細(xì)胞培養(yǎng)基礎(chǔ)問答細(xì)胞培養(yǎng)基本技術(shù)

1、細(xì)胞培養(yǎng)基礎(chǔ)問答. BHK細(xì)胞就是指 BHK21 嗎？答：BHK細(xì)胞是指幼年敘利亞地鼠腎細(xì)胞( Baby Hamster Syrian Kidney ) , 1961年建株。原始的細(xì)胞株是 成纖維細(xì)胞，貼壁依賴性。1963年獲得單細(xì)胞克隆細(xì)胞。后經(jīng)無數(shù)次傳代后細(xì)胞可懸浮生長，它廣泛用于 增殖各種病毒，生產(chǎn)獸用疫苗。最常用的是BHK21的一個(gè)亞克隆細(xì)胞，即克隆 13或C13 o.二倍體細(xì)胞有什么特點(diǎn)？答：二倍體細(xì)胞的染色體組型是2n核型；貼壁依賴接觸抑制；一般可傳代培養(yǎng)50代；無致瘤性。如W1-38 :正常胚肺組織人二倍體細(xì)胞系。MRC-5:從正常男性肺組織中獲得的人二倍體細(xì)胞系。.什么是動(dòng)物細(xì)

2、胞大規(guī)模培養(yǎng)？答：所謂動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)(large-scale culture technology )是指在人工條件下(設(shè)定 pH、溫度、 溶氧等)，在細(xì)胞生物反應(yīng)器(bioreactor )中高密度大量培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞用于生產(chǎn)生物制品的技術(shù)。目前可 大規(guī)模培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞有雞胚、豬腎、猴腎、地鼠腎等多種原代細(xì)胞及人二倍體細(xì)胞、CHO (中華倉鼠卵巢)細(xì)胞、BHK-21、Vero細(xì)胞(非洲綠猴腎傳代細(xì)胞)等，并已成功生產(chǎn)了包括狂犬病疫苗、口蹄疫疫苗、 甲型肝炎疫苗、乙型肝炎疫苗、紅細(xì)胞生成素、單克隆抗體等產(chǎn)品。在過去幾十年來，細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)經(jīng)有了很大發(fā)展，從使用轉(zhuǎn)瓶(roller bottle

3、) 、CellCube等貼壁細(xì)胞培養(yǎng)，發(fā)展為生物反應(yīng)器(Bioreactor )進(jìn)行大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)。.細(xì)胞體內(nèi)外培養(yǎng)的差別是什么？答：細(xì)胞離體后，失去了神經(jīng)體液的調(diào)節(jié)和細(xì)胞間的相互影響，生活在缺乏動(dòng)態(tài)平衡相對穩(wěn)定環(huán)境中，日 久天長，易發(fā)生如下變化：分化現(xiàn)象減弱；形態(tài)功能趨于單一化或生存一定時(shí)間后衰退死亡；或發(fā)生轉(zhuǎn)化 獲得不死性，變成可無限生長的連續(xù)細(xì)胞系或惡性細(xì)胞系。因此，培養(yǎng)中的細(xì)胞可視為一種在特定的條件 下的細(xì)胞群體，它們既保持著與體內(nèi)細(xì)胞相同的基本結(jié)構(gòu)和功能，也有一些不同于體內(nèi)細(xì)胞的性狀。實(shí)際 上從細(xì)胞一旦被置于體外培養(yǎng)后，這種差異就開始發(fā)生了。.什么是無血清培養(yǎng)基？與普通培養(yǎng)基有什么區(qū)

4、別？答：無血清培養(yǎng)基(serum free medium,SFM): 是不需要添加血清就可以維持細(xì)胞在體外較長時(shí)間生長繁殖 的合成培養(yǎng)基。但是它們可能包含個(gè)別蛋白或大量蛋白組分。基本成分為基礎(chǔ)培養(yǎng)基及添加組分兩大部分。添加組分可能包括纖連蛋白、層粘連蛋白等貼壁因子、胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、硒等。.什么是無血清無動(dòng)物組分培養(yǎng)基、無蛋白培養(yǎng)基和限定化學(xué)成分培養(yǎng)基？答：無血清無動(dòng)物組分培養(yǎng)基是不含任何動(dòng)物來源成份的無血清培養(yǎng)基，但可能添加植物蛋白或重組蛋白。無蛋白培養(yǎng)基(protein free midium,PFM ):即不含有蛋白的培養(yǎng)基，無論是植物蛋白或動(dòng)物蛋白。成分培養(yǎng)基(chemical def

5、ined medium,CDM):是指培養(yǎng)基中的素有成分都是明確的，它同樣不含有蛋白， 也不是添加了植物水解物，而是使用了一些已知結(jié)構(gòu)與功能的小分子化合物，如短肽等。這種培養(yǎng)基更有 利于分析細(xì)胞的分泌產(chǎn)物和產(chǎn)品純化。. HEPES在細(xì)胞培養(yǎng)過程中起什么作用？答：HEPES溶液：是一種弱酸，中文名字是羥乙基哌秦乙硫磺酸，主要作用是防止培養(yǎng)基pH迅速變動(dòng)。在開放式培養(yǎng)條件下，觀察細(xì)胞時(shí)培養(yǎng)基脫離了5%CO2的環(huán)境，CO2氣體迅速逸出，pH迅速升高，若加了 HEPES,此時(shí)可以維持 pH7.0左右。一般在進(jìn)行克隆化培養(yǎng)時(shí)要添加 HEPESo. CO2培養(yǎng)箱之水盤如何保持清潔？答：定期(至少每兩周一次

6、)以無菌蒸儲水或無菌去離子水更換之。培養(yǎng)基生產(chǎn)和使用常見問題.低血清培養(yǎng)基能用肉眼判斷其pH值嗎?答：低血清培養(yǎng)基中酚紅的含量與普通培養(yǎng)基中的酚紅含量不同，不能通過肉眼觀察或通過經(jīng)驗(yàn)來判定pH值，建議使用pH計(jì)進(jìn)行測定。.低血清培養(yǎng)基的緩沖系統(tǒng)是什么？答：平衡鹽一般是由無機(jī)鹽及葡萄糖組成的。平衡鹽有Hanks系統(tǒng)、Earle 系統(tǒng)、Dulbecco磷酸緩沖鹽系統(tǒng)等。199系列培養(yǎng)基、MEM系列培養(yǎng)基均有 Hanks系統(tǒng)的培養(yǎng)基及 Earle 系統(tǒng)的培養(yǎng)基。但是有些 培養(yǎng)基均不是以上常規(guī)的平衡鹽系統(tǒng)，例如RPMI 1640培養(yǎng)基、F12培養(yǎng)基。MEM(SLM)低血清培養(yǎng)基的平衡鹽系統(tǒng)也不是常規(guī)的

7、平衡鹽系統(tǒng)，該平衡鹽系統(tǒng)的緩沖能力強(qiáng)于常規(guī)平衡鹽系統(tǒng)的緩沖能力。.谷氨酰胺溶液和碳酸氫鈉的配制方法是什么？答：以0.2mol/L的L-谷氨酰胺配制為例：稱取 L-谷氨酰胺2.92g,加注射用水100ml ,充分?jǐn)嚢杌靹?。?.2濾膜正壓過濾除菌。溶液應(yīng)在 4 c下避光保存，2周內(nèi)使用。以7.5% NaHCO3的配制為例：稱取 NaHCO37.5g溶于100ml蒸儲水中過濾除菌。.什么培養(yǎng)基中可以省去加酚紅？答：酚紅在培養(yǎng)基中用作 pH值的指示劑：中性時(shí)為紅色，酸性時(shí)為黃色，堿性時(shí)為紫色。酚紅本身對生物制品質(zhì)量并不會產(chǎn)生影響，可以通過純化技術(shù)去除，但酚紅在無血清培養(yǎng)基可能帶來胞內(nèi)鈉/鉀失衡，影響

8、細(xì)胞生長，當(dāng)然這種作用能被血清所中和或減輕。酚紅并不是培養(yǎng)基中必需的一種成分，很多國外的疫苗或抗體生產(chǎn)企業(yè)在生產(chǎn)過程中都使用無酚紅培養(yǎng)基。.放置在冰箱中的培養(yǎng)基顏色會發(fā)生變化，為什么？答：培養(yǎng)基保存于4c冰箱中，培養(yǎng)基內(nèi) CO2會逐漸溢出，造成培養(yǎng)基越來越偏堿性。而培養(yǎng)基中酸堿指 示劑(通常為phenol red)的顏色也會隨堿性增加而更偏暗紅。培養(yǎng)基偏堿后再用于細(xì)胞培養(yǎng)將造成細(xì)胞 生長停滯或死亡。培養(yǎng)基偏堿時(shí)，可以通入無菌過濾的CO2,以調(diào)整pH值。.無血清培養(yǎng)與有血清培養(yǎng)使用的抗生素量一樣嗎？答：當(dāng)在無血清培養(yǎng)基中添加抗生素時(shí)，降低至少在有血清培養(yǎng)基中所使用濃度的50% o因?yàn)檠逯械牡鞍?/p>

9、會結(jié)合和滅活一些抗生素。而在無血清培養(yǎng)條件下，抗生素不被滅活。.培養(yǎng)基中添加了血清和抗生素后，可長期保存嗎？答：一旦您在新鮮培養(yǎng)基中添加了血清和抗生素時(shí)，您應(yīng)該在兩到三周內(nèi)使用它。因?yàn)橐恍┛股睾脱?中的基本成分在解凍后就開始降解。.什么是個(gè)性化培養(yǎng)基？它有什么優(yōu)點(diǎn)？答：根據(jù)細(xì)胞類型、培養(yǎng)方式和生產(chǎn)工藝等特點(diǎn)所定制的培養(yǎng)基，即個(gè)性化培養(yǎng)基。個(gè)性化培養(yǎng)基在國外 生物制藥企業(yè)被普遍采用，個(gè)性化培養(yǎng)基可以為細(xì)胞生長提供充足的營養(yǎng)物質(zhì)，能提高細(xì)胞的生長速率、 培養(yǎng)密度、以及延長細(xì)胞維持時(shí)間；也可以為細(xì)胞生長提供均衡的營養(yǎng)供給，減少細(xì)胞有害代謝物質(zhì)的積 累，降低對細(xì)胞生長的危害；同時(shí)對貼壁細(xì)胞而言，能

10、增加細(xì)胞的貼壁性，并降低培養(yǎng)過程中剪切力對細(xì) 胞的損傷；個(gè)性化培養(yǎng)基可以根據(jù)各戶的特殊需求減少或不使用動(dòng)物源成分，從而使生物制品安全性更有 保障。.細(xì)胞培養(yǎng)基偶然被凍，可否繼續(xù)使用？答：如果細(xì)胞培養(yǎng)基偶然被凍，您應(yīng)該自然溶解培養(yǎng)基并觀察是否有沉淀產(chǎn)生。如果沒有沉淀產(chǎn)生，培養(yǎng) 基可以正常使用，如果出現(xiàn)沉淀，只能丟棄這些培養(yǎng)基。.細(xì)胞冷凍培養(yǎng)基之成份為何？答：動(dòng)物細(xì)胞冷凍保存時(shí)最常使用的冷凍培養(yǎng)基是含5 - 10%DMSO (dimethyl sulfoxide) 和90 - 95%原來細(xì)胞生長用的新鮮培養(yǎng)基均勻混合。注意：由于 DMSO稀釋時(shí)會放出大量熱能，故不可將 DMSO直接加入 細(xì)胞液中，

11、必須使用前先行配制完成。.培養(yǎng)基及其它添加物和試劑可反復(fù)凍融嗎？答：大部分添加物和試劑最多可以凍融3次，如果次數(shù)過多會將使含有的蛋發(fā)生降解和沉淀，這將會影響它的性能。.液體培養(yǎng)基的保存是冷藏好？還是冷凍好？答：要冷藏！ ！通常液體培養(yǎng)基在冷藏條件下可存放 6個(gè)月到一年常見血清使用問題.血清使用時(shí)一定需要滅活么？答：實(shí)驗(yàn)顯示，經(jīng)過正確處理的熱滅活血清對大多數(shù)的細(xì)胞而言是不需要的。經(jīng)此處理過的血清對細(xì)胞的 生長只有微小的促進(jìn)，或完全沒有任何作用，甚至因?yàn)楦邷靥幚碛绊懥搜宓馁|(zhì)量，而造成細(xì)胞生長速率 的降低。而經(jīng)過熱處理的血清，沉淀物的形成會顯著的增多，這些沉淀物在倒置顯微鏡下觀察，像是小黑點(diǎn)”，常

12、常會讓研究者誤以為是血清遭受污染，而把血清放在37c環(huán)境中，又會使此沉淀物更增多，使研究者誤認(rèn)為是微生物的分裂擴(kuò)增。若非必須，可以不需要做熱處理這一步。不但節(jié)省時(shí)間，更確保血清的 質(zhì)量。.何謂 FBS, FCS, CS, HS?答：FBS (fetal bovine serum) 和FCS (fetal calf serum) 是相同的意思，兩者都是指胎牛血清，F(xiàn)CS乃錯(cuò)誤的使用字眼，請不要再使用。CS (calf serum)則是指小牛血清。HS (horseserum)則是指馬血清。.保存血清最好的方法是什么 ？答：我們建議血清應(yīng)保存在-5C至-2OC。若存放于4c時(shí)，請勿超過一個(gè)月。若一

13、次無法用完一瓶，建議 無菌分裝血清至恰當(dāng)?shù)臏缇萜鲀?nèi)，再放回冷凍。 TOC o 1-5 h z .如何解凍血清才不會使產(chǎn)品質(zhì)量受損？答：將血清從冷凍箱取出后，先置于28c冰箱使之融解，然后在室溫下使之全融。但必須注意的是，融解過程中必須規(guī)則地?fù)u晃均勻。.血清解凍后發(fā)現(xiàn)有絮狀沉淀物出現(xiàn)，該如何處理？答：血清中沉淀物的出現(xiàn)有許多種原因，但最普遍的原因是由于血清中脂蛋白的變性所造成，而血纖維蛋 白(形成凝血的蛋白之一)在血清解凍后，也會存在于血清中，亦是造成沉淀物的原因之一。但這些絮狀沉 淀物，并不影響血清本身的質(zhì)量。若欲去除這些絮狀沉淀物，可以將血清分裝至無菌離心管內(nèi)，以400g稍微離心，上清液即

14、可接著加入培養(yǎng)基內(nèi)一起過濾。最好不使用過濾的方法去除這些絮狀沉淀物，因?yàn)樗?能會阻塞過濾膜。.如何避免血清中沉淀物的產(chǎn)生 ？答：(1)解凍血清時(shí)，請按照所建議的逐步解凍法(-20 C至4c至室溫)，若血清解凍時(shí)改變的溫度太大(如-20 C至37C),非常容易產(chǎn)生沉淀物。(2)解凍血清時(shí)，請隨時(shí)將之搖晃均勻，使溫度及成分均一，減少沉淀的發(fā)生。(3)請勿將血清置于37 c太久。若在37 c放置太久，血清會變得混濁，同時(shí)血清中許多較不穩(wěn)定的成分也 會因此受到損害，而影響血清的質(zhì)量。(4)血清的熱滅活非常容易造成沉淀物的增多，若非必要，可以無須做此步驟。(5)若必須做血清的熱滅活，請遵守56 C,

15、30分鐘的原則，并且隨時(shí)搖晃均勻。溫度過高，時(shí)間過久或搖晃不均勻，都會造成沉淀物的增多。細(xì)胞培養(yǎng)常用試劑使用問答.谷氨酰胺使用方法是什么？答：谷氨酰胺在溶液中很不穩(wěn)定，故4c下放置1周可分解50% ,使用中最好單獨(dú)配制， 置-20 C冰箱中保存，用前加入培養(yǎng)液中。.碳酸氫鈉在室溫條件存放是否穩(wěn)定？答：碳酸氫鈉白色粉末，或不透明單斜晶系細(xì)微結(jié)晶。比重2.159 o無臭、味咸，可溶于水，微溶于乙醇。其水溶液因水解而呈微堿性，受熱易分解，在65c以上迅速分解，在 270 c時(shí)完全失去二氧化碳，在干燥 空氣中無變化，在潮濕空氣中緩慢分解。3,培養(yǎng)細(xì)胞生長減慢的原因有哪些？其解決辦法有哪些？答：可能得原

16、因有：更換了不同的培養(yǎng)液或血清；培養(yǎng)液中一些細(xì)胞生長必需成分如谷氨酰胺或生長因子 等耗盡或缺乏或已被破壞；培養(yǎng)物中有少量細(xì)菌或真菌污染；試劑保存不當(dāng)；比較新培養(yǎng)液與原培養(yǎng)液成 分，比較新血清與舊血清支持細(xì)胞生長實(shí)驗(yàn)找出可能的原因。解決辦法：增加起始培養(yǎng)細(xì)胞濃度；讓細(xì)胞逐漸適應(yīng)新培養(yǎng)液；換入新鮮配制培養(yǎng)液；補(bǔ)加谷氨酰胺或生長因子等；用無抗生素培養(yǎng)液培養(yǎng)，如發(fā)現(xiàn)污染，丟棄培養(yǎng)物，或用抗生素除菌；血清需彳存在-5 C到-20C; 培養(yǎng)液需在28 C避光保存；含血清完全培養(yǎng)液在2-8 C保存，并在2周內(nèi)用完；分離培養(yǎng)物，檢測支原體。. L-谷氨酰胺在細(xì)胞培養(yǎng)中重要嗎？它在溶液中不穩(wěn)定嗎？答：L-谷氨酰

17、胺在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)非常重要的。脫掉氨基后，L-谷氨酰胺可作為培養(yǎng)細(xì)胞的能量來源、參與蛋白質(zhì)的合成和核酸代謝。L-谷氨酰胺在溶液中經(jīng)過一段時(shí)間后會降解，降解率隨保存溫度而變。L-谷氨酰胺的降解導(dǎo)致氨的形成，而氨對于一些細(xì)胞具有毒性。.細(xì)胞傳代消化時(shí)所用胰酶濃度越高越好嗎？答：不見得！因?yàn)橐鹊鞍酌溉芤旱南芰κ呛腿芤旱膒H、溫度、胰酶濃度及溶液中是否含有 Ca+, Mg+離子和血清等因素有關(guān)。通常情況下，pH 8.0 ,溫度37 oC其作用能力最強(qiáng)。另外，鈣、鎂離子及血清均能大大降低其消化能力。我們每次進(jìn)行傳代消化前，一定要用 D-Hanks液或PBS液反復(fù)沖洗細(xì)胞培養(yǎng)瓶， 以便于將含血清的培養(yǎng)基沖

18、洗干凈，這樣就能大大提高消化液的消化能力。通常使用的消化液濃度為：0.05 %胰蛋白酶+ 0.02%EDTA;0.25%胰蛋白酶多數(shù)細(xì)胞傳代消化可使用 0.25 %胰蛋白酶十0.02%EDTA這種消化液。6,二價(jià)離子抑制胰蛋白酶活性嗎？使用胰蛋白酶時(shí)加入EDTA的目的是什么？答：二價(jià)離子的確抑制月K蛋白酶活性。EDTA用來螯合游離的鎂離子和鈣離子，以便保持抑制胰蛋白酶的活性。建議胰蛋白酶處理細(xì)胞前，用EDTA清洗細(xì)胞，以消除來自培養(yǎng)基中所有的二價(jià)離子。7. GlutaMAX-I 是什么？培養(yǎng)細(xì)胞如何利用GlutaMAX-I ?這個(gè)二肽有多穩(wěn)定？答：GlutaMAX-I即谷丙氨酸二肽，是一個(gè)L-

19、谷氨酰胺的衍生物，其不穩(wěn)定的alpha-氨基用L-丙氨酸來保護(hù)。 一種肽酶逐漸裂解二肽，釋放 L-谷氨酰胺供利用。GlutaMAX-I二肽非常穩(wěn)定，即使在 121磅滅菌20分鐘，GlutaMAX-I二肽溶液有最小的降解，如果在相同條件下，L-谷氨酰胺幾乎完全降解。8,培養(yǎng)基中丙酮酸鈉的作用是什么？答：丙酮酸鈉可以作為細(xì)胞培養(yǎng)中的替代碳源，盡管細(xì)胞更傾向于以葡萄糖作為碳源，但是，如果沒有葡 萄糖的話，細(xì)胞也可以代謝丙酮酸鈉。9. Hank s平衡鹽溶液(HBS)和Earle 平衡鹽溶液(EBS)有什么本質(zhì)的功能差別？答：HBS和EBS的主要差別在于碳酸氫鈉的水平 ，在Eagle s (2.2g/

20、L)中比在Hanks (0.35g/L)中高。碳酸 氫鈉需用高水平的 CO2平衡，以維持溶液的PH值。Eagle液在空氣水平的CO2中，溶液會變堿，Hanks 液在CO2培養(yǎng)箱中會變酸。如果希望在 CO2培養(yǎng)箱中保存組織，需要用 Eagle藏，。如果僅僅是清洗將 要在細(xì)胞培養(yǎng)基中儲存的組織，用Hanks液就可以了。細(xì)胞培養(yǎng)過程常見問題1,為什么培養(yǎng)的細(xì)胞要及時(shí)傳代？答：體外培養(yǎng)的細(xì)胞大多具有生長接觸抑制的特性，也就是說當(dāng)一個(gè)細(xì)胞被其他細(xì)胞包圍的時(shí)候，它就會 停止生長，及時(shí)傳代后，細(xì)胞的生長得以繼續(xù)。2,培養(yǎng)液pH下降很快可能原因有哪些？其解決辦法是什么？答：通常細(xì)胞生長得非?？鞎r(shí)，pH值通常下

21、降得很快。此時(shí)可以及時(shí)傳代、提高傳代比例或降低血清量等方法進(jìn)行解決。止匕外，培養(yǎng)瓶蓋擰得太緊、NaHCO3緩沖系統(tǒng)緩沖能力不夠、培養(yǎng)液中鹽濃度不正確、細(xì)菌、酵母或真菌污染等也能導(dǎo)致pH值通常下降得很快。(1)按培養(yǎng)液中NaHCO3濃度增加或減少培養(yǎng)箱內(nèi)CO2濃度，2.0g/L到3.7g/L濃度NaHCO3對應(yīng)CO2濃度為5%到10%。(2)改用不依賴CO2培養(yǎng)液。(3)松開瓶蓋1/4圈。加HEPES緩沖?至10到25mM 終濃度。(4)在CO2培養(yǎng)環(huán)境中改用基于 Earle 叁配制的培養(yǎng)液，在大氣培養(yǎng)環(huán)境中培養(yǎng)改用Hanks鹽配制的培養(yǎng)液。(5)如果是污染造成的則丟棄培養(yǎng)物或用抗生素除菌。.培

22、養(yǎng)液pH對細(xì)胞生長的影響？答：由于大多數(shù)細(xì)胞適宜 pH為7.2-7.4 ,偏離此范圍可能對細(xì)胞生長將產(chǎn)生有害的影響。但各種細(xì)胞對 pH 的要求也不完全相同，原代培養(yǎng)細(xì)胞一般對pH變動(dòng)耐受差，無限細(xì)胞系耐受力強(qiáng)。但總體來說，細(xì)胞耐酸性比耐堿性強(qiáng)一些。在配制培養(yǎng)用液時(shí)，需要注意一點(diǎn)：培新配的培養(yǎng)基在經(jīng)過0.10um或0.22um濾膜過濾時(shí)，溶液的pH還會向上浮動(dòng)0.2左右。.購買之細(xì)胞冷凍管經(jīng)解凍后，為何會發(fā)生細(xì)胞數(shù)目太少之情形？答：研究人員在冷凍細(xì)胞之培養(yǎng)時(shí)出現(xiàn)細(xì)胞數(shù)目太少，大都是因?yàn)殡x心過程操作上的失誤，造成細(xì)胞的物 理性損傷，以及細(xì)胞流失。建議細(xì)胞解凍后不要立刻離心，應(yīng)待細(xì)胞生長隔夜后再更換

23、培養(yǎng)基即可。但對 于DMSO敏感的細(xì)胞，還是復(fù)蘇細(xì)胞時(shí)，用離心去除 DMSO比較好。.購買之細(xì)胞死亡或細(xì)胞存活率不佳可能原因？答：研究人員在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)出現(xiàn)存活率不佳，原因比較復(fù)雜，常見原因可歸納為：培養(yǎng)基使用錯(cuò)誤或培養(yǎng) 基品質(zhì)不佳；血清使用錯(cuò)誤或血清的品質(zhì)不佳；解凍過程錯(cuò)誤；冷凍細(xì)胞解凍后，加以洗滌細(xì)胞和離心； 懸浮細(xì)胞誤認(rèn)為死細(xì)胞；培養(yǎng)溫度使用錯(cuò)誤；細(xì)胞置于60 C太久等。建議嚴(yán)格參照 ATCC或ECACC的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程進(jìn)行細(xì)胞復(fù)蘇、凍存等工作。.支原體污染會對細(xì)胞培養(yǎng)有何影響？答：支原體污染幾乎可影響所有細(xì)胞之生長參數(shù)、代謝及研究之任一數(shù)據(jù)。故進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前，必須確認(rèn)細(xì)胞 為mycoplasm

24、a-free ,實(shí)驗(yàn)結(jié)果之?dāng)?shù)據(jù)方有意義。.冷凍保存細(xì)胞之方法？答：冷凍保存方法一：冷凍管置于4c (30 60分鐘)-20 C( 30分鐘)-80 C (1618小時(shí)或隔夜) 液氮罐長期儲存。冷凍保存方法二：冷凍管置于已設(shè)定程序之可程序降溫機(jī)中每分鐘降1-3C至勺0 C以下，再放入液氮中長期儲存。注意：-20 C不可超過1小時(shí)，以防止冰晶過大，造成細(xì)胞大量死亡，亦可跳過此步驟直接放 入-80 C冰箱中，惟存活率稍微降低一些。.懸浮細(xì)胞應(yīng)如何繼代處理？答：一般僅需持續(xù)加入新鮮培養(yǎng)基于原培養(yǎng)瓶中，稀釋細(xì)胞濃度即可。若培養(yǎng)液太多時(shí)可分瓶取出一部份 含細(xì)胞之培養(yǎng)液至另一新的培養(yǎng)瓶中，加入新鮮培養(yǎng)基稀釋

25、至適當(dāng)濃度，重復(fù)前述步驟即可。.欲將一般動(dòng)物細(xì)胞離心下來，其離心速率應(yīng)為多少轉(zhuǎn)速？答：欲回收動(dòng)物細(xì)胞，其離心速率一般為300X g (約1,000rpm) , 5 - 10分鐘，過高之轉(zhuǎn)速過長時(shí)間都將造成細(xì)胞死亡。合適的離心轉(zhuǎn)速是根據(jù)相對離心決定。RCF=1.119 05 M (rpm)2r為離心機(jī)轉(zhuǎn)軸中心與離心套管底部內(nèi)壁的距離；rpm為離心機(jī)每分鐘的轉(zhuǎn)數(shù)；RCF(relative eentrifugal force)為相對離心力，以重力加速度g (980.66cm/s2 )的倍數(shù)來表示表示單位。.培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)應(yīng)使用 5%還是10%CO2 ,或者根本沒有影響？答：一般培養(yǎng)基中大都使用 HCO3

26、-/CO32-/H+ 作為pH的緩沖系統(tǒng)， 而培養(yǎng)基中NaHCO3的含量將決定 細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)應(yīng)使用的 CO2濃度。當(dāng)培養(yǎng)基中NaHCO3含量為每公升3.7g時(shí)，細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)應(yīng)使用10% CO2 ;當(dāng)培養(yǎng)基中NaHCO3為每公升1.5g時(shí)，則應(yīng)使用5%CO2培養(yǎng)細(xì)胞。.細(xì)胞冷凍管解凍培養(yǎng)時(shí)，是否應(yīng)馬上去除DMSO ?答：除少數(shù)特別注明對 DMSO敏感之細(xì)胞外，絕大部分細(xì)胞株（包括懸浮性細(xì)胞），在解凍之后，應(yīng)直接放入含有10-15ml新鮮培養(yǎng)基之培養(yǎng)方瓶中，待隔天再置換新鮮培養(yǎng)基以去除DMSO即可，如此可避免大部分解凍后細(xì)胞無法生長或貼附之問題。.冷凍管應(yīng)如何解凍？答：取出冷凍管后，須立即放入37c水

27、槽中快速解凍，輕搖冷凍管使其在 1-2分鐘內(nèi)大部分融化，特別注意，需殘留一小塊冰塊，就可拿到超凈工作臺操作細(xì)胞，用 75%消毒凍存管，用新鮮培養(yǎng)基將細(xì)胞轉(zhuǎn)移 至培養(yǎng)瓶。另外冷凍管由液氮桶中取出解凍時(shí)，必須注意安全，預(yù)防冷凍管之爆裂。.如何用臺盼蘭計(jì)數(shù)活細(xì)胞？答：將樣品適當(dāng)稀釋后，用稀釋后的樣品和 0.4%的臺盼蘭溶液按1:1混合后，用移液槍點(diǎn)樣到血球計(jì)數(shù)板， 置于倒置顯微鏡下觀察、計(jì)數(shù)，其中藍(lán)色細(xì)胞是死細(xì)胞，因活細(xì)胞排斥臺盼蘭，不被染色。.細(xì)胞欲冷凍保存時(shí)，細(xì)胞冷凍管內(nèi)應(yīng)有多少細(xì)胞濃度？答：冷凍管內(nèi)細(xì)胞數(shù)目一般為 1-8X106 cells/ml vial 。.細(xì)胞冷凍培養(yǎng)基之成份為何？答：動(dòng)

28、物細(xì)胞冷凍保存時(shí)最常使用的冷凍培養(yǎng)基是含9 - 10 %DMSO （dimethyl sulfoxide） 和90 - 95 % 原來細(xì)胞生長用之新鮮培養(yǎng)基均勻混合之。注意：由于 DMSO稀釋時(shí)會放出大量熱能，故不可將 DMSO直 接加入細(xì)胞液中，必須使用前先行配制完成。.如何消除組織培養(yǎng)的污染？答：當(dāng)重要的培養(yǎng)細(xì)胞污染時(shí)，研究者可能試圖消除或控制污染。首先，確定污染物是細(xì)菌、真菌、支原體或酵母，把污染細(xì)胞與其它細(xì)胞系隔離開，用實(shí)當(dāng)室消毒劑消毒培養(yǎng)器皿和超凈臺，檢查HEPA過濾器。高濃度的抗生素和抗霉菌素可能對一些細(xì)胞系有毒性，因而，做劑量反應(yīng)實(shí)驗(yàn)確定抗生素和抗霉菌素產(chǎn)生毒性的劑量水平。這點(diǎn)在

29、使用抗生素如兩性霉素B和抗霉菌素如泰樂菌素時(shí)尤其重要。下面是推薦的確定毒性水平和消除培養(yǎng)污染的實(shí)驗(yàn)步驟。1）在無抗生素的培養(yǎng)基中消化、計(jì)數(shù)和稀釋細(xì)胞，稀釋到常規(guī)細(xì)胞傳代的濃度。2）分散細(xì)胞懸液到多孔培養(yǎng)板中，或幾個(gè)小培養(yǎng)瓶中。在一個(gè)濃度梯度范圍內(nèi)，把選擇抗生素加入到每一個(gè)孔中。例如，兩性霉素 B推薦下列濃度，0.25, 0.50, 1.0, 2.0, 4.0,8.0 mg/ml 。3）每天觀測細(xì)胞毒性指標(biāo)，如脫落，出現(xiàn)空泡，匯合度下降和變圓。4）確定抗生素毒性水平后，使用低于毒性濃度2-3倍濃度的抗生素的培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞2-3代。5）在無抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞一代。6）重復(fù)步驟4。7）在無抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng) 4-6代，確定污染是否以已被消除。.培養(yǎng)細(xì)胞出現(xiàn)死亡其可能的原因有什么？解決辦法有哪些？答：可能的原因有培養(yǎng)箱內(nèi)無CO2;培養(yǎng)箱內(nèi)溫度波動(dòng)太大；細(xì)胞凍存或復(fù)蘇過程中損傷；培養(yǎng)液滲透壓不正確；培養(yǎng)液種有毒代謝產(chǎn)物堆積等。解決辦法可以檢測培養(yǎng)箱內(nèi) CO2濃度，檢查培養(yǎng)箱內(nèi)溫度；取新的