乳酸脫氫酶酶活力測定

1、實驗六乳酸脫氫酶酶活力測定及紫外吸收法測定蛋白質(zhì)含量目的要求掌握LDH活性測定原理；學習用比色法測定酶活性的方法。實驗原理乳酸脫氫酶(lactatedehydrogenase簡稱LDH，EC.1.1.1.27,L乳酸：NAD+氧化還原酶)廣泛存在于生物細胞內(nèi)，是糖代謝酵解途徑的關(guān)鍵酶之一，可催化下列可逆反應。LDH可溶于水或稀鹽溶液。組織中LDH含量測定方法很多，其中紫外分光光度法更為COOIIDHCOOIIrH3.a-9.fiIIIO-Cir1-NAD+-7CO1-NADL1+1IT|CH-乳臉賣世卑刖晦【方餌醜還慮黎輔醋I簡單、快速。鑒于NADH,NAD+在340nm及260nm處有各自的

2、最大吸收峰，因此以NAD+為輔酶的各種脫氫酶類都可通過340nm光吸收值得改變，定量測定酶的含量。本實驗測定LDH活力，基質(zhì)液中含丙酮酸及NADH，在一定條件下，加入一定量酶液，觀察NADH在反應過程中340nm處光吸收減少值，減少越多，則LDH活力越高。其活力單位定義是：在25C,pH7.5條件下A340nm/min下降為1.0的酶量為1個單位?？啥繙y定每克濕重組織中LDH單位。定量測定蛋白質(zhì)含量即可計算比活力(U/mg)。利用上述原理，改變不同第五則可測定相應脫氫酶反應過程中A340nm的改變，定量測定酶活力，如蘋果酸脫氫酶、醇脫氫酶、醛脫氫酶、甘油一33磷酸脫氫酶等，適用范圍很廣。試劑

3、和器材一、試劑50mmol/LpH6.5磷酸氫二鉀一磷酸二氫鉀緩沖液母液：A:50mmol/LK2HPO4：稱K2HPO41.74g加蒸餾水溶解后定容至200ml。B:50mmol/LKH2PO4:稱KH2PO43.40g加蒸餾水溶解后定容至500ml。取溶液A31.5ml+溶液B68.5ml,調(diào)節(jié)pH至6.5。置4C冰箱備用。10mmol/LpH6.5磷酸氫二鉀一磷酸二氫鉀緩沖液用上述母液稀釋得到。現(xiàn)用現(xiàn)配。0.1mol/LpH7.5磷酸鹽緩沖液，用上述母液稀釋得到?，F(xiàn)用現(xiàn)配。NADH溶液：稱3.5mg純NADH置試管中，加0.1mol/LpH7.5磷酸緩沖液1ml搖勻?，F(xiàn)用現(xiàn)配。丙酮酸溶液

4、：稱2.5mg丙酮酸鈉，加O.lmol/LpH7.5磷酸緩沖液29ml,使其完全溶解?，F(xiàn)用現(xiàn)配試劑。二、材料動物肌肉、肝、心、腎等組織。三、器材組織搗碎機，紫外分光光度計，恒溫水浴，移液管（5ml,0.1ml）,微量注射器（10ul）。操作方法一、制備肌肉勻漿稱取20g兔肉，按W/V=1/4比例加入4C預冷的10mmol/LPh6.5磷酸氫二鉀一磷酸二氫鉀緩沖液，用組織搗碎機搗碎，每次10s，連續(xù)3次。將勻漿液倒入燒杯中，置4C冰箱中提取過夜，過濾后得到組織提取液。二、LDH活力測定試驗時預先將丙酮酸溶液及NADH溶液放在25C水浴中預熱。取2只石英比色杯，在1只比色杯中加入0.1mmol/L

5、pH7.5磷酸氫二鉀一磷酸二氫鉀緩沖液3ml，置于紫外分光光度計中，在340nm處將光吸收調(diào)節(jié)至零；另一只比色杯用于測定LDH活力，依次加入丙酮酸鈉溶液2.9ml,NADH溶液0.1ml,加蓋搖勻后，測定340nm光吸收值（A）。取出比色杯加入經(jīng)稀釋的酶液10ul,立即計時，搖勻后，每隔0.5min測A340nm，連續(xù)測定3min,以A對時間作圖，取反應最初線性部分，計算A340nm/min減少值。加入酶液的稀釋度（或加入量）應控制A340nm/min下降值在。丄一之間。三、數(shù)據(jù)處理計算每毫升組織提取液中LDH活力單位LDH活力單位（U）/ml提取液=（A340nm/min稀釋倍數(shù)）/（酶液加

6、入量（10Ul）10-1提取液中LDH總活力單位=LDH活力（U）/ml總體積注意事項（1）實驗材料應盡量新鮮，如取材后不立即用，則應貯存在一20C冰箱。（2）酶液的稀釋度及加入量應控制A340nm/min下降值在0.10.2之間，以減少實驗誤差。（3）NADH溶液應在臨用前配制。思考題：簡述用紫外分光光度法測定以NAD+為輔酶的各種脫氫酶測定原理。實驗之二：紫外吸收法測定蛋白質(zhì)含量實驗原理蛋白質(zhì)分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵，使蛋白質(zhì)具有吸收紫外光的性質(zhì)。吸收高峰在280nm處，其吸光度（即光密度值）與蛋白質(zhì)含量成正比。此外，蛋白質(zhì)溶液在238nm的光吸收值與肽鍵含量

7、成正比。利用一定波長下，蛋白質(zhì)溶液的光吸收值與蛋白質(zhì)濃度的正比關(guān)系，可以進行蛋白質(zhì)含量的測定。紫外吸收法簡便、靈敏、快速，不消耗樣品，測定后仍能回收使用。低濃度的鹽，例如生化制備中常用的（nh4）2SO4等和大多數(shù)緩沖液不干擾測定。特別適用于柱層析洗脫液的快速連續(xù)檢測，因為此時只需測定蛋白質(zhì)濃度的變化，而不需知道其絕對值。此法的特點是測定蛋白質(zhì)含量的準確度較差，干擾物質(zhì)多，在用標準曲線法測定蛋白質(zhì)含量時，對那些與標準蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸含量差異大的蛋白質(zhì)，有一定的誤差。故該法適于用測定與標準蛋白質(zhì)氨基酸組成相似的蛋白質(zhì)。若樣品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物質(zhì)，會出現(xiàn)較大的干擾。核酸的

8、干擾可以通過查校正表，再進行計算的方法，加以適當?shù)男Ｕ５且驗椴煌牡鞍踪|(zhì)和核酸的紫外吸收是不相同的，雖然經(jīng)過校正，測定的結(jié)果還是存在一定的誤差。此外，進行紫外吸收法測定時，由于蛋白質(zhì)吸收高峰常因pH的改變而有變化，因此要注意溶液的pH值，測定樣品時的pH要與測定標準曲線的pH相一致。一、試劑：標準蛋白質(zhì)溶液：任選一種。（1）牛血清清蛋白溶液：準確稱取經(jīng)凱氏定氮法校正的結(jié)晶牛血清清蛋白，配制成濃度為1毫克/毫升（mg/mL）的溶液。（2）卵清蛋白質(zhì)溶液：將約1克卵清溶于100毫升0.9%氯化鈉溶液中，離心，取上清液，按微量凱氏定氮法測其蛋白質(zhì)含量，用0.9%氯化鈉溶液稀釋至蛋白濃度為1毫克/

9、毫升。待測蛋白質(zhì)溶液：濃度為1毫克/毫升左右的溶液。二、器材：1紫外分光光度計2吸量管3試管和試管架操作方法下面介紹四種紫外吸收法：1.280nm的光吸收法因蛋白質(zhì)分子中的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸在280nm處具有最大吸收，且各種蛋白質(zhì)的這三種氨基酸的含量差別不大，因此測定蛋白質(zhì)溶液在280nm處的吸光度值是最常用的紫外吸收法。測定時，將待測蛋白質(zhì)溶液倒入石英比色皿中，用配制蛋白質(zhì)溶液的溶劑（水或緩沖液）作空白對照，在紫外分光度計上直接讀取280nm的吸光度值A(chǔ)28Qo蛋白質(zhì)濃度可控制在0.11.0mg/ml左右。通常用1cm光徑的標準石英比色皿，盛有濃度為1mg/ml的蛋白質(zhì)溶液時，a280

10、約為1.0左右。由此可立即計算出蛋白質(zhì)的大致濃度。許多蛋白質(zhì)在一定濃度和一定波長下的光吸收值（A1%1cm）有文獻數(shù)據(jù)可查，根據(jù)此光吸收值可以較準確地計算蛋白質(zhì)濃度。下式列出了蛋白質(zhì)濃度與（A1%1cm）值（即蛋白質(zhì)溶液濃度為1%，光徑為lcm時的光吸收值）的關(guān)系。文獻值A(chǔ)i%icmx稱為百分吸收系數(shù)或比吸收系數(shù)。蛋白質(zhì)濃度=（A28010）/A1%icm,280nm（mg/ml）（1%濃度alOmg/ml）例：牛血清清蛋白：A11cm=6.3（280nm）溶菌酶：A11cm=22.8（28Onm）若查不到待測蛋白質(zhì)的A1%1cm值，則可選用一種與待測蛋白質(zhì)的酪氨酸和色氨酸含量相近的蛋白質(zhì)作為

11、標準蛋白質(zhì)，用標準曲線法進行測定。標準蛋白質(zhì)溶液配制的濃度為1.0mg/m1。常用的標準蛋白質(zhì)為牛血清清蛋白（BSA）。標準曲線的測定：取6支試管，按下表編號并加入試劑：管號123456BSA(1.0mg/m1)01.02.03.04.05.0H2O5.04.03.02.01.00A280用第1管為空白對照，各管溶液混勻后在紫外分光光度計上測定吸光度a28O,以a28O為縱座標，各管的蛋白質(zhì)濃度或蛋白質(zhì)量（mg）為橫座標作圖，標準曲線應為直線，利用此標準曲線，根據(jù)測出的未知樣品的A280值，即可查出未知樣品的蛋白質(zhì)含量，也可以用2至6管A280值與相應的試管中的蛋白質(zhì)濃度計算出該蛋白質(zhì)的A1%

12、1cm280nm2.28Onm和26Onm的吸收差法核酸對紫外光有很強的吸收，在280nm處的吸收比蛋白質(zhì)強10倍（每克），但核酸在260nm處的吸收更強，其吸收高峰在260nm附近。核酸260nm處的消光系數(shù)是280nm處的2倍，而蛋白質(zhì)則相反，280nm紫外吸收值大于260nm的吸收值。通常：純蛋白質(zhì)的光吸收比值：A280/A260a1.8純核酸的光吸收比值：A280/A260a0.5含有核酸的蛋白質(zhì)溶液，可分別測定其a280和a260,由此吸收差值，用下面的經(jīng)驗公式，即可算出蛋白質(zhì)的濃度。蛋白質(zhì)濃度=1.45XA280O.74XA260(mg/ml)此經(jīng)驗公式是通過一系列已知不同濃度比例

13、的蛋白質(zhì)（酵母烯醇化酶）和核酸（酵母核酸）的混合液所測定的數(shù)據(jù)來建立的。215nm與225nm的吸收差法蛋白質(zhì)的稀溶液由于含量低而不能使用280nm的光吸收測定時，可用215nm與225nm吸收值之差，通過標準曲線法來測定蛋白質(zhì)稀溶液的濃度。用已知濃度的標準蛋白質(zhì)，配制成20100g/ml的一系列5.0ml的蛋白質(zhì)溶液，分別測定215nm和225nm的吸光度值，并計算出吸收差：吸收差A=A215-A225以吸收差為縱座標，蛋白質(zhì)濃度為橫座標，繪出標準曲線。再測出未知樣品的吸收差,即可由標準曲線上查出未知樣品的蛋白質(zhì)濃度。本方法在蛋白質(zhì)濃度20100g/ml范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)濃度與吸光度成正比，Na

14、Cl、（NH4）2SO4以及0.1M磷酸、硼酸和Tris等緩沖液，都無顯著干擾作用，但是0.1NNaOH,0.1M乙酸、琥珀酸、鄰苯二甲酸、巴比妥等緩沖液的215nm光吸收值較大，必須將其濃度降到0.005M以下才無顯著影響。肽鍵測定法蛋白質(zhì)溶液在238nm處的光吸收的強弱，與肽鍵的多少成正比。因此可以用標準蛋白質(zhì)溶液配制一系列50500g/ml已知濃度的5.0ml蛋白質(zhì)溶液，測定238nm的光吸收值A(chǔ)238,以a238為縱座標，蛋白質(zhì)含量為橫座標，繪制出標準曲線。未知樣品的濃度即可由標準曲線求得。進行蛋白質(zhì)溶液的柱層析分離時，洗脫液也可以用238nm檢測蛋白質(zhì)的峰位。本方法比280nm吸收法靈敏。但多種有機物，如醇、酮、醛、醚、有機酸、酰胺類和過氧化物等都有干擾作用。所以最好用無機鹽，無機堿和水溶液進行測定。若含有有機溶劑，可先將樣品蒸干，或用其他方法除去干擾物質(zhì)，然后用水、稀酸和稀堿溶解后再作測定。思考題1、本法與