壬基酚和雙酚A檢測(cè)方法

1、1目的建立該程序?yàn)橐?guī)范壬基酚和雙酚A測(cè)定提供指導(dǎo)性文件。2適用范圍本規(guī)程適用于嬰幼兒食品及食用植物油和包材等雙酚人、壬基酚含量的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定。3原理3.1試樣中（嬰幼兒乳粉及粉狀原料）的壬基酚和雙酚A經(jīng)乙酸乙酯-環(huán)己烷（體積比按1:1）提取后，同位 素稀釋高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)（UPLC-MS/MS）檢測(cè)，與標(biāo)準(zhǔn)系列比較定量。3.2樣品（油類）經(jīng)過(guò)凝膠滲透色譜法（GPC）除脂凈化（乙酸乙酯:環(huán)己烷（1:1，v/v）超聲提?。?，同位素稀釋高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)（UPLC-MS/MS）檢測(cè)，與標(biāo)準(zhǔn)系列比較定量。3.3樣品（膜）經(jīng)過(guò)正己烷浸泡提取，氮吹（42 ）至干，用1ml甲醇

2、定容后，同位素稀釋高效液相色譜- 串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)（UPLC-MS/MS）檢測(cè)，與標(biāo)準(zhǔn)系列比較定量。4試劑和材料除非另有規(guī)定，本方法所用試劑均為色譜純，水為GB/T 6682規(guī)定的一級(jí)水。4.1乙酸乙酯4.2環(huán)己烷4.3壬基酚和雙酚A及其同位素內(nèi)標(biāo)（NP-d4、BPA-d4）4.4 甲醇4.5氨水（分析純）4.6乙月青4.7標(biāo)準(zhǔn)溶液4.7.1壬基酚和雙酚A標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（0.2mg/ml）：分別稱取壬基酚和雙酚A的標(biāo)準(zhǔn)品0.02g（精確到0.1mg）， 溶于甲醇中，用甲醇定容到100ml容量瓶中，放置于4C冰箱中。4.7.2壬基酚和雙酚A標(biāo)準(zhǔn)中間夜（2ug/ml）：分別吸取1ml壬基酚和雙酚A標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備

3、液，用甲醇定容至 100mL。4.7.3壬基酚和雙酚A標(biāo)準(zhǔn)工作液：分別吸取壬基酚和雙酚A標(biāo)準(zhǔn)中間夜10p l，25p l，50p l，75p l， 100p l，150p l，250p l，然后分別加入50p l壬基酚和雙酚A的同位素內(nèi)標(biāo)物標(biāo)準(zhǔn)中間液，最后加甲醇定 容至 1ml，配制成工作液濃度分別為 20ng/ml，50ng/ml，100ng/ml，150ng/ml，200ng/ml，300ng/ml，500ng/ml。 4.8內(nèi)標(biāo)物溶液4.8.1壬基酚和雙酚A同位素內(nèi)標(biāo)物標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（0.2mg/ml）：分別稱取壬基酚和雙酚A的同位素內(nèi)標(biāo)物 0.02g （精確到0.1mg），溶于甲醇中，用甲

4、醇定容到100ml容量瓶中，放置于4C冰箱中。4.8.2壬基酚和雙酚A的同位素內(nèi)標(biāo)物標(biāo)準(zhǔn)中間液（2ug/ml）：分別吸取1ml壬基酚和雙酚A的同位素內(nèi) 標(biāo)物標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用甲醇定容至100mL。5儀器和設(shè)備5.1 天平：感量為0.1mg。5.2渦旋振蕩器5.3氮吹儀5.4低溫低速離心機(jī)5.5超高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用儀5.6凝膠滲透色譜儀6分析步驟6.1試樣處理6.1.1嬰幼兒乳粉及粉狀原料稱取試樣1g （原料根據(jù)實(shí)際情況酌情減少稱樣量）精確到0.1mg于50ml干燥的玻璃離心管中，向樣 品中分別加入50p l壬基酚和雙酚A的同位素（200ng/ml）內(nèi)標(biāo)物（NP4-n-NP-d4和BPA-d4）,加

5、入8ml 乙酸乙酯-環(huán)己烷溶液（體積比按1:1），渦旋振蕩30s，離心10min（1000轉(zhuǎn)/min）。然后再重復(fù)上述操作 進(jìn)行第二次提取，將兩次的上清液合并至同一個(gè)試管中。然后將上清液轉(zhuǎn)移到氮吹管中，進(jìn)行氮吹（42C）， 吹干后用1ml甲醇進(jìn)行定容，用0.22有機(jī)濾膜過(guò)濾后上機(jī)，同時(shí)做試劑空白試驗(yàn)。6.1.2包材準(zhǔn)確裁取一定面積（15*30cm）的包材，然后進(jìn)行塑封，向其中加入100ml的正己烷進(jìn)行浸泡，向浸 泡液中分別加入50p l壬基酚和雙酚A的同位素（1ug/ml）內(nèi)標(biāo)物（NP4-n-NP-d4和BPA-d4）.浸泡5 小時(shí)，每隔半個(gè)小時(shí)搖晃一次。取出20ml浸泡液于干凈的試管中進(jìn)行氮

6、吹（42C），吹干后用1ml甲醇進(jìn) 行定容，同時(shí)做試劑空白試驗(yàn)。用0.22有機(jī)濾膜過(guò)濾后上機(jī)。6.1.3食用植物油稱取食用植物油樣品0.4 g于GPC樣品管中，向樣品中分別加入50p l壬基酚和雙酚A的同位素內(nèi)標(biāo) 物標(biāo)準(zhǔn)中間液（200ng/ml）,加入5 mL乙酸乙酯:環(huán)己烷（1:1，v/v），2000 rpm渦旋混合1 min，用于GPC 凈化。GPC分離采用苯乙烯樹脂Biobead SX-3 （300 x 10 mm）凝膠色譜柱，流動(dòng)相為乙酸乙酯:環(huán)己烷（1:1， v/v），流速3.0 mL/min。收集14-17 min組分于100 mL茄形瓶中，30C， 120 rpm旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，1

7、 mL 甲醇（3.1）定容，用0.22有機(jī)濾膜過(guò)濾后上機(jī)，同時(shí)做試劑空白試驗(yàn)。6.2測(cè)定6.2.1參考液相色譜條件色譜柱：Waters ACQUITY UPLCTM BEH C18柱（50 mm X 2.1 mm）；捕集柱：Waters Isolator Column （P/N： 186004476），捕集柱位于進(jìn)樣閥之前（圖1）。流動(dòng)相:甲醇-0.1%氨水進(jìn)樣量：10 l流速：0.3mL/min柱溫：355C樣品室溫度：155C根據(jù)儀器性能調(diào)至最佳狀態(tài)，液相儀器參考條件見(jiàn)下表 目標(biāo)化合物參考液相色譜條件時(shí)間（min）流速（ml/min）A% （甲醇）B%（0.1%氨水溶液）0.340600.

8、60.3100020.310002.50.3406030.340606.2.2參考質(zhì)譜條件質(zhì)譜條件：離子源，電噴霧電離ESI （-）；毛細(xì)管電壓，2.8 KV；離子源溫度，150C；脫溶劑 溫度，400C；脫溶劑氣流量，800 L/h；錐孔氣流量為50 L/h。采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)具體的離子采集 參數(shù)見(jiàn)下表化合物名稱母離子（m/z）子離子（m/z）錐孔電壓v碰撞能量ev4-NP （壬基酚）219.19132.934304-NP （壬基酚）219.19146.883426BPA （雙酚A）227.06132.783630BPA （雙酚A）227.06211.9636266.2.3 超高效液相色譜-質(zhì)譜

9、聯(lián)用儀測(cè)定（定量測(cè)定）將標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用甲醇稀釋稱為標(biāo)準(zhǔn)工作液，在儀器最佳工作條件下，標(biāo)準(zhǔn)工作液分別進(jìn)樣，以標(biāo)準(zhǔn)工作液 濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。采用外標(biāo)法進(jìn)行定量測(cè)定，樣品溶液中的待測(cè)物的響應(yīng)值應(yīng)該在標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍內(nèi)。7.1分析結(jié)果的表述7.1.1試樣（粉和油）中壬基酚和雙酚A的含量按下式計(jì)算：X=CV/m式中：X試樣中檢測(cè)目標(biāo)化合物殘留量，單位為微克每千克（四g/kg）C由回歸曲線計(jì)算得到的上機(jī)試樣溶液中目標(biāo)化合物含量，單位為納克毫升（ng/ml）；V濃縮至干后試樣的定容體積，單位為毫升（mL）；m試樣的質(zhì)量，單位為克（g）。7.1.2試樣（膜）中壬基酚和雙酚A的含量按下式計(jì)算：X=6*CV*f/S式中：X試樣中檢測(cè)目標(biāo)化合物殘留量，單位為微克每千克（四g/kg）C由回歸曲線計(jì)算得到的上機(jī)試樣溶液中目標(biāo)化合物含量，單