實驗一 葉綠體的分離與熒光觀察

1、實驗一葉綠體的分離與熒光觀察一、實驗目的：通過植物細胞葉綠體的分離，了解細胞器分離的一般原理和方法。觀察葉綠體的自發(fā)熒光和次生熒光，并熟悉熒光顯微鏡的使用方法。二實驗原理：將組織勻漿后懸浮在等滲介質(zhì)中進行差速離心，是分離細胞器的常用方法。 一個顆粒在離心場中的沉降速率取決于顆粒的大小、形狀和密度，也同離心力以 及懸浮介質(zhì)的黏度有關(guān)。在一給定的離心場中，同一時間內(nèi)，密度和大小不同的 顆粒其沉降速率不同。一次增加離心力和離心時間，就能夠使非均一懸浮液中的 顆粒按其大小、密度先后分批沉降在離心管底部，分批收集即可獲得各種亞細胞 組分。葉綠體的分離應在等身溶液(0.35mol/L氯化鈉或0.4mol/

2、L蔗糖溶液)中 進行，以免滲透壓的改變使葉綠體損傷。將勻漿液在1000r/min的條件下離心 2分鐘，以去除其中的組織殘渣和未被破碎的完整細胞。然后，在3000r/min 的條件下離心5分鐘，即可獲得沉淀的葉綠體(混有部分細胞核)。分離過程最 好在0 C5C的條件下進行；如果在室溫下，要迅速分離和觀察。利用熒光顯微鏡對可發(fā)熒光的物質(zhì)進行檢測時，將受到許多因素的影響，如 溫度、光、淬滅劑等。因此在熒光觀察時應抓緊時間，有必要時立即拍照。另外， 在制作熒光顯微標本時最好使用無熒光載玻片、蓋玻片和無熒光油。三、實驗用品：1、材料：新鮮菠菜2、試劑：（1）0.35mol/L氯化鈉溶液（2）0.01%吖

3、啶橙（acridine orange）3、器材：（1）主要設(shè)備：普通離心機，組織搗碎機，粗天平，熒光顯微鏡。（2）小型器材：500ml燒杯2個，250ml量筒1個，滴管20支，10ml刻度離心管20支，試管架5個，紗布若干，無熒光載玻片和蓋玻片各4片等。1、葉綠體的分離與觀察：（1選取新鮮的嫩菠菜葉洗凈擦干后去除葉梗脈稱30g于150ml 0.35mol/LNaCl溶液中，裝入組織搗碎機。（2）利用組織搗碎機低速（5000r/min）勻漿23分鐘。（3）將勻漿用6層紗布過濾于500ml燒杯中。（4）取濾液4ml在1000r/min下離心2min。棄去沉淀。（5）將上清液在3000r/min下離

4、心5分鐘。棄去上清液，沉淀即為葉綠體（混 有部分細胞核）。（6）將沉淀用0.35mol/L NaCl溶液懸浮。（7）取上述葉綠體懸液一滴滴于載玻片上，加蓋玻片后即可在普通光鏡和熒光 顯微鏡下觀察:在普通光鏡下觀察;在熒光顯微鏡下觀察葉綠體的直接熒光; 在熒光顯微鏡下觀察葉綠體的間接熒光，取葉綠體懸液一滴滴在無熒光載玻片上，再滴加一滴0.01%吖啶橙熒光染料，加蓋玻片后即可在熒光顯微鏡下觀察。2、菠菜葉手切片觀察：用剃須刀片將新鮮的嫩菠菜葉切削出一斜面置于載玻片上，滴加1-2滴0.35mol/L NaCl溶液，加蓋玻片后輕壓，置顯微鏡下觀察。（1）在普通光鏡下觀察。（2）在熒光顯微鏡下觀察其直接熒光。（3）觀察其間接熒光：向所制手切片上滴加1-2滴0.01%吖啶橙染液，染色1 分鐘，洗去余液，加蓋玻片后即可在熒光顯微鏡下觀察其間接熒光。瓦實驗結(jié)果：1、葉綠體的分離和觀察：（1）在普通光鏡下，葉綠體呈現(xiàn)綠色的長橢圓形。（2）在熒光顯微鏡下，當用綠光照射時，葉綠體發(fā)出紅色熒光；而用藍光照射時，同樣發(fā)出紅色熒光，相對綠光照射時的較暗。而用吖啶橙染色后，葉綠體發(fā)出紅色熒光，而混雜在其中的細胞核細胞核發(fā)出綠 色熒光。2、菠菜葉手切片觀察：1）在普通光鏡下可以看到3種細胞：（1