復(fù)方五仁醇膠囊保肝作用的血清藥理學(xué)研究

1、復(fù)方五仁醇膠囊保肝作用的血清藥理學(xué)研究【摘要】目的：建立復(fù)方五仁醇膠囊血清藥理學(xué)研究方法。方法：建立l4誘導(dǎo)的原代培養(yǎng)大鼠肝細(xì)胞損傷模型，大鼠為含藥血清供體，以含藥血清對(duì)損傷肝細(xì)胞增殖TT法及丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶ALT泄漏的影響兩個(gè)指標(biāo)，結(jié)合含藥血清中五味子乙素的含量測(cè)定，分別采用單因素考察、多因素的正交試驗(yàn)，優(yōu)選含藥血清的制備方法，并確定體系中血清添加量。結(jié)果：每天以成人等效劑量10倍的甲醇提取物間隔8h分兩次給正常大鼠灌胃給藥，連續(xù)3天，末次給藥后2h采血制備含藥血清比擬合理，體系中參加10%該條件下制備的含藥血清能明顯進(jìn)步損傷肝細(xì)胞的增殖才能、降低細(xì)胞ALT泄漏。結(jié)論：適宜條件下制備的復(fù)方五

2、仁醇膠囊含藥血清對(duì)肝細(xì)胞損傷具有明顯的保護(hù)作用，血清藥理學(xué)研究方法可以用于該制劑的藥效評(píng)價(jià)?！娟P(guān)鍵詞】復(fù)方五仁醇膠囊；保肝作用；含藥血清；血清藥理學(xué)Abstratbjetive：Testablishaserupharalgytestingethdfrpundurenhunapsules().ethds：delfl4-induedinjuryfpriaryulturehepatyteasestablishedandratasusedasthednrtprepareseruntaining.ithhepatyteinreent(TT),alanineaintransferase(ALT)inell

3、ultureediuandthententfshisandrininseruasindies,single-fatrinvestigatinandultiple-fatrrthgnalexperienterearriedut,usingserurplasa,andseruntainingdruginulturesystefdifferentnentratinnpharalgialeffetandtsreenfthepreparativeethdfseruntainingdruganditssuitablenentratininulturesyste.Results：Nralratsasthed

4、natrfseru,usingethanliextratf,10tiesequivalentdsefradultseveryday,intragastriadinistratintieadayf8-hurinterval,keepingn3days,hespasiaafter2hursfthelastadinistratinasthebetterpreparativeethdftheseruntainingdrug.Adding10%fthisserutulturesysteuldelevatehepatyteinreentanddepressALTinellultureediusignifi

5、antly.nlusin：Seruntainingpreparedbysuitableethdpssessesanbviusprtetiveeffetninjuredhepatyteandserupharalgyanbeappliedtevaluatedthepharalgialeffetf.Keyrdspundurenhunapsules();Liverprtetin;Seruntainingdrug;Serupharalgy中藥“血清藥理學(xué)是指在動(dòng)物經(jīng)口服給藥一段時(shí)間后采血?jiǎng)e離血清，用此含藥血清進(jìn)展體外藥理實(shí)驗(yàn)的一種實(shí)驗(yàn)方法，該方法作為中藥研究的新思路和新方法而倍受推崇。復(fù)方五仁醇膠囊是我

6、院研制的以五味子為君藥的治療慢性肝炎的科研制劑，我們對(duì)該制劑進(jìn)展了“血清藥理學(xué)研究的方法學(xué)討論。1材料與方法1.1材料1.1.1動(dòng)物SD大鼠，SPF級(jí)，體重23019.8g，雌雄不拘，由南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。1.1.2試劑與試藥羥乙基哌嗪乙磺酸香港FAR公司；乙二醇雙(2-氨基乙醚)四乙酸美國(guó)ARES公司分裝；膠原酶IV美國(guó)Siga公司分裝；胰蛋白酶美國(guó)Siga公司分裝；DE培養(yǎng)基美國(guó)GIB公司；新西蘭新生小牛血清美國(guó)Hylne公司；四氯化碳宜興市第二化學(xué)試劑廠；溴化3-(4,5-二甲基噻唑)-2,5-二苯基四氮唑藍(lán)TT，ARES公司；五味子乙素中藥固體制劑制造技術(shù)國(guó)家工程研究中心；復(fù)方五

7、仁醇膠囊本院自制。1.1.3儀器HERAell2培養(yǎng)箱德國(guó)GbH公司；BI-TEK340酶標(biāo)儀美國(guó)Siga公司；日立7170全自動(dòng)生化分析儀日本日立公司；Agilent1100Series高效液相色譜儀美國(guó)Agilent公司。1.2方法1.2.1大鼠灌胃用藥物的處理取復(fù)方五仁醇膠囊內(nèi)容物，加0.5%-Na制成混懸液。另取復(fù)方五仁醇膠囊內(nèi)容物，甲醇回流提取，加0.5%-Na制成混懸液。1.2.2肝細(xì)胞的別離與培養(yǎng)按文獻(xiàn)1方法別離大鼠肝細(xì)胞，并以1105/2接種于96孔及48孔培養(yǎng)板中，置2培養(yǎng)箱5237培養(yǎng)。1.2.3含藥血清制備方法考察給藥形式及劑量考察取SD大鼠20只，隨機(jī)分成5組制劑原形組

8、，提取物小劑量、中劑量、大劑量組和空白組，每組4只，禁食12h。制劑原組組每天按照成人臨床等效劑量的10倍分兩次灌胃制劑混懸液，提取物小劑量、中劑量和大劑量組同法分別灌胃5、10和20的提取物混懸液，連續(xù)給藥3天，末次給藥后1h頸總動(dòng)脈取血，4過(guò)夜，別離血清，空白組每天0.5%-Na灌胃，同法制備空白血清。取培養(yǎng)24小時(shí)的肝細(xì)胞，吸棄上清液，隨機(jī)分成6組正常對(duì)照組，模型對(duì)照組，制劑原形組，提取物小劑量、中劑量、大劑量組，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。除正常對(duì)照組外，每孔參加含l4的DE及相應(yīng)含藥血清模型對(duì)照組為空白血清，l4和血清的終濃度分別為10l/L和10，正常組相應(yīng)參加DE培養(yǎng)液和空白血清。作用24h

9、后，搜集48孔板中培養(yǎng)上清液檢測(cè)ALT。96孔板中每孔參加5g/l的TT液20l，繼續(xù)孵育4h，每孔再參加DS200l，振蕩后，用酶標(biāo)儀于波長(zhǎng)570n測(cè)吸光值A(chǔ)。1.2.4含藥血清制備方法考察其他條件的正交試驗(yàn)考察以動(dòng)物是否造模、給藥間隔時(shí)間、取血時(shí)間、取血成分為考察因素，每個(gè)因素設(shè)2個(gè)程度見表1，選用L8(27)正交表安排試驗(yàn)。取SD大鼠32只，隨機(jī)分成8組，每組4只，其中肝損傷模型大鼠給藥前24h腹腔注射l41.0l/kg。各組每天按照成人臨床等效劑量的10倍分兩次灌胃提取物混懸液，末次頸總動(dòng)脈取血，血漿組血液立即離心別離血漿，血清組血液4過(guò)夜，別離血清。取培養(yǎng)24h的肝細(xì)胞，吸棄上清液，

10、隨機(jī)分成8組，分別用以上制得的含藥血清血漿按1.2.3相應(yīng)方法處理，測(cè)定ALT及吸光值A(chǔ)。按文獻(xiàn)方法2制備對(duì)照品及含藥血清血漿供試品溶液，注入液相色譜儀，測(cè)定五味子乙素含量。1.2.5體系中含藥血清添加量考察取培養(yǎng)24h的肝細(xì)胞，棄上清液，隨機(jī)分成6組正常對(duì)照組，模型對(duì)照組，5%、10%、20%、40%含藥血清組，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。模型對(duì)照組和各含藥血清組更換為參加l410l/L的DE培養(yǎng)液，正常對(duì)照組相應(yīng)參加DE培養(yǎng)基，正常對(duì)照組和模型對(duì)照組參加終濃度為10的空白血清，各含藥血清分別組參加按1.2.4中正交試驗(yàn)1號(hào)方案制備的含藥血清，使終濃度分別為5%、10%、20%和40%。作用24h后，按

11、1.2.3相應(yīng)方法處理，測(cè)定ALT及吸光值A(chǔ)。轉(zhuǎn)貼于論文聯(lián)盟.ll.1.2.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法使用Stata7.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)展數(shù)據(jù)處理。數(shù)據(jù)以xs表示，用方差分析處理數(shù)據(jù)。2結(jié)果2.1含藥血清制備方法考察：給藥形式及劑量考察與正常對(duì)照組相比，模型對(duì)照組TT值顯著下降P0.01、ALT顯著升高P0.01，說(shuō)明造模獲得成功；與模型對(duì)照組比擬，除提取物小劑量組TT值無(wú)顯著差異外P0.05，其余各試驗(yàn)組TT值均明顯升高P0.01或P0.05，ALT明顯下降P0.01或P0.05；與提取物中劑量組比擬，等劑量灌胃制備的制劑原形組TT值及ALT差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P0.05。結(jié)果提示，制劑的甲醇提取物與制劑原形

12、具有等效性，且3個(gè)劑量組不存在明顯的量效關(guān)系。故確定以成人臨床等效劑量10倍的甲醇提取物給大鼠灌胃制備含藥血清。見表2。2.2含藥血清制備方法考察：其他條件的正交試驗(yàn)考察將各試驗(yàn)組3個(gè)指標(biāo)的測(cè)定結(jié)果分別按百分制轉(zhuǎn)換成積分TT、五味子乙素以最高為100，ALT以倒數(shù)計(jì)算，最高為100，綜合加權(quán)評(píng)分TT、ALT、五味子乙素分別占35%、35%和30%后進(jìn)展統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果見表3。方差分析結(jié)果顯示，因素取血時(shí)間對(duì)結(jié)果有極顯著影響P0.01，B因素給藥間隔時(shí)間有顯著影響P0.05，且兩者之間存在交互作用B之P0.05，交互作用分析顯示最正確組合為B11，血漿的影響優(yōu)于血清，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P0.05，而動(dòng)

13、物是否造模幾乎沒有影響見表4。因此，含藥血清制備方法可定為A1B11D1，即每天間隔8h給正常大鼠灌胃給藥2次，連續(xù)3天，末次給藥后2h取血?jiǎng)e離血清。2.3體系中含藥血清添加量考察與模型對(duì)照組比擬，各濃度含藥血清組TT值均明顯升高P0.01或P0.05，ALT均顯著下降P0.01；與10%含藥血清組比擬，20%、40%含藥血清組TT值明顯下降P0.01或P0.05，5%含藥血清組無(wú)顯著差異P0.05，5%、20%、40%含藥血清組ALT均明顯升高P0.01或P0.05。提示體系中參加10%的含藥血清效果最正確見表5。3討論目前含藥血清的制備多數(shù)采用藥效指標(biāo)考察，少數(shù)考慮化學(xué)指標(biāo)，且無(wú)視了各影響

14、因素的交互作用。本課題采用藥理和化學(xué)指標(biāo)相結(jié)合加權(quán)評(píng)分的正交試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)存在交互作用。理論上講，宜采用病理狀態(tài)下的動(dòng)物制備含藥血清3，但是，本研究結(jié)果顯示，動(dòng)物是否造模幾乎對(duì)結(jié)果沒有影響，與文獻(xiàn)報(bào)道一致4。有學(xué)者提出“血漿藥理學(xué)優(yōu)于“血清藥理學(xué)5，本研究結(jié)果顯示，血漿與血清對(duì)結(jié)果的影響雖然沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但直觀分析前者優(yōu)于后者，與先期發(fā)現(xiàn)的血漿中藥效成分含量高于血清的結(jié)果2一致，后續(xù)研究應(yīng)該注意。研究結(jié)果顯示，含藥血清濃度超過(guò)一定范圍藥效反而降低，這可能是由于血清濃度過(guò)高會(huì)產(chǎn)生一定的細(xì)胞毒性6?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1徐淑云.藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué).第3版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2002：581-583.2羅琳，竇志華，丁安偉，等大鼠灌胃復(fù)方五仁醇膠囊后血清和血漿中五味子醇甲和五味子乙素的比擬J中草藥，2022，3710：1486-1489.3張聲鵬，施旭光，桂蜀華關(guān)于中藥血清藥理學(xué)中血清供體