腫瘤的基因診斷

1、腫瘤的基因診斷溫州醫(yī)學(xué)院檢驗醫(yī)學(xué)院溫州醫(yī)學(xué)院附一醫(yī)檢驗科陶 志 華 腫瘤是細(xì)胞的異常增生 有結(jié)構(gòu)、功能和代謝的異常 具有超過正常細(xì)胞增生能力腫瘤概念 在細(xì)胞內(nèi)核酸代謝的異常: 腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞的核酸代謝有顯著的不同； 不同類型腫瘤細(xì)胞的核酸代謝也有較大的差異； 相同惡性程度腫瘤細(xì)胞的核酸代謝也有所不同。 腫瘤是一種分子病 癌基因的激活 抑癌基因的失活（或缺失） 腫瘤發(fā)生機理原癌基因癌基因病毒癌基因 腫瘤抑制基因 腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因 腫瘤耐藥基因等腫瘤相關(guān)基因細(xì)胞基因組中具有能夠使正常細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化的基因 癌基因在正常細(xì)胞的基因組中 存在 不表達(dá)狀態(tài) 表達(dá)水平不足以引起細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化癌基因：定

2、位功能癌基因，產(chǎn)物分泌蛋白生長因子sis PDGF鏈跨膜蛋白受體型酪氨酸激酶erb B ,EGF受體 erb B2 ,EGF樣受體(neu)fms ,CSF-1受體 膜結(jié)合蛋白G-蛋白 非受體型酪氨酸激酶 ras p21ras src pp60src 胞漿可溶性蛋白非受體型酪氨酸激酶 絲氨酸/蘇氨酸激酶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)連接蛋白 ab1 rafcrk,SH2/SH3調(diào)節(jié)蛋白vav ,SH2調(diào)節(jié)蛋白 胞核蛋白轉(zhuǎn)錄因子myc mybfosjunerb A,T3受體 表1細(xì)胞癌基因按其產(chǎn)物定位和功能分類能夠抑制細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化或抑制細(xì)胞異常 增殖的基因 目前研究較多的有p53基因、pRB基因、p16蛋白、p15蛋

3、白、p21等。 抑癌基因基因染色體定位相關(guān)腫瘤基因產(chǎn)物及功能RB13q14RB、成骨肉瘤、胃癌、SCLC、乳癌、結(jié)腸癌p105，控制生長WT11p13WT、橫紋肌肉瘤、肺癌、膀胱癌、乳癌、肝母細(xì)胞瘤WT-ZFP，負(fù)調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子NF-117p12神經(jīng)纖維瘤、嗜鉻細(xì)胞瘤、雪旺氏細(xì)胞瘤、神經(jīng)纖維肉瘤GAP，拮抗p21rasBDCC18q21.3結(jié)腸瘤P192, 細(xì)胞粘附分子p5317p13星狀細(xì)胞瘤、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、結(jié)腸癌、乳癌、成骨肉瘤、SCLC、胃癌、磷狀細(xì)胞肺癌P53 控制腫瘤生長erb A17q21ANLLT3受體，含鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子表2 已確定的幾種抑癌基因 野生型P53生物學(xué)活性當(dāng)DNA

4、損傷的時候,P53基因就明顯表達(dá)使細(xì)胞在G1期生長阻滯，促使細(xì)胞凋亡。抑制腫瘤細(xì)胞生長保持DNA完整性包括腫瘤轉(zhuǎn)移促進(jìn)基因或腫瘤轉(zhuǎn)移抑制 基因。腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因其表達(dá)使腫瘤細(xì)胞對藥物產(chǎn)生耐藥的基因。 腫瘤耐藥基因 血小板衍生生長因子（PDGF） 表皮生長因子（EGF） VGF基因等 腫瘤生長因子 腫瘤的基因診斷腫瘤的基因診斷目前主要集中在以下幾個方面：腫瘤轉(zhuǎn)移標(biāo)志物腫瘤抗藥基因突變的癌基因腫瘤相關(guān)的病毒基因標(biāo)志分類機制分子標(biāo)志應(yīng)用于癌癥診斷分子遺傳性染色體易位t(9；22)，t（14；18），t(11；12)等白血病、淋巴瘤等點突變p53,ER ras等胃癌、膀胱癌、乳腺癌、前列腺癌、結(jié)腸癌、

5、胰腺癌、肺癌等缺失BRCA1，BRCA2，DCC等乳腺癌、結(jié)腸癌改變拼接CD44，muc-1,VLA-4等結(jié)腸癌、腎癌、乳腺癌、腦瘤等擴增erb-B2,EGFR,N-myc,ras乳腺癌、腦瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤比例改變明膠酶A/TIMP2乳腺癌轉(zhuǎn)移等病毒性病毒轉(zhuǎn)化HPV,HCV,HBV，EBV宮頸癌、肝癌、鼻咽癌等組織性組織分化PSA,PSMA前列腺癌muc-18,酪氨酸酸酶，Mage-3黑素瘤AFP,白蛋白肝癌甲狀腺球蛋白甲狀腺癌NPGP9.5，酪氨酸羥化酶表面活性物質(zhì)等神經(jīng)母細(xì)胞瘤腫瘤性腫瘤細(xì)胞特征CEA肺癌、結(jié)腸癌、胃癌、乳腺癌-HCG黑素瘤等CK-19肺鱗癌端粒酶結(jié)腸癌、乳腺癌、頭頸部癌等

6、微衛(wèi)星體等結(jié)腸癌、乳腺癌、頭頸部癌等表3 腫瘤基因診斷的分子標(biāo)志及其應(yīng)用 可分為四大類 組織特異性基因標(biāo)志 腫瘤特異性基因標(biāo)志 血管生成因子 其它與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的分子及基質(zhì)蛋白酶及其抑制劑 腫瘤轉(zhuǎn)移基因標(biāo)志物組織特異性基因標(biāo)志物指腫瘤組織和/或起源正常組織所特有，在淋巴組織和血細(xì)胞中不存在的。如角質(zhì)蛋白家族（CK）mRNA、粘蛋白基因、表皮生長因子受體（EGFR）mRNA等。 .腫瘤特異性基因標(biāo)志物存在于腫瘤及其起源的正常細(xì)胞中，不存在于其他細(xì)胞。如CEA mRNA、AFP mRNA、PSA mRNA等。 血管生成因子如血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（VEGF）等。 腫瘤抗藥基因?qū)τ谀[瘤化療效果及預(yù)后進(jìn)

7、行推測；還可以將腫瘤抗藥基因?qū)斯撬杓?xì)胞，特別是骨髓干細(xì)胞中，提高機體對于抗腫瘤化療藥物的耐受程度，如此可以加大抗腫瘤化療藥物的使用劑量，提高抗腫瘤化療的治療效果。腫瘤抗藥基因多藥抗性基因一l（MDR1），其編碼的蛋白如P-糖蛋白起排流泵作用。 .其它一些與細(xì)胞內(nèi)藥物代謝有關(guān)的基因也可以看作是腫瘤抗藥基因，如谷胱苷肽S一轉(zhuǎn)移酶（GST），可使機體解毒功能增強；癌基因 bcl-2的表達(dá)可抑制腫瘤化療藥物所誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞程序化死亡等。 . 突變的癌基因癌基因的突變是癌基因激活的重要方式和途徑。除了見到較大范圍片段的缺失或插人以及染色體轉(zhuǎn)位之外，大多數(shù)情況下，都是少數(shù)核苷酸或單個堿基的突變。 .癌基

8、因點突變的檢測 單鏈構(gòu)象多態(tài)性（SSCP）檢測技術(shù)等 .腫瘤相關(guān)的病毒基因EB病毒（EBV）人乳頭瘤病毒（HPV）乙型肝炎病毒（HBV）、丙型肝炎病毒（HCV）感染對于這些腫瘤組織細(xì)胞中相關(guān)病毒基因及其編 碼產(chǎn)物的檢測，可以作為這些類型的腫瘤診斷的標(biāo)志。致瘤病毒引起的惡性轉(zhuǎn)化作用引起了人們極大的關(guān)注腫瘤基因診斷的常用方法PCR、RT-PCRSouthern blot雜交技術(shù)、Northern blot雜交技術(shù)基因芯片基因測序。腫瘤基因的分子診斷意義 1.腫瘤的早期診斷和篩選2.腫瘤療效監(jiān)測 3.腫瘤的預(yù)后判斷 4.腫瘤微轉(zhuǎn)移檢測 腫瘤基因檢測在腫瘤微轉(zhuǎn)移檢測中應(yīng)用舉例前列腺癌特異性基因DD3P

9、CA3 DD3PCA3是一種非編碼RNA的基因，定位于9q2122染色體。它為前列腺癌特異性基因之一，DD3PCA3 mRNA僅在前列腺癌細(xì)胞中表達(dá)，而在其它正常組織和癌組織以及細(xì)胞系中均不表達(dá)。 DD3 mRNA 14外顯子擴增結(jié)果M：50bp DNA Ladder；1：LNCaP陽性對照；2 3：PCa；4：PIN；5 6：BPH；7：直腸癌；8：直腸癌癌旁；9：結(jié)腸癌；10：結(jié)腸癌癌旁；11：乳腺癌；12：甲狀腺癌；13：胃癌；14：胃癌癌旁；15：膀胱癌；16：軟組織纖維肉瘤；17：轉(zhuǎn)移性腺癌；18：淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移性黑色素瘤；19：卵巢成熟性畸胎瘤；20：正常肝臟；21：膽囊；22：胎盤；

10、23：試劑空白。DD3 mRNA 13外顯子擴增結(jié)果M：50bp DNA Ladder；1：LNCaP陽性對照；2 3：PCa；4：PIN；5 6：BPH；7：直腸癌；8：直腸癌癌旁；9：結(jié)腸癌；10：結(jié)腸癌癌旁；11：乳腺癌；12：甲狀腺癌；13：胃癌；14：胃癌癌旁；15：膀胱癌；16：軟組織纖維肉瘤；17：轉(zhuǎn)移性腺癌；18：淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移性黑色素瘤；19：卵巢成熟性畸胎瘤；20：正常肝臟；21：膽囊；22：胎盤；23：試劑空白。DD3 mRNA 34外顯子擴增結(jié)果M：50bp DNA Ladder；1：LNCaP陽性對照；2 3：PCa；4：PIN；5 6：BPH；7：直腸癌；8：直腸癌癌旁

11、；9：結(jié)腸癌；10：結(jié)腸癌癌旁；11：乳腺癌；12：甲狀腺癌；13：胃癌；14：胃癌癌旁；15：膀胱癌；16：軟組織纖維肉瘤；17：轉(zhuǎn)移性腺癌；18：淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移性黑色素瘤；19：卵巢成熟性畸胎瘤；20：正常肝臟；21：膽囊；22：胎盤；23：試劑空白。前列腺組織和其他腫瘤組織及癌旁組織DD3 mRNA檢測結(jié)果 M：50bp DNA標(biāo)準(zhǔn)；1：LNCaP陽性對照；2：BPH；3：健康男性志愿者；410為PCa；11為試劑空白。 外周血DD3 mRNA的RT-PCR擴增電泳圖 RT-PCR檢測結(jié)果 44例PCa組中13例可見DD3 mRNA陽性結(jié)果(其中B期、C期及D期分別有為0例、2例，11例)。

12、30例BPH患者和18名健康男性志愿者標(biāo)本中均未檢出DD3 mRNA。 外周血DD3 mRNA的巢式RT-PCR擴增電泳圖 M：50bp DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1：LNCaP陽性對照；2：陰性對照(女性)；3：BPH患者；4：健康男性志愿者；58：未治療的PCa；9：試劑空白 巢式RT-PCR檢測結(jié)果44例PCa組中21例可見DD3 mRNA陽性結(jié)果(其中B期、C期、D期分別有1例、5例、15例)30例BPH患者和18名健康男性志愿者均未見陽性結(jié)果 兩種方法對PCa患者外周血DD3 mRNA檢出率比較RT-PCR巢式RT-PCR+-+130-823注：2=20.2，P0.001；Kappa0.62

13、9，P0.001 外周血DD3 mRNA巢式RT-PCR方法的靈敏度 M:50bp DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；16:依次為105、104、103、102、101、1個LNCaP細(xì)胞/ml全血； 7:陰性對照；8:試劑空白 組別 DD3 mRNA檢出率(%，例數(shù)) PCa（未治療） 100%（11/11） BPH 0%（0/30） 健康男性志愿者（對照） 0%（0/18） 注：經(jīng)卡方檢驗，259.0 P0.01不同前列腺疾病患者其外周血DD3 mRNA檢出率比較 巢式RT-PCRPCa不同臨床分期未治療組和治療組DD3 mRNA陽性率比較(%,例數(shù)) 臨床分期 DD3 mRNA未治療組 內(nèi)分泌治療組 B

14、期 100.0(1/1) 0.0（0/2） C期 100.0(3/3) 25.0（2/8）* D期 100.0(7/7) 34.8(8/23) * 合計 100.0(11/11) 30.3(10/33) *注：內(nèi)分泌治療組與未治療組比較， * P0.05，*P0.01巢式RT-PCR謝 謝 !樹立質(zhì)量法制觀念、提高全員質(zhì)量意識。8月-228月-22Saturday, August 20, 2022人生得意須盡歡，莫使金樽空對月。05:51:1605:51:1605:518/20/2022 5:51:16 AM安全象只弓，不拉它就松，要想保安全，常把弓弦繃。8月-2205:51:1605:51A

15、ug-2220-Aug-22加強交通建設(shè)管理，確保工程建設(shè)質(zhì)量。05:51:1605:51:1605:51Saturday, August 20, 2022安全在于心細(xì)，事故出在麻痹。8月-228月-2205:51:1605:51:16August 20, 2022踏實肯干，努力奮斗。2022年8月20日5:51 上午8月-228月-22追求至善憑技術(shù)開拓市場，憑管理增創(chuàng)效益，憑服務(wù)樹立形象。20 八月 20225:51:16 上午05:51:168月-22嚴(yán)格把控質(zhì)量關(guān)，讓生產(chǎn)更加有保障。八月 225:51 上午8月-2205:51August 20, 2022作業(yè)標(biāo)準(zhǔn)記得牢，駕輕就熟除煩惱

16、。2022/8/20 5:51:1605:51:1620 August 2022好的事情馬上就會到來，一切都是最好的安排。5:51:16 上午5:51 上午05:51:168月-22專注今天，好好努力，剩下的交給時間。8月-228月-2205:5105:51:1605:51:16Aug-22牢記安全之責(zé)，善謀安全之策，力務(wù)安全之實。2022/8/20 5:51:16Saturday, August 20, 2022相信相信得力量。8月-222022/8/20 5:51:168月-22謝謝大家！樹立質(zhì)量法制觀念、提高全員質(zhì)量意識。8月-228月-22Saturday, August 20, 20

17、22人生得意須盡歡，莫使金樽空對月。05:51:1605:51:1605:518/20/2022 5:51:16 AM安全象只弓，不拉它就松，要想保安全，常把弓弦繃。8月-2205:51:1605:51Aug-2220-Aug-22加強交通建設(shè)管理，確保工程建設(shè)質(zhì)量。05:51:1605:51:1605:51Saturday, August 20, 2022安全在于心細(xì)，事故出在麻痹。8月-228月-2205:51:1605:51:16August 20, 2022踏實肯干，努力奮斗。2022年8月20日5:51 上午8月-228月-22追求至善憑技術(shù)開拓市場，憑管理增創(chuàng)效益，憑服務(wù)樹立形象。

18、20 八月 20225:51:16 上午05:51:168月-22嚴(yán)格把控質(zhì)量關(guān)，讓生產(chǎn)更加有保障。八月 225:51 上午8月-2205:51August 20, 2022作業(yè)標(biāo)準(zhǔn)記得牢，駕輕就熟除煩惱。2022/8/20 5:51:1605:51:1620 August 2022好的事情馬上就會到來，一切都是最好的安排。5:51:16 上午5:51 上午05:51:168月-22專注今天，好好努力，剩下的交給時間。8月-228月-2205:5105:51:1605:51:16Aug-22牢記安全之責(zé)，善謀安全之策，力務(wù)安全之實。2022/8/20 5:51:16Saturday, August 20, 2022相信相信得力量。8月-222022/8/20 5:51:168月-22謝謝大家！生活中的辛苦阻撓不了我對生活的熱愛。8月-228月-22Saturday, August 20, 2022人生得意須盡歡，莫使金樽空對月。05:51:1605:51: