土壤凈氮礦化率測定 - 土壤凈氮礦化率的測定-厭氧培養(yǎng)法

1、土壤凈氮礦化率的測定厭氧培養(yǎng)法(Anaerobic method)胡良軍東北師范大學(xué)生物基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心目 錄一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩?、?shí)驗(yàn)內(nèi)容三、實(shí)驗(yàn)原理四、實(shí)驗(yàn)儀器、試劑與配制五、實(shí)驗(yàn)方法與步驟六、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與計(jì)算七、討論八、思考題九、附錄一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?掌握厭氧培養(yǎng)法測定土壤凈氮礦化率的基本原理與操作方法2掌握凱氏定氮的原理和蒸餾定氮器或氨氣敏電極的使用方法返回二、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1土樣的野外采集與處理2土樣水淹狀態(tài)下厭氧礦化培養(yǎng)3凱氏定氮法測定土樣礦化率返回三、實(shí)驗(yàn)原理1、背景知識(shí)土壤中的氮素 氮素是蛋白質(zhì)和核酸的重要組成部分，同時(shí)又是葉綠素、酶、維生素、生物堿等的必要成分，在植物細(xì)胞的生長，分化和各種代謝

2、過程中，氮素都起著重要的作用。土壤中的氮絕大部分（約90%以上）以復(fù)合態(tài)存在于有機(jī)質(zhì)或腐殖質(zhì)中，而大多數(shù)的植物所吸收利用的氮素主要是無機(jī)態(tài)的銨態(tài)氮和硝態(tài)氮。土壤中的有機(jī)質(zhì)和腐殖質(zhì)等有機(jī)態(tài)氮通過氮素礦化作用（主要是土壤微生物作用）釋放出無機(jī)態(tài)氮（主要是銨態(tài)氮與硝態(tài)氮），為植物吸收利用。返回三、實(shí)驗(yàn)原理 返回氮素礦化作用與土壤凈氮礦化率 氮素礦化作用是土壤中有機(jī)態(tài)氮經(jīng)土壤微生物的分解，轉(zhuǎn)化為無機(jī)態(tài)氮的過程，它在生態(tài)系統(tǒng)中是土壤對植物生長供給氮素的關(guān)鍵過程。 土壤凈氮礦化率則是描述土壤氮素礦化作用速率的指標(biāo)，指單位時(shí)間內(nèi)土壤有機(jī)態(tài)氮經(jīng)礦化作用轉(zhuǎn)化為易被植物利用的無機(jī)態(tài)氮的量。它在一定程度上反映了土壤

3、對植物氮素的供應(yīng)能力，對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中作物的選擇和肥料的施用都起著指導(dǎo)性的作用。三、實(shí)驗(yàn)原理 返回測試方法簡介 目前國內(nèi)外土壤礦化氮的測定方法主要是生物培養(yǎng)法，此法測定的是土壤中氮的潛在供應(yīng)能力，其結(jié)果與植物生長的相關(guān)性較高。生物培養(yǎng)法分為好氧培養(yǎng)法（aerobic method）和厭氧培養(yǎng)法（anaerobic method）。好氧培養(yǎng)法：使土樣在適宜的溫度、水分、通氣條件下進(jìn)行培養(yǎng)，測定培養(yǎng)過程中釋放出的無機(jī)態(tài)氮，即在培養(yǎng)之前和培養(yǎng)之后測定土壤中無機(jī)態(tài)氮（銨態(tài)氮和硝態(tài)氮等）的總量，二者之差即為礦化氮。好氧培養(yǎng)法沿用至今已有很多改進(jìn)，主要反映在：用的土樣質(zhì)量（1015g）、加或不加填充物（如砂、

4、蛭石）以及土樣和填充物的比例、溫度控制（2535）、水分和通氣調(diào)節(jié)（如土10g，加水6mL或加水至土壤持水量的60%）、培養(yǎng)時(shí)間（1420天）等。很明顯，培養(yǎng)的條件不同，測出的結(jié)果也會(huì)不同。厭氧培養(yǎng)法：通常以水淹創(chuàng)造條件進(jìn)行培養(yǎng)（water logging method），測定土壤中有機(jī)態(tài)氮經(jīng)礦化作用轉(zhuǎn)化的無機(jī)態(tài)氮的量。其培養(yǎng)過程中條件的控制比較容易掌握，不需要考慮同期條件和嚴(yán)格的水分控制，可用較少土樣和較短培養(yǎng)時(shí)間，方法簡單且快速，結(jié)果的再現(xiàn)性較好，更適合于例行分析。故本試驗(yàn)采用厭氧培養(yǎng)法。三、實(shí)驗(yàn)原理 返回2、基本原理厭氧培養(yǎng)法基本原理 用水淹保溫法處理土壤，利用厭氧微生物在一定溫度下礦化

5、土壤有機(jī)態(tài)氮成為NH4N，再用2molL-1 KCl溶液浸提，浸出液中的NH4N，在堿液和還原劑的作用下用蒸餾法將NH3 蒸出，冷凝后用吸收液接收并滴定，從中減去土壤初始無機(jī)態(tài)氮（即原存在于土壤中的NH4N和NO3N），得到土壤礦化氮量。（也可以用氨氣敏電極測定水溶性氨，取代滴定過程） 四、實(shí)驗(yàn)儀器、試劑及配制 1主要儀器 半微量定氮蒸餾裝置; 半微量滴定管(5ml)或PNH3-1-氨氣敏電極返回四、實(shí)驗(yàn)儀器、試劑及配制2試劑 40%NaOH溶液 稱取工業(yè)用固體NaOH400g（用小燒杯做容器稱?。?，取硬質(zhì)1000ml玻璃燒杯，先加蒸餾水600mL，將稱好的NaOH緩緩倒入并不斷攪拌，以防止燒

6、杯底角固結(jié)。冷卻后倒入試劑瓶備用。（每樣品用量5ml）返回四、實(shí)驗(yàn)儀器、試劑及配制甲基紅溴甲酚綠混合指示劑溴甲酚綠和甲基紅溶于100mL乙醇中。返回四、實(shí)驗(yàn)儀器、試劑及配制 20gL-1 H2BO3吸收液20g H2BO3（化學(xué)純）溶于1L水中，每升H2BO3溶液中加入甲基紅溴甲酚綠混合指示劑5mL并用弱酸或弱堿（的Hcl或NaOH）調(diào)節(jié)至紫紅色。（指示劑靈敏范圍紫黑色紫紅色，吸收液易受到酸堿污染，臨用前配制并調(diào)色。） 翠綠色 暗綠色 灰黑色 紫黑色 暗紫色 紫紅色 酒紅色堿酸 (每樣品用量10ml)返回四、實(shí)驗(yàn)儀器、試劑及配制0.02 molL-1 (1/2H2SO4)標(biāo)準(zhǔn)溶液(根據(jù)實(shí)際情況

7、可選擇合適濃度酸液)先配制0.10 molL-1 (1/2H2SO4)溶液，然后用標(biāo)準(zhǔn)堿液標(biāo)定，再準(zhǔn)確稀釋而成。（精確）(每樣品用量2-5ml)返回四、實(shí)驗(yàn)儀器、試劑及配制 KCl 稱取KCl（化學(xué)純），溶于800ml蒸餾水中，定容至1L。(每培養(yǎng)樣用量80ml)返回四、實(shí)驗(yàn)儀器、試劑及配制 稱取KCL(化學(xué)純) 149g, 溶于800ml蒸餾水中，定容至1L。(每初始樣用量100ml)返回四、實(shí)驗(yàn)儀器、試劑及配制 FeSO4Zn粉還原劑將Fe SO47H2O（化學(xué)純）和Zn粉共同磨細(xì)（或分別磨細(xì)，分別保存，可數(shù)年不變，用時(shí)按比例混合）以5 :1混合盛于棕色瓶中備用（混合后易氧化，保存不可超過

8、一星期）。(每樣品用量1.2g)返回四、實(shí)驗(yàn)儀器、試劑及配制 比色液吸收液調(diào)色完成后，吸取吸收液10ml,置于50ml三角瓶中，用蒸餾水稀釋置40ml。返回五、實(shí)驗(yàn)方法與步驟實(shí)驗(yàn)安排實(shí)驗(yàn)計(jì)劃9日完成： 1、2第1日完成； 3第1-7日完成； 4第8-9日完成。 返回五、實(shí)驗(yàn)方法與步驟1土樣的采集與處理 土壤是一個(gè)不均一體，影響它的因素錯(cuò)綜復(fù)雜，因此土壤樣品的代表性與采樣誤差的控制直接相關(guān)，采樣時(shí)要貫徹“隨機(jī)”原則，即樣品應(yīng)當(dāng)隨機(jī)的取自所代表的總體。返回 五、實(shí)驗(yàn)方法與步驟 一般土樣采取自2-10cm土層土壤，也可根據(jù)采集地主要作物根系深度采取土樣。為樣品的保存和工作的方便，從野外采回的土樣都先

9、進(jìn)行風(fēng)干。 將采回的土樣，放在塑料布上，攤成薄薄的一層，置于室內(nèi)通風(fēng)陰干。在土樣半干時(shí)，須將大土塊捏碎（尤其是黏性土壤），以免完全干后結(jié)成硬塊，難以磨細(xì)。風(fēng)干場所力求干燥通風(fēng)，并要防止酸蒸氣、氨氣和灰塵的污染。 樣品風(fēng)干后，應(yīng)揀去動(dòng)植物殘?bào)w如根、莖、葉、蟲體等和石塊、結(jié)核（石灰、鐵、錳），再經(jīng)研細(xì)，使之通過2mm孔徑的篩子待測。返回 五、實(shí)驗(yàn)方法與步驟2培養(yǎng)土樣準(zhǔn)備 稱取過篩后的風(fēng)干土樣20.0g （記錄質(zhì)量）置于150mL三角瓶中，加蒸餾水，搖勻(土樣必須被水全部覆蓋)。加蓋橡皮塞，置于402恒溫生物培養(yǎng)箱中培養(yǎng)待測（七晝夜）。返回 五、實(shí)驗(yàn)方法與步驟3土壤初始氮的測定 稱取過篩后的風(fēng)干土樣

10、（記錄質(zhì)量），置于250mL三角瓶中，加2molL-1 KCl溶液100mL，加塞振蕩30min，過濾于150mL三角瓶中。 由進(jìn)樣口加入FeSO4Zn粉還原劑，用吸管吸取濾液30mL由進(jìn)樣口加入（此過程盡量將還原劑沖入反應(yīng)室），再加40%NaOH溶液5mL，立即封閉進(jìn)樣口并將預(yù)先將盛有20gL-1硼酸吸收液10mL的50ml三角瓶置于冷凝管下。通蒸汽蒸餾，當(dāng)吸收液達(dá)到40mL時(shí)停止蒸餾，取下三角瓶，用0.02molL-1 (1/2H2SO4) 標(biāo)準(zhǔn)液滴定并與比色液進(jìn)行比色，當(dāng)吸收液與比色液顏色基本一致后停止滴定，并記錄滴定所用酸的量。同時(shí)做空白試驗(yàn)。（亦可采用氨氣敏電極測定） 五、實(shí)驗(yàn)方法與

11、步驟注：如滴定用去的酸液少于1ml或超過5ml需調(diào)節(jié)酸濃度，使多數(shù)滴定值在2ml-4ml之間。 加堿液和加吸收液不能用同一個(gè)吸耳球，避免造成吸收液的污染。如果實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)原吸收液被污染，應(yīng)停止實(shí)驗(yàn)，重新對原吸收液調(diào)色，并重新配置比色液。返回 五、實(shí)驗(yàn)方法與步驟4土壤礦化氮和初始氮之和的測定 培養(yǎng)一周后取出礦化培養(yǎng)土樣，加80mL 2.5molL-1 KCl溶液，再用橡皮塞塞緊，在振蕩機(jī)上振蕩30min，取下立即過濾于150mL三角瓶中。蒸餾滴定過程同土壤初始氮的測定。同時(shí)做空白試驗(yàn)。（亦可采用氨氣敏電極測定）返回 六、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與計(jì)算 返回1結(jié)果計(jì)算 2、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)記錄表 返回3、擬結(jié)果記錄表七

12、、討 論對土壤礦化率可能產(chǎn)生影響的因素及產(chǎn)生影響的可能原因。（包括對人為誤差產(chǎn)生的討論）本實(shí)驗(yàn)除考慮測定樣地土壤礦化率外，也可以分不同的小組從多個(gè)角度進(jìn)行測定，并對各小組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行比較，（如對不同土質(zhì)土壤礦化率或同一土質(zhì)不同深度的土壤礦化率進(jìn)行對比實(shí)驗(yàn)）討論結(jié)果并分析影響土壤礦化率的因素。返回八、思考題 如果礦化率為負(fù)值，討論造成此實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可能原因。 請根據(jù)本組或其他小組所完成的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,分析影響土壤礦化率的因素和影響因素的作用機(jī)制。返回九、附錄：半微量蒸餾定氮器使用方法(Makham型)此儀器有兩種型號(hào)(見圖1、2)， 其結(jié)構(gòu)極其相似，不同的是： 1型進(jìn)樣漏斗位置在蒸餾器上方，易于操作

13、，裝置合理，洗滌方便，但是保溫能力稍差。2型進(jìn)樣漏斗在中部，保溫層7幾乎全部包圍反應(yīng)室，其優(yōu)點(diǎn)保溫好，蒸餾快。本儀器無蒸汽發(fā)生器，需自行配套。圖1中的蒸汽發(fā)生裝置可供參考，其制作如下：取2000ml或1000ml三角燒瓶， 裝上膠塞和安全管， 通入絕緣導(dǎo)線，連接500W 電熱絲，并外套瓷珠以絕緣，加入蒸餾水，通電加熱，外接調(diào)壓器可調(diào)節(jié)蒸汽大小。（也可用1000ml燒瓶和酒精燈自制簡易蒸汽發(fā)生器）返回九、附錄：半微量蒸餾定氮器使用方法(Makham型)操作方法 先連接好冷卻水(由 4 進(jìn)水 5 出水) 并接通蒸汽發(fā)生器。先通蒸汽洗滌定氮器內(nèi)室，待外室充滿蒸汽后，關(guān)閉6。蒸數(shù)分鐘，關(guān)閉進(jìn)汽開關(guān)A。

14、略等數(shù)秒鐘，反應(yīng)室2內(nèi)廢液即倒吸到7 （因蒸汽冷凝收縮形成負(fù)壓所至)，廢液由6放出。返回九、附錄：半微量蒸餾定氮器使用方法(Makham型) 返回樣品測定 把冷凝管下口插入接收瓶,催化劑和測試樣品由進(jìn)樣漏斗加入，加NaOH5ml后迅速蓋塞，加水液封。通入蒸汽，關(guān)閉6，從蒸餾出第一清蒸餾液(或指示劑變綠)開始計(jì)時(shí)，蒸餾約10-20分鐘，將接收液離開冷凝管口，再蒸餾1分鐘后停止，接收液馬上進(jìn)行滴定。蒸餾完畢后，由進(jìn)樣漏斗倒入蒸餾水洗滌反應(yīng)室，同前反復(fù)洗滌倒吸3次，即可測下一個(gè)樣品。 九、附錄：半微量蒸餾定氮器使用方法(Makham型) 返回注意事項(xiàng) （1）加樣時(shí)，開關(guān)6須打開，以免倒吸。 （2）吸

15、收液應(yīng)保持冷卻，防氨揮發(fā)而損失。 九、附錄：半微量蒸餾定氮器使用方法(Makham型)附錄 2 PNH3-1-氨氣敏電極的基本原理與操作方法 返回氣敏電極是離子選擇性電極的一個(gè)重要分支。它是指對樣品中溶解的氣態(tài)物質(zhì)能直接響應(yīng)的電極。因此氨氣敏電極可直接響應(yīng)水樣中氣態(tài)氨量，也可以在改變水樣的pH等條件測定NH4N總量。它是利用氣體可滲透而離子不可滲透的膜，將樣品溶液和內(nèi)充溶液分開的一種電極。樣品中溶解的氣態(tài)物質(zhì)，借助化學(xué)反應(yīng)使其逸出，以擴(kuò)散方式透過膜，從而引起膜內(nèi)電解質(zhì)中某一離子活度的變化，使得緊貼于膜內(nèi)的離子選擇性電位也變化，其電位變化值和樣品溶液中氣態(tài)物質(zhì)的存在形態(tài)及其含量有關(guān)。 附錄 2 PNH3-1-氨氣敏電極的基本原理與操作方法 返回在溶液中, 當(dāng)溶液的PH值大于14時(shí)溶液中的NH4+全部變成NH3 H+ 附錄 2 PNH3-1-氨氣敏電極的基本原理與操作方法適用范圍：水溶性氨濃度1