血清球蛋白的提純

1、血清球蛋白的提純實驗思路蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)有哪些？蛋白質(zhì)的分離方法有哪些？本次實驗利用了哪個性質(zhì)？ 1.掌握鹽析、凝膠層析、透析法分離純化蛋白質(zhì)的基本原理及操作；2.掌握離心機的操作；3.熟悉蛋白質(zhì)定性檢測的方法；分離蛋白質(zhì)的方法分離方法沉淀法鹽析法有機溶劑沉淀法層析法電學(xué)法電泳法等電聚焦超速離心法離子交換層析吸附層析凝膠過濾（分子篩）親和層析 定義：加入大量中性鹽以破壞蛋白質(zhì)的穩(wěn)定因素并 使從溶液中沉淀析出的現(xiàn)象。 原理: 破壞蛋白質(zhì)兩個穩(wěn)定因素：水化膜和電荷層中性鹽：(NH4)2SO4、Na2SO4、NaCl等。優(yōu)點：蛋白質(zhì)不變性，常用。 （一）鹽 析 法 【實驗原理】 （二）層析法待分離物

2、質(zhì)(流動相)經(jīng)過一個固態(tài)物質(zhì)(固定相)時，根據(jù)溶液中待分離物質(zhì)顆粒大小、電荷多少及親和力等，使待分離蛋白組分在兩相中反復(fù)分配，并以不同流速流經(jīng)固定相實現(xiàn)分離。凝膠層析法 定義：利用半透膜把大小分子分開的方法。材料：特制的半透膜，截止分子量一般為一萬。（三）透 析 法 臨床應(yīng)用：血液透析 （四）離心技術(shù) 離心技術(shù) 是將含有微小顆粒的懸浮液置于離心轉(zhuǎn)子中，利用轉(zhuǎn)子繞軸旋轉(zhuǎn)產(chǎn)生的離心力將微小顆粒按密度或質(zhì)量的差異將其分離的方法。沉降速度(v) 指在強大的離心力作用下，單位時間內(nèi)物質(zhì)顆粒沿半徑方向運動的距離。 v=6.09210-4D2（m）n2r/m D 顆粒直徑 顆粒的密度m 介質(zhì)的密度m 介質(zhì)粘

3、度 r 旋轉(zhuǎn)半徑（物質(zhì)質(zhì)點所處位置與旋轉(zhuǎn)中心的距離） N 轉(zhuǎn)子轉(zhuǎn)速 離心操作要領(lǐng)1、根據(jù)待離心的溶液性質(zhì)及體積選擇合適的離心管。裝載液體時要按各種離心機操作說明進行。無蓋離心管不能裝的太滿。密封的或有蓋離心管常要求裝滿，以免離心管變形。 2、精確地平衡離心管及其內(nèi)容物。3、平衡后的離心管和內(nèi)容物（包括套筒）應(yīng)對稱放置4、啟動離心時離心速度由慢到快，當?shù)竭_離心時間時， 開啟減速或速度調(diào)節(jié)旋鈕減速。 檢測蛋白質(zhì) 雙二縮脲試劑：溶液顯紫紅色 20磺柳酸 ：有白色沉淀產(chǎn)生檢測NH4+ 納氏試劑：黃色或棕色五、檢測蛋白質(zhì)、 NH4+的方法1. 鹽 析 透 析 脫 鹽4. 檢 測 1.鹽析取離心管一支加入

4、血清2ml加入2ml PBS搖勻逐滴加入pH7.2飽和(NH4)2SO4 2ml,搖勻上清液（主要含清蛋白）傾入試管中靜止10分鐘，再離心（2000轉(zhuǎn)/分）10分鐘沉淀用1ml PBS攪拌溶解逐滴加飽和(NH4)2SO4 0.5ml,搖勻靜止10分鐘，再離心（2000轉(zhuǎn)/分）10分鐘傾棄上清液（主要含、球蛋白）沉淀即為初步純化的球蛋白透 析脫 鹽 2.透 析清蛋白 換 水透析袋剛放入水中時,立即取袋外液體檢查有無NH4；每隔4分鐘檢查一次，共3次，比較NH4透出的情況。 約0.5小時，檢查袋外液體的NH4；取袋外液2滴，置于小試管中，然后滴加20磺柳 酸12滴，觀察有無沉淀產(chǎn)生。 3.脫鹽 1

5、 2 3 4 5 6 7 8 9 10上樣球蛋白，PBS 10滴溶解 裝柱 葡聚糖凝膠G25，柱 高3/42/3柱長流速：每分鐘10滴左右 加入洗脫劑PBS 10ml 收集20滴換一支試管.層析后洗脫液檢測每組兩塊比色板,洗凈備用。一塊在各孔滴加納氏試劑（檢測NH4+）,另一塊滴加雙二縮脲試劑（檢測蛋白質(zhì)）。若發(fā)現(xiàn)有顯色反應(yīng)此孔顯色劑棄用。不用滴管,避免污染,直接倒用“-”表示無現(xiàn)象，用“+”, “+”, “+”等表示顏色深淺 回收凝膠 表1. 層析后洗脫液的顯色結(jié)果表2. 透析后的袋外溶液顯色結(jié)果試管編號12345678910縮二脲試劑檢測后現(xiàn)象納氏試劑檢測后現(xiàn)象檢測次數(shù)123456試 劑納

6、氏試劑納氏試劑納氏試劑納氏試劑納氏試劑20%磺柳酸現(xiàn) 象棕色（+） .使用離心機的操作注意事項。.裝柱時檢查是否有尼龍布，是否漏水。.裝柱后凝膠均一無斷層，無氣泡，柱床面平整。.柱床面保持有緩沖液。.層析加樣時動作緩慢輕柔，不要破壞柱床面的平整。.每用一次滴管，請用水清洗干凈，防止試劑及被測樣品交叉污染思 考 1為何硫酸銨能沉淀蛋白質(zhì)?第一次鹽析時硫酸銨的飽和度是多少?沉淀的是何種蛋白質(zhì)，使沉淀溶解再次鹽析的目的是什么?2根據(jù)凝膠過濾原理解釋Sephadex G25脫鹽的實驗結(jié)果。3用硫酸銨分段沉淀蛋白質(zhì)時，透析袋外液體會出現(xiàn)蛋白質(zhì)嗎?你能否做一個小實驗加以證實，并說明實驗原理。4. 請用已學(xué)習的方法來證明本次實驗每次離心后所得的樣品是血清蛋白