_離心時間時， 開啟減速或速度調(diào)節(jié)旋鈕減速。 檢測蛋白質(zhì) 雙二縮脲試劑：溶液顯紫紅色 20磺柳酸 ：有白色沉淀產(chǎn)生檢測NH4+ 納氏試劑：黃色或棕色五、檢測蛋白質(zhì)、 NH4+的方法1. 鹽 析 透 析 脫 鹽4. 檢 測 1.鹽析取離心管一支加入

4、血清2ml加入2ml PBS搖勻逐滴加入pH7.2飽和(NH4)2SO4 2ml,搖勻上清液（主要含清蛋白）傾入試管中靜止10分鐘，再離心（2000轉(zhuǎn)/分）10分鐘沉淀用1ml PBS攪拌溶解逐滴加飽和(NH4)2SO4 0.5ml,搖勻靜止10分鐘，再離心（2000轉(zhuǎn)/分）10分鐘傾棄上清液（主要含、球蛋白）沉淀即為初步純化的球蛋白透 析脫 鹽 2.透 析清蛋白 換 水透析袋剛放入水中時,立即取袋外液體檢查有無NH4；每隔4分鐘檢查一次，共3次，比較NH4透出的情況。 約0.5小時，檢查袋外液體的NH4；取袋外液2滴，置于小試管中，然后滴加20磺柳 酸12滴，觀察有無沉淀產(chǎn)生。 3.脫鹽 1

5、 2 3 4 5 6 7 8 9 10上樣球蛋白，PBS 10滴溶解 裝柱 葡聚糖凝膠G25，柱 高3/42/3柱長流速：每分鐘10滴左右 加入洗脫劑PBS 10ml 收集20滴換一支試管.層析后洗脫液檢測每組兩塊比色板,洗凈備用。一塊在各孔滴加納氏試劑（檢測NH4+）,另一塊滴加雙二縮脲試劑（檢測蛋白質(zhì)）。若發(fā)現(xiàn)有顯色反應此孔顯色劑棄用。不用滴管,避免污染,直接倒用“-”表示無現(xiàn)象，用“+”, “+”, “+”等表示顏色深淺 回收凝膠 表1. 層析后洗脫液的顯色結(jié)果表2. 透析后的袋外溶液顯色結(jié)果試管編號12345678910縮二脲試劑檢測后現(xiàn)象納氏試劑檢測后現(xiàn)象檢測次數(shù)123456試 劑納

6、氏試劑納氏試劑納氏試劑納氏試劑納氏試劑20%磺柳酸現(xiàn) 象棕色（+） .使用離心機的操作注意事項。.裝柱時檢查是否有尼龍布，是否漏水。.裝柱后凝膠均一無斷層，無氣泡，柱床面平整。.柱床面保持有緩沖液。.層析加樣時動作緩慢輕柔，不要破壞柱床面的平整。.每用一次滴管，請用水清洗干凈，防止試劑及被測樣品交叉污染思 考 1為何硫酸銨能沉淀蛋白質(zhì)?第一次鹽析時硫酸銨的飽和度是多少?沉淀的是何種蛋白質(zhì)，使沉淀溶解再次鹽析的目的是什么?2根據(jù)凝膠過濾原理解釋Sephadex G25脫鹽的實驗結(jié)果。3用硫酸銨分段沉淀蛋白質(zhì)時，透析袋外液體會出現(xiàn)蛋白質(zhì)嗎?你能否做一個小實驗加以證實，并說明實驗原理。4. 請用已學習的方法來證明本次實驗每次離心后所得的樣品是血清蛋白