不同時長的束縛應激致雌雄大鼠的抑郁樣行為改變

1、項目基金全軍醫(yī)學科技“十二五”科研項目（BWS11J052）、新疆科技廳支疆項目（201491174）科技部國際科技合作專項 (2011DFA32730)作者簡介張北月( 1991 ) ，女，碩士研究生，研究方向：神經(jīng)藥理，E-mail: 774156423。通訊作者劉新民( 1962 )，男，博士生導師，研究方向：神經(jīng)藥理， E-mail: liuxinmin 。不同時長的束縛應激致雌雄大鼠的抑郁樣行為改變張北月1,2，盧聰1，董黎明1，徐攀1，何怡然1,3，石晉麗2，劉新民1,3*中國醫(yī)學科學院藥用植物研究所，北京，100193；2.北京中醫(yī)藥大學，北京，100029；3. 湖南中醫(yī)藥大學

2、，長沙，410208 )【摘要】目的 探討不同束縛時長的慢性束縛應激對雌雄SD大鼠抑郁樣行為的影響，為慢性束縛應激模型中實驗動物性別和實驗時長的選擇提供依據(jù)。方法 對SD大鼠（雌雄各半）每天束縛 10 h和14 h，連續(xù)束縛28 d建立慢性束縛應激模型。采用體重監(jiān)測、糖水偏愛實驗、自主活動實驗、新奇事物實驗等實驗方法，觀察不同束縛時長的慢性束縛應激對雌雄SD大鼠所致的抑郁樣行為。結(jié)果 14h/28dCRS組雌雄大鼠的運動時間和中央?yún)^(qū)活動時間減少、糖水偏愛指數(shù)降低、對新奇事物探索潛伏期增多、探索時間和次數(shù)減少，這些實驗結(jié)果與對照組相比均有顯著差異。而10h/28dCRS組雌雄大鼠與對照組相比以上

3、實驗結(jié)果僅個別指標有顯著性差異。在雌雄鼠比較中，14h/28d CRS雄性組的糖水偏愛指數(shù)顯著減少，對應的雌性大鼠卻未顯著減少。10h/28dCRS雄性組在中央?yún)^(qū)運動時間比對照組少、對新事物探索潛伏期明顯延長、探索時間縮短，而對應雌性大鼠無顯著性差異。結(jié)論 14h/28dCRS雌雄鼠在糖水偏愛實驗、自主活動實驗、新奇事物實驗均顯著表現(xiàn)出抑郁樣行為。而10h/28dCRS僅雄性組表現(xiàn)出一定的抑郁樣行為的趨勢。慢性束縛應激更易致雄性大鼠產(chǎn)生抑郁樣行為?！娟P鍵詞】慢性束縛應激；抑郁樣行為；束縛時長；Sprague-Dawley大鼠Depressive-like behavior of male an

4、d female rats induced by restraint stress with different restraint durationZHANG Bei-yue 1,2, LU Cong1, DONG Li-ming1, XU Pan1,HE Yi-ran 1,3, SHI Jin-li 2, LIU Xin-min 1, *(1.Institute of medicinal plants, Chinese Academy of Medical Sciences, Beijing, 100193, China ;2.Beijing University of Chinese M

5、edicine, Beijing, 100029,China,3.Hunan University of Chinese Medicine,Hunan,410208,China )Abstract Objective To investigate the effects of chronic restraint stress on the depressive-like behavior of male and female SD rats with different restraint duration. Methods Sprague-Dawley rats (male and fema

6、le) were subjected to restraint stress 10h/14 h daily for 28 days.After that, sucrose preference test, open-field test, novel object test, were performed for all the rats to observe the effects of different restraint duration of chronic restraint stress on the depressive-like behaviors in male and f

7、emale SD rats. Results For the 14h/28dCRS group, including male and female rats, the movement time and central activity time were reduced, sugar consumption index were decreased, novelty exploration time and frequency were reduced, latency were increased, numbers of nose pokes were reduced, and thes

8、e results were significantly different compared with the control group. There were individual indicators that showed significantly difference for all the above-mentioned behavioral tests of the 10h/28dCRS group. 14h/28d CRS male group in syrup consumption index decreased significantly, the correspon

9、ding female rats did not significantly reduce. 10h/28dCRS male group in the central motion time less than that of the control group, and latency was prolonged and exploration time was shortened, while the corresponding female rats had no significant difference. Conclusion 14h/28dCRS rats in the sucr

10、ose preference test, open-field test,novel object test were exhibited depressive-like behavior, but 10h/28dCRS male rats showed a trend of depressive-like behavior. Chronic restraint stress was more likely to lead to depressive-like behavior in male rats.Key wordsChronic restraint stress; Depressive

11、-like behavior; Restraint duration; Sprague-Dawley rats抑郁癥是一種常見的精神疾病，患者常表現(xiàn)出情緒低落、消極、悲觀、內(nèi)疚、注意力不集中、對事物失去興趣、睡眠和飲食障礙等特點，嚴重者甚至會產(chǎn)生自殺的想法1。據(jù)世界衛(wèi)生組織報道，19902013年期間，患有抑郁癥和/或焦慮的人數(shù)上升了近50%，目前全球約共有3.5億名抑郁癥患者。抑郁癥是世界各地的首要致殘原因，2030年抑郁癥將成為導致全球疾病負擔的一個重大因素2。抑郁癥具有的高發(fā)病率、高復發(fā)率、高致殘/死亡率等特點，嚴重威脅著人類的健康。如何利用動物模擬人類抑郁癥狀，對于研究抑郁癥發(fā)病機制和

12、抗抑郁藥物至關重要。慢性應激在抑郁癥發(fā)展中起著重要的作用3，通過動物對應激的反應建立抑郁動物模型是動物建模的原則之一4，本文即通過慢性束縛應激（Chronic restraint stress，CRS）的方法模擬抑郁樣行為，并考察慢性束縛應激模型中不同的束縛時長和不同性別所致大鼠抑郁樣行為的差異，以期為CRS模型中實驗動物的性別和束縛時長的選擇提供依據(jù)。1材料和方法1.1材料1.1.1實驗儀器 大鼠行為束縛器（自制）、大鼠自主活動實驗實時檢測系統(tǒng)（中國航天員中心和中國醫(yī)學科學院藥用植物研究所聯(lián)合研制）。1.1.2實驗動物清潔級Sprague-Dawley 大鼠，80只，雌雄各40只，體重：雌性

13、120140g，雄性140160g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號：【SCXK(京)2012-0001】。動物飼養(yǎng)于中國醫(yī)學科學院藥用植物研究所的屏障環(huán)境【SYXK(京)2013-0023】，12h照明/12h黑暗（照明：8:0020:00），飼養(yǎng)期間給予動物標準飼料和潔凈飲水。本動物實驗遵守國際實驗動物倫理學要求。1.2方法1.2.1實驗動物分組大鼠隨機各分為4組，每組雌雄大鼠各10只，分別為10h/28d C（Control，對照組）、10h/28d CRS （Chronic restraint stress，CRS，慢性束縛應激組）、14h/28d C、14h/28d C

14、RS。1.2.2慢性束縛應激模型的建立5-6將CRS組大鼠置于聚酯透明材料所制的圓柱形束縛器內(nèi)進行造模，隨時觀察動物行為狀態(tài)。束縛器長度為1016cm（可根據(jù)動物體積調(diào)節(jié)），內(nèi)徑為6cm，周身有多個直徑為1cm的通氣孔。10h/28d CRS組每天束縛10 h(8:0018:00)，14h/28d CRS組每天束縛14h(8:0022:00)。束縛應激期間C組與CRS組均禁食禁水，束縛應激結(jié)束后CRS組大鼠撤除束縛器，各組都恢復飲食飲水。連續(xù)束縛應激28d。1.2.3體重檢測分別于第8、15、22、29、36、43、50 d稱量大鼠的體重。1.2.4 糖水偏愛實驗7-8 糖水偏愛實驗分為訓練期

15、和測試期。訓練期使動物適應糖水，測試期進行動物的糖水/純水消耗實驗，用糖水偏愛指數(shù)（糖水偏愛指數(shù)= 糖水消耗/ 總液體消耗100 %)評價動物對糖水的偏愛程度。在束縛應激前先進行糖水偏愛基線測試，即進行2d的糖水適應，再禁食禁水1d后，檢測每只大鼠在1h內(nèi)的糖水/純水的消耗量，并計算其糖水偏愛指數(shù)。束縛應激28d后，再做一次糖水偏愛實驗，比較束縛應激前后大鼠的糖水偏愛指數(shù)的差異，以評價CRS各組動物的抑郁樣行為表現(xiàn)。1.2.5 自主活動實驗9-10利用大鼠自主活動實驗實時檢測系統(tǒng)進行實驗。自主活動測試箱為黑色不銹鋼材料制成的圓柱形桶，測試箱頂部敞開。采用圖像采集系統(tǒng)對測試大鼠的行為進行實時監(jiān)測

16、，再通過計算機系統(tǒng)對大鼠的自主活動信息進行數(shù)據(jù)處理。檢測時將大鼠面壁放入測試箱內(nèi)，適應環(huán)境3min后進行自主活動檢測，檢測時長為10min，檢測時保持環(huán)境安靜。1.2.6 新奇事物實驗11-12于自主活動實驗次日將大鼠放入自主活動測試箱中測試。測試前在測試箱中央放入一個藍色的圓柱體新奇事物。實驗時將大鼠面向測試箱壁放入，并記錄10min內(nèi)首次探索新奇事物的時間（即潛伏期，10min內(nèi)無探索行為，則潛伏期時間記為10min）、探索次數(shù)以及探索時間。1.2.7 統(tǒng)計學處理采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析，結(jié)果以 s表示，組內(nèi)比較采用t-test方法，各組間比較采用單因素方差分析（AN

17、OVA）的方法。2實驗結(jié)果2.1慢性束縛應激對于大鼠體重的改變?nèi)绫?所示，與對照組比較，從第15d開始，14h/28d CRS組雌性和雄性大鼠的體重均顯著下降(P0.01)。而10h/28d CRS組雌雄性大鼠與對照組相比，體重無顯著性差異。表1慢性束縛應激對大鼠體重的影響(n=10, s)Tab.1 The effect of chronic restraint on body weight of male and female rats組別group雄性Male 雌性Female10h/28d C10h/28d對照組10h/28d CRS10h/28d束縛組14h/28d C14h/28d

18、對照組14h/28d CRS14h/28d束縛組10h/28d C10h/28d對照組10h/28d CRS10h/28d束縛組14h/28d C14h/28d對照組14h/28d CRS14h/28d束縛組第8天Day-82339220122208215131585155815911581第15天Day-1526411234142591022715*2007167919421711*第22天Day-2228812244153001523018*2118187720721801*第29天Day-2933314265133211923220*2228190421521871*第36天Day-36

19、35714289143402322914*23151951222331682*第43天Day-4336115301163502623619*237820011227317013*第50天Day-5037717311153672925624*2404203923041943* 注：與對照組相比, *P0.05 ,*P0.01. Note: Compared with control group,*P 0.05, *P0.012.2慢性束縛應激對大鼠糖水偏愛指數(shù)的影響如表2所示，第1d糖水基線測試表明CRS組雌雄性大鼠各組間的糖水偏愛指數(shù)無差異。與糖水基線比較，14h/28dCRS雄性組糖水偏愛指

20、數(shù)水平明顯下降(P0.01)，而對照組無明顯差異。與對照組相比，14h/28d CRS雄性組的糖水偏愛指數(shù)及差值極顯著低于對照組 (P0.01)。與糖水基線比較，14h/28dCRS雌性組糖水偏愛指數(shù)水平明顯下降(P0.05)，而對照組無明顯差異。與對照組相比，14h/28d CRS組的糖水偏愛指數(shù)差值極顯著低于對照組 (P0.01)。10h/28dCRS組雌雄大鼠與自身糖水基線及對照組相比，均沒有顯著性差異。表2慢性束縛對大鼠糖水偏愛指數(shù)的影響(n=10, s)Tab.2 The effect of chronic restraint on the sucrose consumption i

21、ndex of male and female rats組別group糖水偏愛指數(shù)Sucrose consumption index(%)雄性Male 雌性Female第1天（基線）Day-1(baseline)第29天Day-29差值Difference第1天（基線）Day-1(baseline)第29天Day-29差值Difference10h/28d C10h/28d對照組75.416.877.418.93.18.478.94.680.25.25.172.410h/28d CRS10h/28d束縛組76.720.175.05.14.24.280.14.376.96.83.96.014h/

22、28d C14h/28d對照組77.119.374.420.22.37.986.62.484.71.42.15.014h/28d CRS14h/28d束縛組73.111.457.93.9*&14.15.3*81.41.474.12.6&9.25.4*注：與對照組相比, *P0.05, *P0.01. Note: Compared with control group,*P0.05, *P0.01與糖水基線比較, &P0.05, &P0.01.Note: Compared with the baseline ,&P0.05, &P0.01.2.3 慢性束縛應激對大鼠自主活動的影響如表3所示，與對

23、照組相比，14h/28dCRS組雄性大鼠的運動路程、運動時間、中央運動時間均極顯著減少(均P0.01)，靜息時間顯著增加(P0.05)。同樣，與對照組相比，14h/28dCRS組雌性大鼠CRS組的運動路程、運動時間、中央運動時間以及外周運動時間均極顯著減少(均P0.01)，靜息時間顯著增加(P0.01)。10h/28dCRS雄性組大鼠除在中央?yún)^(qū)運動時間比對照組少(P0.05)，其他指標無顯著差異。10h/28dCRS雌性組的模型和對照組相比各指標均無顯著性差異。表3慢性束縛對大鼠自主活動的影響(n=10, s)Tab.3 The effect of chronic restraint on b

24、ehavior of male and female rats in the Open-field test組別group運動路程 Movement distance(cm)運動時間 Movement time(s)靜息時間Resting time(s)中央運動時間Central movement time(s)外周運動時間Surrounding movement time(s)雄性Male 10h/28d C10h/28d對照組5045558289692889711330111410h/28d CRS10h/28d束縛組48768872778926910257*2765914h/28d C1

25、4h/28d對照組56581302334772657735192285614h/28d CRS14h/28d束縛組40731086*247109*352109*86 *212100雌性Female10h/28d C10h/28d對照組55643432988265533372431110h/28d CRS10h/28d束縛組587632232125288342262552114h/28d C14h/28d對照組60611993571024210415240514h/28d CRS14h/28d束縛組4752205*27314*32614*174*2235*注：與對照組相比, *P0.05, *P

26、0.01. Note: Compared with control group, *P 0.05, *P0.012.4 慢性束縛應激對大鼠新奇事物探索行為的影響如表4所示，14h/28dCRS組的雌雄性大鼠與對照組相比，潛伏期顯著升高(P0.01)，探索次數(shù)、探索時間明顯下降(P0.01)。14h/28dCRS雌性組的探索時間明顯比對應雄性組長(P0.05)，而14h/28dC雌性對照組的探索時間明顯比對應的雄性組短(P0.05)。10h/28dCRS雄性組大鼠的潛伏期顯著增長(P0.05)，探索時間明顯減短(P0.05)。10h/28dCRS雌性組大鼠僅潛伏期顯著增長(P0.05)，探索次數(shù)

27、及探索時間和對照組相比則無明顯變化。表4 慢性束縛應激對大鼠在新奇事物實驗中探索行為的影響(n=10, s)Tab.4 The effect of chronic restraint on explore behavior of male and female rats in the Novel Object test.組別group雄性Male 雌性Female10h/28d C10h/28d對照組10h/28d CRS10h/28d束縛組14h/28d C14h/28d對照組14h/28d CRS14h/28d束縛組10h/28d C10h/28d對照組10h/28d CRS10h/28d

28、束縛組14h/28d C14h/28d對照組14h/28d CRS14h/28d束縛組潛伏期latency(s)79.297.1285.271.3 *52.474.6293.3199.1* *78.133.2132.956.2*91.237.3102.288.0*探索次數(shù)Number of exploration(n)11.34.08.93.112.36.71.71.7* *5.50.96.23.18.51.63.60.9*探索時間Explore time(s)21.811.18.14.3*65.556.355.2* *27.110.220.64.332.67.1#16.845.6#*注：與對

29、照組相比, *P0.05 ,*P0.01. Note: Compared with control group, *P0.05, *P0.01；與對應雄性組相比, #P0.05, #P0.01. Note:Compared with the corresponding male group, #P0.05, #P0.01.3 討論慢性束縛應激（Chronic restraint stress，CRS）作為一種非損傷性刺激，能有效地引起典型的非特異性應激反應，且與人類身心性疾病的致病過程有相似性13-14，是目前應用最廣泛的一種抑郁癥動物模型15，對于抑郁癥的病理生理研究具有重要意義。研究報道，

30、慢性應激抑郁模型會導致動物體重下降16-17，本研究中14h/28dCRS組雌雄大鼠與相應對照組比較體重顯著下降，而10h/28dCRS組大鼠無顯著性差異?？請鲎钤缬蒆all18設計而用于研究大鼠的情緒反應。一般認為抑郁動物的活動度減少，在陌生的環(huán)境里會減少對中央?yún)^(qū)域的探索。實驗中14h/28dCRS組雌雄大鼠運動路程和時間、中央?yún)^(qū)活動路程和時間等指標顯著減少，表明其對新奇環(huán)境好感度降低，表現(xiàn)出抑郁癥的特征。10h/28dCRS僅雄性組在中央?yún)^(qū)運動時間減少。機體獎賞系統(tǒng)的閾值增加，快感缺失為抑郁癥的一個主要的癥狀19，糖水偏愛實驗則是目前使用最為廣泛的一個用于評價快感缺失的動物行為學測試方法2

31、0，實驗中14h/28dCRS組動物糖水偏愛指數(shù)顯著降低表明其具有快感缺失的抑郁樣行為，而10h/28dCRS組雌雄大鼠與自身糖水基線及對照組相比均無顯著性差異。新奇事物實驗是研究動物自發(fā)探索行為的一種方法。動物在已熟悉的空場環(huán)境中面臨新奇事物時，產(chǎn)生既對新事物好奇又對新事物恐怖的矛盾沖突，出現(xiàn)接近-回避的沖突行為21。一般認為，抑郁動物在新奇事物實驗中的探索行為減少22，實驗中14h/28dCRS組的雌雄性大鼠與對照組相比探索次數(shù)、探索時間明顯下降，潛伏期時長顯著增多，表明動物對新奇環(huán)境的探究能力下降，其對事物失去興趣。10h/28dCRS組僅雄性大鼠的潛伏期明顯延長，探索時間縮短。有文獻報

32、道慢性應激刺激更易致雄性大鼠產(chǎn)生抑郁樣行為23-24，但也有文獻認為雌性大鼠對慢性應激更敏感25，同時還有文獻報道慢性應激對不同性別的大鼠所致的抑郁樣行為沒有差異26-27。而這些研究結(jié)果的矛盾可能是由于實驗中采用了不同的動物品系、應激手段和應激強度導致的，還需大量的實驗研究以促使應激模型的標準化。在本實驗雌雄鼠對比中，發(fā)現(xiàn)與對照組相比，14h/28d CRS雄性組的糖水偏愛指數(shù)及差值極顯著低于對照組 (P0.01)，而雌性組僅糖水偏愛指數(shù)差值極顯著低于對照組 (P0.01)。10h/28dCRS雄性組在中央?yún)^(qū)運動時間比對照組少(P0.05)，而對應雌性組各指標均無顯著性差異。10h/28dC

33、RS組雄性大鼠的潛伏期顯著延長(P0.05)，探索時間明顯縮短(P0.05)，而對應的雌性組大鼠僅潛伏期顯著延長(P0.05)。這提示雄鼠可能對CRS更為敏感，更易表現(xiàn)出抑郁樣行為。 綜上，10h/28dCRS組雌雄大鼠與對照組相比，上述各實驗的結(jié)果僅有少數(shù)指標表現(xiàn)出顯著性差異，可能是由于束縛強度較弱，所以僅表現(xiàn)出一定的抑郁樣行為的趨勢。且10h/28dCRS組雌雄大鼠表現(xiàn)出一定的性別差異，雌性鼠對應激的的耐受力更強，CRS更易致雄性大鼠產(chǎn)生抑郁樣行為。而14h/28dCRS組能顯著表現(xiàn)出穩(wěn)定的抑郁樣行為，性別差異對其無影響。因此，采用連續(xù)28天、每天束縛14h建立的抑郁癥動物模型是一種更穩(wěn)定

34、、更有效的抑郁模型。參考文獻1 郭雨欣,邢國剛.抑郁癥的生物學機制研究進展J.中國神經(jīng)精神病雜志,2012,38( 1) : 57.2 J.P. Lpine, M. Briley, The increasing burden of depressionJ.Neuropsychiatr.Dis. Treat. 2011: 3-7.3 Hill M N, Hellemans K G C, Verma P, et al. Neurobiology of chronic mild stress: Parallels to major depressionJ. Neuroscience & Biobeh

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