生物技術(shù)基因工程篇

1、關(guān)于生物技術(shù)基因工程篇第一張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月基因工程(genetic engineering)基因工程又稱DNA重組技術(shù)，即在體外把兩種或者兩種以上不同來源的DNA分子重新組合成新的DNA分子，通過載體轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞內(nèi)，將所需要的經(jīng)過修飾的基因在受體細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，產(chǎn)生人類所需要的基因或產(chǎn)物，或轉(zhuǎn)基因生物。第二張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月基因工程的基本步驟分離/制備目的基因選擇載體使目標(biāo)基因與載體DNA連接形成重組體以重組體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞（細(xì)菌或其他細(xì)胞）篩選出能夠表達(dá)重組DNA的宿主細(xì)胞，使這些細(xì)胞擴(kuò)增、繁殖 獲得大量拷貝的目的基因 使目的基因在宿主細(xì)胞表達(dá)出編

2、碼的多肽第三張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月基因工程（原核表達(dá)系統(tǒng)）操作的基本步驟第四張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月一、目標(biāo)基因的制備1、限制性內(nèi)切酶法（鳥槍法或散彈法）2、酶促合成法/反向轉(zhuǎn)錄法3、人工合成法4、通過PCR把目的基因擴(kuò)增出來第五張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月1、限制性內(nèi)切酶法（鳥槍法或散彈法）第六張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月優(yōu)點(diǎn)：原理簡單，操作簡便，具有一定的應(yīng)用范圍 基因組文庫（genomic library）的制備：用限制性內(nèi)切酶將基因組 DNA切成片段，每一段與一個載體連接成重組DNA，并引入宿主細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增，得到分子克隆

3、的混合體，稱基因文庫。缺點(diǎn)：所獲得的DNA含有內(nèi)含子，不能在原核細(xì)胞中表達(dá)。第七張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月2、酶促合成法/反向轉(zhuǎn)錄法 mRNA逆轉(zhuǎn)錄 cDNA第八張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月3、人工合成法蛋白質(zhì)的氨基酸序列 用于結(jié)構(gòu)清楚、分子量較小的基因核苷酸序列化學(xué)合成目的基因按密碼子推算第九張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月 利用化學(xué)合成法已成功合成人生長激素釋放因子、胸腺素、血管升壓素、胰島素、干擾素等基因，并進(jìn)一步生產(chǎn)出相應(yīng)的藥物。第十張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月4、通過PCR把目的基因擴(kuò)增出來第十一張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于202

4、2年6月第十二張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月二、載體的選擇 載體（vector）：運(yùn)載外源性DNA有效地進(jìn)入到受體細(xì)胞內(nèi)的工具。 載體應(yīng)具備的條件分子相對較?。?10kb）,能進(jìn)行復(fù)制，且具有高拷貝數(shù);具有幾個單一的酶切位點(diǎn)，酶切位點(diǎn)應(yīng)在復(fù)制子以外適當(dāng)?shù)奈恢?能接納盡可能大的外源性DNA。外源性DNA插入后，載體在受體細(xì)胞中的復(fù)制不受影響。第十三張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月 必須有便于篩選的明顯標(biāo)志，如耐藥性和空斑形成等,以便于陽性克隆細(xì)胞容易被選出；有促進(jìn)外源性DNA表達(dá)的調(diào)控區(qū)；對受體細(xì)胞無害。 天然載體有很多缺點(diǎn)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)達(dá)不到理想載體的要求，通常使用的載體都是經(jīng)過

5、改造過的載體。第十四張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月質(zhì)粒（plasmid）噬菌體（phage） 病毒(vector ) 載體的種類按來源分 克隆載體(cloning vector ) 按作用分表達(dá)載體(expression vector)第十五張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月1、質(zhì)粒載體質(zhì)粒的存在與否一般對細(xì)菌的生存沒有決定性的影響。帶有選擇性遺傳標(biāo)志，如基因的產(chǎn)物可能是降解某些抗生素的酶。在添加真核復(fù)制信號和啟動子后，可以構(gòu)建出能在原核細(xì)胞或真核細(xì)胞均可復(fù)制的穿梭質(zhì)粒（shuttle plasmid）。在基因工程中應(yīng)用廣泛 。 實際應(yīng)用的都是人工構(gòu)建的質(zhì)粒，其中最常用的是

6、pBR322 ,pUC19等。第十六張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月質(zhì)粒在宿主細(xì)胞中的復(fù)制有兩種類型 嚴(yán)密型質(zhì)粒：復(fù)制需要蛋白質(zhì)合成和DNA聚合酶 的存在，它的復(fù)制與宿主細(xì)胞的增殖密切相關(guān)，每個宿主細(xì)胞內(nèi)只有15個嚴(yán)密型質(zhì)粒。 松弛型質(zhì)粒：復(fù)制需要DNA聚合酶，可以在沒有蛋白質(zhì)合成的情況下繼續(xù)復(fù)制，每個宿主細(xì)胞內(nèi)可存有10200個以上的松弛型質(zhì)粒，在細(xì)胞蛋白質(zhì)合成及染色質(zhì)復(fù)制停止的情況下，可繼續(xù)大量擴(kuò)增至上千份。 利用此原理可在質(zhì)粒擴(kuò)增時，加入氯霉素抑制宿主菌蛋白質(zhì)合成，達(dá)到進(jìn)一步擴(kuò)增松弛型質(zhì)粒的目的。第十七張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月PBR322抗氨芐青基因抗四環(huán)素基

7、因第十八張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月質(zhì)粒的構(gòu)建第十九張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月質(zhì)粒攜帶外源基因第二十張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月第二十一張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月（1）噬菌體2、噬菌體載體感染細(xì)菌的病毒特點(diǎn)：雙鏈DNA分子（線性或環(huán)形）兩端具有12個nt單鏈互補(bǔ)粘性末端 COS位點(diǎn)具非必需區(qū)（中間區(qū)約1/3長度）可在體外包裝成病毒顆粒，可高效感染宿主細(xì)胞（大腸桿菌）容量大，可以插入2325Kb左右的外源基因。第二十二張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月第二十三張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月根據(jù)生活周期分 溶菌性：在細(xì)

8、菌中連續(xù)增殖直到細(xì)菌裂解，釋放噬菌體 溶源性：將其DNA整合入細(xì)菌基因組DNA中，與宿主DNA一起復(fù)制，然后傳給子代，宿主細(xì)胞不發(fā)生裂解。 *只有雙鏈DNA的噬菌體才具有溶源周期。第二十四張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月噬菌體的溶源周期和溶菌周期第二十五張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月類型： 插入型載體：只有一個限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)可供插入外源性DNA片段。 替代型載體：含有某個限制性內(nèi)切酶的兩個切點(diǎn)，這兩個切點(diǎn)間的片段可以被外源性DNA替代。第二十六張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月第二十七張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月藍(lán)白篩選 載體中含一個LacZ基因

9、-半乳糖苷酶 X-gal(無色) X(藍(lán)色)+gal(半乳糖)其中X為顯色底物：5-溴-4-氫-3-吲哚-D半乳糖苷 在含X-gal和Lac操縱子誘導(dǎo)物IPTG（異丙基硫代半乳糖苷）的培養(yǎng)基中 非重組的噬菌體轉(zhuǎn)化的宿主菌可以合成-半乳糖苷酶，分解X-gal，菌落形成藍(lán)色噬菌斑。 重組的的噬菌體因LacZ基因被外源DNA插入而破壞，故其轉(zhuǎn)化的宿主菌不能產(chǎn)生-半乳糖苷酶，因而菌落形成無色噬菌斑。 編碼第二十八張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月第二十九張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月第三十張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月（2）M13噬菌體（M13 phage）特點(diǎn)：單鏈線

10、性DNA分子大腸桿菌被感染后，并不死亡，只是生長緩慢，而新的噬菌體被釋放到菌體外。感染大腸桿菌后，單鏈線性DNA分子可轉(zhuǎn)變成雙鏈復(fù)制型(RF)。從大腸桿菌中分離出雙鏈復(fù)制型的M13還可作為克隆雙鏈DNA的載體具非必需區(qū)(IS)第三十一張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月從宿主菌體中釋放出來的M13噬菌體粒子只含單鏈DNA,其中包含有被克隆的外源性DNA片段中兩條中的一條，因此可用來制備單鏈DNA探針，也可以用作DNA測序的模板。 篩選：藍(lán)白篩選第三十二張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月 是指含有入噬菌體粘性末端的雜種質(zhì)粒。 由入噬菌體的cos區(qū)與質(zhì)粒重組建造而成。 在宿主細(xì)胞中可

11、以作為正常噬菌體進(jìn)行復(fù)制，但不表達(dá)噬菌體的任何功能。（3）粘尾質(zhì)粒(cosmid)/粘性質(zhì)粒/粘粒/cos質(zhì)粒第三十三張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月cosmid的構(gòu)造特點(diǎn): 含有抗藥標(biāo)志和復(fù)制起始部位； 一個或多個單一酶的限制位點(diǎn)； 帶有入噬菌體粘性末端； 分子小，可容納大的外源DNA片段。第三十四張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月 將染色體端粒序列（TEL）、自主復(fù)制序列（ARS）、著絲粒（CEN）以及必要的選擇標(biāo)記（HISA4和TRP）基因和多克隆位點(diǎn)（MSC）的DNA片段克隆到pBR322中，轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞 YAC。（1）酵母為宿主的載體3、真核細(xì)胞為宿主的克隆載體人工

12、構(gòu)建的酵母質(zhì)粒 酵母人工微小染色體（YAC）第三十五張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月第三十六張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月（2）以植物細(xì)胞為宿主的基因克隆載體Ti質(zhì)粒第三十七張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月（3）DNA病毒載體1）SV40載體（猴腎病毒） 完整的SV40載體 利用SV40元件組建的穿梭質(zhì)粒載體， 如pSVK3質(zhì)粒： 由 噬菌體 三種載體構(gòu)建而成 質(zhì)粒 SV402）乳頭瘤病毒載體 如pBPV載體是在牛乳頭瘤病毒基礎(chǔ)上構(gòu)建的穿梭載體。3）腺病毒載體 如pBPV載體是在牛乳頭瘤病毒基礎(chǔ)上構(gòu)建的穿梭載體。第三十八張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月

13、 克隆載體(cloning vector) 用于在受體細(xì)胞中進(jìn)行目的基因擴(kuò)增的載體。 表達(dá)載體(expression vector) 在受體細(xì)胞中表達(dá)（轉(zhuǎn)錄和翻譯）外源基因的載體。第三十九張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月啟動子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、克隆位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄終止信號大腸桿菌表達(dá)載體除克隆載體的特性外還含有：哺乳動物表達(dá)載體 除含有原核序列（在E-Coli中的復(fù)制起始點(diǎn)、便于篩選的抗性基因）還包括：啟動子/增強(qiáng)子、克隆位點(diǎn)、終止信號和加poly（A）信號。第四十張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月三、目標(biāo)基因與載體DNA連接形成重組體 工具酶限制性核酸內(nèi)切酶(restrictio

14、n endonuclease ) 能識別DNA分子內(nèi)部的特異的對稱序列,水解磷酸酯鍵，切斷分子。 識別序列的特點(diǎn) 專一；常由46個堿基組成； 具有回文序列BamH 1 酶-GGATCC- -CCTAGG-第四十一張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月 限制性內(nèi)切酶都是從原核生物中發(fā)現(xiàn)的。到目前為止已發(fā)現(xiàn)上千種限制性內(nèi)切酶，其中數(shù)十種被經(jīng)常使用。 水解磷酸二酯鍵，產(chǎn)生DNA片段的5端為P，3 端為OH第四十二張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月第四十三張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月限制酶的命名 EcoR 細(xì)菌的屬名從該細(xì)菌中分離出的第幾個酶細(xì)菌種名細(xì)菌株系第四十四張，PPT

15、共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月切口類型：（1）形成粘末端(cohesive end)：第四十五張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月目的基因第四十六張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月第四十七張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月連接酶的作用是：將互補(bǔ)配對的兩個黏性末端連接起來，使之成為一個完整的DNA分子。第四十八張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月（2）形成平末端SmaCCCGGG GGGCCC第四十九張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月DNA連接酶(DNA ligase ) 第五十張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月四、重組DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞轉(zhuǎn)化（tra

16、nsformation） 以質(zhì)粒為載體，將攜帶外源基因進(jìn)入受體細(xì)胞的過程。轉(zhuǎn)染（transfection） 由噬菌體或病毒介導(dǎo)外源DNA進(jìn)入宿主細(xì)胞的過程。第五十一張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月受體細(xì)胞大腸桿菌、枯草桿菌、酵母菌細(xì)胞、哺乳動物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞受體細(xì)胞必須是限制性內(nèi)切酶缺陷型，即R-菌株，使載體或重組DNA不被水解第五十二張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月受體細(xì)胞大腸桿菌、枯草桿菌、酵母菌細(xì)胞、哺乳動物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞細(xì)菌細(xì)胞作為表達(dá)系統(tǒng) 優(yōu)點(diǎn)： 操作簡單、增代時間短、價格低廉； 某些蛋白質(zhì)的表達(dá)水平很高 缺點(diǎn): 表達(dá)多肽分子常不能適當(dāng)?shù)卣郫B, 蛋白質(zhì)常 無生物活

17、性； 異體蛋白質(zhì)，常對細(xì)菌有毒性作用； 缺乏真核細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后修飾的酶，例如使蛋白質(zhì)磷酸化、糖基化第五十三張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月轉(zhuǎn)化的方法（1）化學(xué)轉(zhuǎn)化法 Cacl2致敏轉(zhuǎn)化法宿主：大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞（Competent Cell）：E-coli經(jīng)Cacl2處理（0-5），使細(xì)胞膜通透性增加，從而具有攝取外源DNA的能力。第五十四張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月轉(zhuǎn)化程序： 感受態(tài)細(xì)胞+質(zhì)粒DNA 42、90sec 不含抗生素的培養(yǎng)基熱休克37 涂布選擇性平板 37 得到細(xì)胞的克隆 30-60min （合適抗生素） 10hr （使質(zhì)粒擴(kuò)增）第五十五張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月（2）物理轉(zhuǎn)化法高電壓脈沖點(diǎn)擊轉(zhuǎn)化微量注射法第五十六張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月（1）磷酸鈣共沉淀法（Calcium phosphate co-pecipitation） 外源DNA或重組質(zhì)粒DNA與磷酸鈣混合，形成微小顆粒，沉積在細(xì)胞表面，被宿主細(xì)胞攝取。轉(zhuǎn)染的方法第五十七張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月（2）電穿孔法（electroporation） 外源DNA與宿主細(xì)胞混合于電穿孔杯中，在高頻電流作用下，細(xì)胞膜出現(xiàn)許多小孔，外源DNA進(jìn)入宿主細(xì)胞。第五十八張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月（3）