影響PCR的主要因素

1、影響PCR的主要因素1.模板DNA單鏈、雙鏈DNA均可作為PCR的模板，DNA樣品盡量純凈，不能有核酸酶、蛋白水解酶等的污染。模板用量依具體實驗而定，一般為100ul反應(yīng)液有105-106個目標(biāo)分子。PCR反應(yīng)時模板變性要充分。2. PCR引物PCR引物設(shè)計是否成功是能否獲得高質(zhì)量PCR產(chǎn)物最關(guān)鍵的因素之一。在設(shè)計和應(yīng)用時，需注意以下重要環(huán)節(jié)：（1）PCR引物的長度約為1830個核苷酸，并且成對引物間的GC含量應(yīng)相似。以使它們在相近的溫度下與其互補(bǔ)序列結(jié)合。G+C含量應(yīng)為45%55%之間。堿基分布是隨機(jī)的，應(yīng)避免連續(xù)出現(xiàn)4個以上的單一堿基，尤其是不應(yīng)在其3，端出現(xiàn)3個連續(xù)G或C，否則會使引物在

2、G+C富集序列區(qū)錯誤引發(fā)。引物3，端堿基最好選用A、G、C,盡可能地避免選用T ,尤其應(yīng)避免連續(xù)出現(xiàn)2個以上T。（2）一般來說，PCR產(chǎn)物500bp時，引物長度選擇16-18bp；PCR產(chǎn)物5kb時，引物長度選擇24bp左右為宜。（3）要避免引物分子自身序列互補(bǔ)，否則會形成發(fā)夾樣二級結(jié)構(gòu)。兩個PCR引物相互之間的3，末端序列不能有明顯的互補(bǔ)性，以免形成引物二聚體。（4）引物的熔點(diǎn)溫度（Tm值）要適當(dāng)。Tm值與引物的堿基組成和長度有關(guān)；PCR引物的GC/AT應(yīng)與要擴(kuò)增的模板DNA相當(dāng)或略高些。一般熔點(diǎn)溫度以大于55為宜。（5）引物的3，末端必須與模板嚴(yán)格互補(bǔ)，而5，末端的要求可靈活些。（6）目前

3、在引物選擇中已廣泛應(yīng)用計算機(jī)軟件，從EMBL或Genebank中查找有關(guān)基因序列，并對設(shè)計的引物在引物二聚體形成、自身互補(bǔ)性及特異性等方面進(jìn)行分析評價。（7）用于亞克隆的引物，常在引物的5，端加上限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。為了保證內(nèi)切酶有效酶切擴(kuò)增產(chǎn)物，一般在酶切位點(diǎn)的5，端再加上幾個額外的堿基。（8）引物的濃度，在終濃度為0.21.0 umol/L的范圍內(nèi)產(chǎn)量基本相同，低于0.2 umol/L時會影響產(chǎn)量。但過高時一乃不經(jīng)濟(jì)，二則會出現(xiàn)非特異擴(kuò)增及增加引物二聚體的產(chǎn)生。3. 熱穩(wěn)定DNA聚合酶（如Taq DNA聚合酶）一般用量為2.5 U/100uL 反應(yīng)體積。酶量過多易導(dǎo)致非特異性產(chǎn)物的產(chǎn)生。該類

4、酶的最適溫度為75，在低溫下仍保留相當(dāng)高的活性，易引起不完全配對的引物-模板的非特異延伸及引物二聚體的擴(kuò)增延伸，所以應(yīng)注意防止非特異性產(chǎn)物的出現(xiàn)。4. dNTPsPCR常用的dNTP濃度在50-200umol/L。四種dNTPs應(yīng)等當(dāng)量。濃度低則反應(yīng)速度下降，過高則特異性下降，可根據(jù)具體實驗來確定最適的dNTP濃度。5. PCR緩沖液因PCR反應(yīng)中的dNTP能與Mg2+結(jié)合，影響反應(yīng)液中游離Mg2+的濃度，所以應(yīng)按不同條件，確定合適的Mg2+濃度。一般在標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)中（dNTP濃度200umol/L），Mg2+濃度約為1.5mmol/L。Mg2+離子濃度可顯著影響PCR的產(chǎn)量及產(chǎn)物特異性。

5、濃度高則出現(xiàn)非特異擴(kuò)增，過低則酶活性顯著下降。應(yīng)用無核酸酶的BSA、Tween-20(0.05%0.1%)及5mmol的二硫蘇糖醇（DTT）對酶有一定的保護(hù)作用。6. PCR循環(huán)的溫度預(yù)變性：起始變性的時間應(yīng)該長些，以使變性充分。一般為94 3-5min。變性不完全時，DNA雙鏈會很快復(fù)性，影響PCR反應(yīng)，但若變性溫度太高（不宜超過95），會影響Taq酶的活性。變性：一般為94 30s或95 20s。引物退火：應(yīng)根據(jù)具體反應(yīng)中引物與模板的堿基配對情況及實驗的目的確定。一般為50-72。退火溫度增高會增強(qiáng)對不正確退火引物的識別，還能降低引物3，端不正確核苷酸的錯誤延伸。延伸：一般為72 60-90s。最后一個循環(huán)后應(yīng)在72保留5min，以保證PCR產(chǎn)物合成的完整性。7 平臺效應(yīng)和PCR循環(huán)的次數(shù)在PCR基因擴(kuò)增的后期，由于產(chǎn)物的堆積，將使原來產(chǎn)物以指數(shù)增加的速度變?yōu)槠教骨€，即所謂平臺效應(yīng)。它的出現(xiàn)是由于PCR原料的不斷消耗、酶的穩(wěn)定性的降低、終產(chǎn)物的阻滯效應(yīng)及非特異性產(chǎn)物等