臨床免疫檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)課件：外周血單個(gè)核細(xì)胞分離

1、外周血單個(gè)核細(xì)胞分離實(shí)驗(yàn)原理外周血中的單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）包括單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，其常用的分離方法為密度梯度離心法，采用ficoll分層液作為分離液。Ficoll分層液即為聚蔗糖-泛影葡胺分層液，其密度為1.0770.001。外周血中的紅細(xì)胞和粒細(xì)胞密度較大，為1.090左右，而PBMC密度為1.0501.077，血小板為1.0301.035。紅細(xì)胞和粒細(xì)胞比重大，離心后沉于管底； PBMC的比重小于或等于分層液，離心后漂浮于分層液的液面上，也可有少部分細(xì)胞懸浮在分層液中。吸取分層液液面上的細(xì)胞，就可從外周血中分離到單個(gè)核細(xì)胞。主要的試劑和器材Ficoll分層液250U/ml 肝素溶液5g/

2、L臺盼蘭Hanks液、含20滅活小牛血清的Hanks液注射器、一次性試管、一次性吸管、細(xì)胞計(jì)數(shù)板、載玻片、蓋玻片、加樣槍、一次性槍頭水平離心機(jī)、顯微鏡（注：綠色字體的物品三組一份，放在中間組；一次性的物品請適量取材。）實(shí)驗(yàn)步驟抽取靜脈血1.5ml，打到肝素抗凝管中，再加等量的Hanks液，混勻，稱為稀釋的全血將稀釋的全血沿管壁緩緩地加到分層液上水平離心，2000rpm20min吸取白色云霧狀的那一層到另一玻璃管中加入4ml Hanks液，混勻，1000rpm5min ，棄上清（洗滌細(xì)胞）將細(xì)胞重復(fù)洗滌2次（末次用含20滅活小牛血清的Hanks液洗）末次洗滌后，棄上清，留在管底的即為PBMC，用

3、含20滅活小牛血清的Hanks液0.5ml重懸細(xì)胞充池、計(jì)數(shù)，將細(xì)胞調(diào)節(jié)成12106/ml 取1d細(xì)胞懸液和1d臺盼蘭于玻片上，混勻，計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，計(jì)算細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn)結(jié)果PBMC計(jì)數(shù)結(jié)果記錄和計(jì)算單個(gè)核細(xì)胞活力計(jì)數(shù)結(jié)果記錄和活力計(jì)算 注：死細(xì)胞染成藍(lán)色，活細(xì)胞不染色注意事項(xiàng)將血液進(jìn)行稀釋可降低血液黏稠度和紅細(xì)胞的聚集，提高單個(gè)核細(xì)胞的收獲量。分層液應(yīng)直接加入管底，防止浸沾四周管壁。將稀釋的全血加于分層液上時(shí)務(wù)必小心，不要擾亂界面以影響分離效果。溫度變化可直接影響分層液的密度，從而影響細(xì)胞的收獲率和純度，故應(yīng)在室溫（1825）下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，分層液使用之前應(yīng)預(yù)溫至室溫。溫度過低，淋巴細(xì)胞丟失增多，

4、溫度過高，會影響淋巴細(xì)胞活性。分離時(shí)的轉(zhuǎn)速與時(shí)間應(yīng)根據(jù)不同樣品作相應(yīng)調(diào)整。離心速度在20002500rpm，離心時(shí)間為15-20min，離心后若間白霧狀細(xì)胞層中仍摻有紅細(xì)胞，應(yīng)該提高轉(zhuǎn)速或延長離心時(shí)間，若淋巴細(xì)胞丟失過多，則應(yīng)該適當(dāng)降低轉(zhuǎn)速或離心時(shí)間。應(yīng)用與評價(jià)本方法操作簡便、穩(wěn)定。細(xì)胞回收率達(dá)8090，單個(gè)核細(xì)胞純度可達(dá)95，細(xì)胞活力可達(dá)95以上。該方法是目前最理想、最常用的分離淋巴細(xì)胞的手段，其制備的細(xì)胞（主要是淋巴細(xì)胞，約占90%95% ）懸液已能滿足許多細(xì)胞免疫實(shí)驗(yàn)要求，也可用于進(jìn)一步制備T細(xì)胞、B細(xì)胞及單核細(xì)胞，故在免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)中有廣泛應(yīng)用，是細(xì)胞免疫檢測中最基本的方法之一。E花環(huán)形成

5、試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)原理人外周血中的T細(xì)胞表面具有能與綿羊紅細(xì)胞（SRBC）表面糖肽結(jié)合的受體，稱為E受體（CD2）。已證實(shí)E受體是人類T細(xì)胞所特有的表面標(biāo)志。當(dāng)T細(xì)胞與SRBC混合后，SRBC便粘附于T細(xì)胞表面，呈現(xiàn)花環(huán)狀。通過花環(huán)形成檢測T細(xì)胞的方法，稱為E花環(huán)形成試驗(yàn)。根據(jù)花環(huán)形成的多少，可測知T細(xì)胞的數(shù)目，從而間接了解機(jī)體細(xì)胞免疫功能狀態(tài)，判斷疾病的預(yù)后，考核藥物療效等。 主要試劑和器材0.5SRBC懸液0.8戊二醛瑞氏染液（在水槽邊）一次性滴管、玻璃管、載玻片、蓋玻片、加樣槍、一次性槍頭離心機(jī)、4冰箱、顯微鏡（注：綠色字體的物品三組一份，放在中間組；一次性的物品請適量取材。）實(shí)驗(yàn)步驟 取1210

6、6/ml的PBMC懸液0.2ml和0.5SRBC 0.2ml，混勻，37水浴5min。500rpm5min，放4冰箱2h（午休時(shí)間）。 輕輕吸去上清0.2ml，沿管壁輕輕加入0.8戊二醛0.2ml, 放4冰箱20min。輕輕吹吸均勻沉淀細(xì)胞。結(jié)果觀察濕片法：取1d細(xì)胞懸液滴加于玻片上，直接高倍鏡下觀察。干片法：取細(xì)胞懸液涂片，自然干燥，瑞氏染色I(xiàn)液（藍(lán)色）10s，II液（無色）2min，流水輕輕沖洗，干燥后，油鏡下觀察。結(jié)果判斷 淋巴細(xì)胞呈藍(lán)紫色，SRBC淡藍(lán)色，凡結(jié)合3個(gè)或3個(gè)以上SRBC的細(xì)胞則為E花環(huán)形成細(xì)胞（ERFC），計(jì)數(shù)100個(gè)淋巴細(xì)胞，求出E花環(huán)形成率。正常值：Et花環(huán)形成率為6

7、080注意事項(xiàng) SRBC與淋巴細(xì)胞混合后離心速度不能過高，置4應(yīng)至少1h以上或過夜。SRBC以保存1周以內(nèi)最好，超過2周則與淋巴細(xì)胞結(jié)合力下降，超過56周，則不能再用。SRBC與淋巴細(xì)胞混合比例以100:1200:1為宜；淋巴細(xì)胞離體后不能超過6h，否則會影響花環(huán)形成率。溫度對實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響較大，故實(shí)驗(yàn)溫度條件應(yīng)該保持一致，從4取出后應(yīng)立即計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)前將沉淀重懸時(shí)，使細(xì)胞團(tuán)塊松散即可，不可強(qiáng)力吹打，以免SRBC從淋巴細(xì)胞上脫落。應(yīng)用與評價(jià)該試驗(yàn)可用于先天性細(xì)胞免疫缺陷病的檢測；腫瘤病人療效觀察及預(yù)后判斷；評價(jià)遲發(fā)型超敏反應(yīng)、某些感染和組織器官移植，了解機(jī)體細(xì)胞免疫狀態(tài)；探討某些疾病發(fā)病機(jī)制；考核

8、藥物療效及研究藥物作用機(jī)制；也可用于T淋巴細(xì)胞的分離。該方法簡便易行，曾被廣泛應(yīng)用，但影響因素較多，結(jié)果偏差較大，已經(jīng)被CD抗原免疫檢測法取代。同學(xué)們： 中午離開前，請將細(xì)胞計(jì)數(shù)板沖洗干凈，關(guān)閉顯微鏡光源。下午實(shí)驗(yàn)后，請將使用過的一次性器材丟入垃圾桶，使用過的玻璃器材沖洗干凈后放入水槽邊上的回收桶中，整理好自己的臺面再離開！ 值日生請認(rèn)真做好本職工作！細(xì)胞計(jì)數(shù)一. 實(shí)驗(yàn)原理 應(yīng)用顯微鏡的成像原理，并借助血細(xì)胞計(jì)數(shù)板，計(jì)算單位體積的細(xì)胞數(shù)量。二實(shí)驗(yàn)步驟取細(xì)胞計(jì)數(shù)板，加蓋玻片蓋住兩邊的小槽。充液：用小滴管將一小滴細(xì)胞懸液滴在蓋玻片邊緣的玻片上，使液體借毛細(xì)管作用自動滲透入計(jì)數(shù)室中。如滴入過多，溢出并流入兩側(cè)槽內(nèi)，使蓋玻片浮起，體積改變，會影響計(jì)數(shù)結(jié)果，需用紗布將計(jì)數(shù)池和玻片擦干，重新充池。如滴入溶液過少，經(jīng)多次充液，易產(chǎn)生氣泡，也應(yīng)重新充池。計(jì)數(shù)：充液后靜置1min，待細(xì)胞下沉后，方可進(jìn)行計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)四角四個(gè)大方格中的細(xì)胞數(shù)，計(jì)數(shù)時(shí)為了防止重復(fù)和遺漏，應(yīng)按一定的順序，先自左向右數(shù)到最后一格，下一行格子則自右向左，再下一行又自左向右，即呈S形計(jì)數(shù)。對于分布在刻線上的細(xì)胞，依照“數(shù)上不數(shù)下，數(shù)左不數(shù)右