發(fā)酵工程下游工程技術(shù)知識點

1、第十二章 發(fā)酵工程下游工程技術(shù)第一節(jié) 發(fā)酵液的預(yù)處理與固-液分別概述發(fā)酵產(chǎn)物的提取與精制屬于發(fā)酵工程的下游加工技術(shù)。上游加工下游加工下游加工亦稱發(fā)酵后處理，是指從發(fā)酵液或酶反響中分別純化目的產(chǎn)物并加工成成品的過程。在多數(shù)狀況下是從稀的發(fā)酵液中回收目的產(chǎn)物，整個過程有多項單元操作組成，其中有很多是經(jīng)典的化工單元操作。一、下游加工過程的重要性獲得商業(yè)產(chǎn)品的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。促進發(fā)酵工程上游加工技術(shù)或工藝的改進。擁有市場競爭力的重要保證。二、下游加工過程的特點發(fā)酵液是簡單的多相系統(tǒng)，屬非牛頓液體，從中分別所需產(chǎn)品困難大。發(fā)酵產(chǎn)品在培育液中具有濃度低，穩(wěn)定性差，對酸堿等外界環(huán)境格外敏感，簡潔失活。下游加工過程

2、代價昂貴，產(chǎn)品回收率不是很高。發(fā)酵過程簡單，要求下游加工工藝應(yīng)具有相當(dāng)?shù)倪m應(yīng)性，以確保最終產(chǎn)品的純度和質(zhì)量。三、下游加工的原則和要求原則： 1短時間內(nèi)處理分別時盡量低溫選擇生物物質(zhì)穩(wěn)定的 pH要程序化進展清洗，消毒，包括廠房，設(shè)備，管路要求：1到達所需的純度本錢要低，得率高工藝過程要簡便，對分別物質(zhì)特性清楚廢棄物要易處理，能夠做到綜合利用零排放；清潔生產(chǎn)試驗室產(chǎn)品能夠放大生產(chǎn)四、下游加工工程的一般流程粗分別階段發(fā)酵液的預(yù)處理和固-液分別。產(chǎn)物的初分別。純化精制階段產(chǎn)物的高度純化。成品加工。發(fā)酵液的預(yù)處理與固-液分別一、發(fā)酵液的一般特征含水量高，一般可達 9099%，處理體積大。產(chǎn)品濃度低。懸浮

3、物顆粒小，密度與液體相差不大。固體粒子可壓縮性大，一壓縮就變形。液體黏度大，大多為非牛頓型流體。易吸附在濾布上。產(chǎn)物性質(zhì)不穩(wěn)定，不耐熱、酸堿敏感、易被氧化、易被微生物污染及酶分解。二、發(fā)酵液預(yù)處理的目的和要求預(yù)處理的目的轉(zhuǎn)變發(fā)酵液的物理性質(zhì)，促進懸浮液中分別固形物的速度，提高固液分別器的效率；盡可能使產(chǎn)物轉(zhuǎn)入便于后處理的某一相中多數(shù)是液體；去除發(fā)酵液中局部雜質(zhì)，以利于后續(xù)各步操作。發(fā)酵液預(yù)處理的要求:菌體的分別固體懸浮物的去除蛋白質(zhì)的去除重金屬離子的去除色素、熱原質(zhì)、毒性物質(zhì)等有機雜質(zhì)的去除轉(zhuǎn)變發(fā)酵液的性質(zhì)調(diào)整適宜 pH 值和溫度三、發(fā)酵液預(yù)處理的方法降低液體的黏度絮凝法重力法等電點法參加助濾

4、劑參加反響劑1 降低液體黏度加水稀釋法承受加水稀釋法雖然能降低液體黏度，但是會增加發(fā)酵液的體積，因此加大后續(xù)過程的處理量。稀釋后過濾速率提高的百分比必需大于加水比才算真正有效，即假設(shè)加水一倍，則稀釋后液體的黏度必需下降 50%以上，才能有效提高過濾效率。加熱法上升溫度可以降低懸浮液的黏度，除去某些雜蛋白，降低懸浮物的最終體積，破壞凝膠狀構(gòu)造、增加濾餅的空隙度，提高過濾效率。不適用熱敏性的物質(zhì)，而且要防止加熱導(dǎo)致細胞溶解，胞內(nèi)物質(zhì)外溢。添加酶制劑 比方：加酶將多糖轉(zhuǎn)化為單糖分散和絮凝法分散和絮凝的概念:分散是在高價無機鹽作用下，由于雙電層排斥電位的降低，而使膠體體系不穩(wěn)定的現(xiàn)象。絮凝是指在某些高

5、分子絮凝劑存在下，基于架橋作用，使膠粒形成粗大的絮凝團的過程，是一種以物理的集合為主的過程。(集中雙電層的構(gòu)造模型圖分散原理：電解質(zhì)將膠體粒子外表上的電荷中和，削減存在于膠體粒子間的靜電斥力，使范德華力占優(yōu)勢，這樣膠體就會分散成較大、較密實的粒子。常用的分散方法：在稀溶液中參加電解質(zhì)以促進分散。試劑包括酸、堿、簡潔電解質(zhì)和合成的高分子電解質(zhì)。常用的分散劑Al2(SO4)3.18H2O，AlCl3.6H2O，F(xiàn)eCl3，ZnSO4，MgCl2陽離子對負電荷的膠粒分散力量次序為：Al3+Fe3+H+Ca2+Mg2+K+Na+Li+絮凝原理：在某些高分子絮凝劑存在下，基于架橋作用，使膠粒形成粗大的絮

6、凝團使之更簡潔過濾。絮凝劑通過靜電引力、范德華引力或氫鍵的作用，猛烈地吸附在膠粒的外表。當(dāng)一個高分子聚合物的很多鏈節(jié)分別吸附在不同的膠粒外表上，產(chǎn)生橋架連接時，就形成了較大的絮團，這就是絮凝作用。絮凝劑是一種能溶于水的高分子聚合物，其相對分子質(zhì)量可高達數(shù)萬至一千萬以上，長鏈狀構(gòu)造，其鏈節(jié)上含有很多活性官能團，包括帶電荷的陰離子如-COOH或陽離子如-NH2 基團以及不帶電荷的非離子型基團。常用的絮凝劑：明膠、甲基纖維素、多聚丙烯酸、聚胺衍生物、氯化鈣、磷酸氫二鈉影響絮凝的因素：絮凝劑的添加量；發(fā)酵液的 pH；絮凝劑的分子量；攪拌轉(zhuǎn)速；攪拌時間重力法在工業(yè)上用的較多的主要是離心和過濾。過濾常用板

7、框真空吸濾或電動篩等，離心和過濾能否順當(dāng)進展取決于很多因素。一般溫度高，壓力大，發(fā)酵液粘度小，濾布選用適當(dāng)，助溶劑適宜， 攪拌都可以提高過濾速度。4、等電點法蛋白質(zhì)一般以膠體狀態(tài)存在于發(fā)酵液中。膠體粒子的穩(wěn)定性和其所帶電荷有關(guān)。蛋白質(zhì)在某一 pH 下，凈電荷為零，溶解度最小，稱為等電點。因此可利用此特性分別或去除良性物質(zhì)。羧基的電離度比氨基大，故蛋白質(zhì)的酸性性質(zhì)通常強于堿性，因而很多蛋白質(zhì)的等電點都在酸性范圍內(nèi)pH 4.05.5。5、添加助濾劑：一般為惰性助濾劑：是一種顆粒均勻、質(zhì)地堅硬、不行壓縮的粒狀物質(zhì)作用：助濾劑外表具有吸附膠體的力量，并且由此助濾劑顆粒形成的濾餅具有格子型構(gòu)造，不行壓縮

8、，濾孔不會被全部堵塞，可以保持良好的滲透性使用方法1：在濾布上預(yù)涂，作為過濾介質(zhì)使用2：按肯定比例混入待濾的懸浮液中常用的助濾劑：硅藻土、膨脹珍寶巖、石棉、纖維素、未活化的碳、爐渣、重質(zhì)碳酸鈣6、添加反響劑：添加可溶解的鹽類，生成不溶解的沉淀。固-液分別過程及設(shè)備簡介目的：收集胞內(nèi)產(chǎn)物的細胞或菌體，分別除去液相，或者是收集含生化物質(zhì)的液相，分別除去固體懸浮物，如細胞、菌體、細胞碎片、蛋白質(zhì)的沉淀物和它們的絮凝體等。意義：固-液分別過程下游加工的重要環(huán)節(jié)，用于發(fā)酵液的預(yù)處理和生物產(chǎn)品的純化、精制等環(huán)節(jié)。方法：常用的方法有過濾、離心。此外還有膜分別、雙水相萃取和擴張床吸附等方法。影響發(fā)酵液固-液分

9、別的主要因素：菌體的大小、外形及發(fā)酵液的黏度，還有發(fā)酵液的溫度、pH 值、加熱時間等。1. 過濾定義：用過濾介質(zhì)將懸液中的固形顆粒與液體分別的過程。常用的過濾方式：加壓過濾和真空過濾典型設(shè)備主要有：板框壓濾機和鼓式真空過濾機2、離心定義：基于固體顆粒和四周液體密度存在差異，在離心場中使不同密度的固體顆粒加速沉降的分別過程。離心分別方法：差速離心工業(yè)上最常用的離心分別方法定義：在密度均一的介質(zhì)中由低速到高速逐級離心，用于分別不同大小的細胞和細胞器。對象：混合樣品中各沉降系數(shù)差異較大的組分。密度梯度離心多用于生化爭辯原理：用肯定的介質(zhì)在離心管內(nèi)形成一連續(xù)或不連續(xù)的密度梯度，將細胞混懸液或勻漿置于介

10、質(zhì)的頂部，通過重力或離心力場的作用使細胞分層、分別。分類：1移動區(qū)帶離心2等密度離心常用密度梯度物質(zhì)：蔗糖、甘油、CsCl、NaBr 1移動區(qū)帶離心含幾個組分的樣品在足夠高的離心場中離心時，每種顆粒都到達其最大沉降速度，這時樣品開頭分別。離心管的上層漸漸形成透亮的上清液，并形成對應(yīng)于樣品各組分的一系列濃度界面， 界面的移動相對于每種組分來說是特征的。用于分別密度相近而大小不等的細胞或細胞器。此法所承受的介質(zhì)密度較低，介質(zhì)的最大密度應(yīng)小于被分別生物顆粒的最小密度。2等密度離心細胞或細胞器在連續(xù)梯度的介質(zhì)中經(jīng)足夠大離心力和夠長時間則沉降或漂移到與自身密度相等的介質(zhì)處，并停留在該層到達平衡，從而將不

11、同密度的細胞或細胞器分別。離心機分類：離心分別1優(yōu)點：分別速度快，效率高，操作時衛(wèi)生條件好等優(yōu)點，適合于大規(guī)模的分別過程。2缺點：投資費用高，能耗較大。3.其他固-液分別方法膜分別：利用不同組分通過膜的傳遞速度不同而得以分別的方法。雙水相萃?。豪貌煌M分在雙水相安排系數(shù)不同進展分別方法。擴張床吸附：將固-液分別合目的產(chǎn)物吸附合并成一步進展的一種分別方法。影響固液分別的因素：1、微生物種類真菌的菌體大，固液分別簡潔，可承受真空轉(zhuǎn)鼓式過濾或板框過濾； 細菌和細胞碎片小，固液分別較難，固液分別前要進展預(yù)處理。2、發(fā)酵液黏度固液分別速度與黏度成反比。3、其它因素培育基組成、發(fā)酵周期、發(fā)酵液的 pH

12、值、溫度和加熱時間等其次節(jié)下游提純過程微生物細胞的裂開微生物的代謝產(chǎn)物假設(shè)是胞內(nèi)物質(zhì)如有些酶制劑、干擾素、胰島素等，那么首先要收集菌體，進展細胞裂開。微生物細胞壁的組成與構(gòu)造：細菌細胞壁：酵母菌細胞壁比 G+菌稍厚，主要成分是葡聚糖、甘露聚糖和蛋白質(zhì)等。其他真菌細胞壁主要由多糖組成，如幾丁質(zhì)或纖維素強度比細菌和酵母菌高。常用的細胞裂開方法細胞裂開的方法很多，依據(jù)外加作用力的方式可分為機械法和非機械法兩大類。亦可按所用方法的屬性分為物理法、化學(xué)法和生物法三類。物理裂開法：高壓勻漿法、擠壓法、高速珠磨法、超聲波法； 化學(xué)裂開法：滲透沖擊法、增溶法。生物裂開法：酶溶法。物理裂開法 高壓勻漿法大規(guī)模細

13、胞裂開的常用方法原理：利用高壓使細胞懸浮液通過針形閥，由于突然減壓和高速沖擊撞擊環(huán)使細胞裂開。適用范圍：適用于酵母菌、大腸桿菌、巨大芽孢桿菌和黑曲霉等。不適用于高度分枝的微生物。特點：在操作方式上，可以承受單次通過勻漿器或?qū)掖窝h(huán)通過等方式，也可連續(xù)操作。 擠壓法X-press 法將濃縮的菌體懸浮液冷卻至-25至-30形成冰晶體，利用 500 MPa 以上的高壓沖擊，冷凍細胞從高壓閥小孔中擠出訪之裂開。原理：細胞裂開是由于冰晶體在受壓時的相變，包埋在冰中的細胞變形所引起的。主要用于試驗室中。優(yōu)點：適用的范圍廣、裂開率高、細胞碎片的粉碎程度低以及活性的保存率高。缺點：對冷凍-融解敏感的生化物質(zhì)不

14、適用。 高速珠磨法原理：進入珠磨機的細胞懸浮液與極細的玻璃小珠、石英砂、氧化鋁等研磨劑直徑小于 1mm 一起快速攪拌或研磨，研磨劑、珠子與細胞之間的相互剪切、碰撞，使細胞裂開，釋放出內(nèi)含物。缺點：裂開中產(chǎn)生的熱量，需承受冷卻措施。優(yōu)點：可連續(xù)操作 超聲波裂開法超聲波裂開也是應(yīng)用較多的一種裂開方法。通常承受的超聲波裂開機在 15-25 千赫kHz的頻率下操作。原理：在超聲波作用下液體發(fā)生空化作用，空化泡的急劇膨脹壓縮和內(nèi)向爆破產(chǎn)生沖擊彈性波， 將聲能轉(zhuǎn)化為機械能，形成粘性消散渦流，假設(shè)液體旋渦小于細胞尺寸，產(chǎn)生不同密度移動， 當(dāng)細胞的動能超過細胞壁強度時，至使細胞裂開。特點：桿菌比球菌易裂開，革

15、蘭氏陰性菌細胞比革蘭氏陽性菌易裂開，酵母茵效果較差。菌體濃度太高或介質(zhì)黏度高，均不利于超聲波裂開。最大問題是在超聲過程中聲波被溶液吸取產(chǎn)生大量熱量，不能準(zhǔn)時將熱量移出，細胞懸浮液的溫度急劇上升，導(dǎo)致酶和其它生物活性物質(zhì)變性失活。因此，在試驗室中往往實行連續(xù)裂開的方法，即經(jīng)短時間裂開，冷卻降溫，再進展裂開，經(jīng)屢次反復(fù)到達裂開目的。因此在細胞裂開過程中，有效冷卻是關(guān)鍵。也因大容量容器的聲波傳遞和散熱困難，限制了超聲裂開的大規(guī)模應(yīng)用?；瘜W(xué)裂開法定義：利用化學(xué)試劑轉(zhuǎn)變細胞壁或膜的構(gòu)造或完全破除細胞壁形成原生質(zhì)體后，在滲透壓作用下使細胞膜裂開而釋放胞內(nèi)物質(zhì)的方法。優(yōu)點：對產(chǎn)物的釋出選擇性好，細胞外形較完

16、整、碎片少、核酸等胞內(nèi)雜質(zhì)釋放少，便于后步分別等優(yōu)點，故使用較多。缺點：簡潔引起活性物質(zhì)失活破壞；化學(xué)試劑的參加，常會給隨后產(chǎn)物的純化帶來困難，并影響最終產(chǎn)物純度。 滲透壓沖擊原理：將細胞放在高滲透壓的介質(zhì)中如肯定濃度的甘油或蔗糖溶液，到達平衡后，轉(zhuǎn)入到滲透壓低的緩沖液或純水中，介質(zhì)被突然稀釋，或者將細胞轉(zhuǎn)入水或緩沖液中，由于滲透壓的突然變化，水快速進入細胞內(nèi)，引起細胞壁的裂開。特點：較溫存的一種裂開方法，操作也簡潔。應(yīng)用：僅對細胞壁較脆弱的菌，或者細胞壁預(yù)先用酶處理，或合成受抑制而強度減弱時才是適宜的。 增溶法:原理：利用某些化學(xué)試劑如有外表活性劑等，增加細胞壁或膜的通透性，而使細胞裂開的方

17、法。該法取決于化學(xué)試劑的類型以及細胞壁膜的構(gòu)造與組成。常用的外表活性劑有 SDS、EDTA、Triton X-100，有機溶劑有甲苯、乙醇、異丙醇、鹽酸胍和尿素?；瘜W(xué)滲透法優(yōu)點：對產(chǎn)物釋放有肯定的選擇性，可使一些較小分子量的溶質(zhì)如多肽和小分子的酶蛋白透過，而核酸等大分子量的物質(zhì)仍滯留在胞內(nèi)；細胞外形完整，碎片少，漿液粘度低，易于固液分別和進一步提取。缺點：通用性差；時間長，效率低；有些化學(xué)試劑有毒 。生物裂開法常用的生物裂開法主要是酶溶法。利用生物酶分解破壞細胞壁上特別的鍵，從而到達破壁的目的。酶溶法的優(yōu)點：選擇性釋放產(chǎn)物，條件溫存，核酸泄出量少，細胞外形完整。缺點：溶酶價格高，溶酶法通用性差

18、不同菌種需選擇不同的酶，產(chǎn)物抑制的存在。溶菌酶是應(yīng)用最多的酶，它能專一地分解細胞壁上糖蛋白分子的-1, 4 糖苷鍵，使脂多糖解離， 經(jīng)溶菌酶處理后的細胞移至低滲溶液中使細胞裂開。利用溶解細胞壁的酶處理菌體細胞，使細胞壁受到局部或完全破壞后，再利用滲透壓沖擊等方法破壞細胞膜，進一步增大胞內(nèi)產(chǎn)物的通透性。利用溶酶系統(tǒng)處理細胞時必需依據(jù)細胞壁的構(gòu)造和化學(xué)組成選擇適當(dāng)?shù)拿福⒋_定相應(yīng)的次序。酶溶法的優(yōu)點：選擇性釋放產(chǎn)物，條件溫存，核酸泄出量少，細胞外形完整。酶溶法的缺點：溶酶價格高，溶酶法通用性差，產(chǎn)物抑制的存在。濃縮技術(shù)濃縮過程是發(fā)酵工業(yè)提取與精制過程常用的單元操作。濃縮的目的是將低溶質(zhì)濃度的溶液通

19、過除去溶質(zhì)變?yōu)楦呷苜|(zhì)濃度的溶液。它廣泛用于有機酸、氨基酸、核苷酸、酶制劑及抗生素等發(fā)酵工業(yè)產(chǎn)品的提取分別過程。常用的濃縮技術(shù)有蒸發(fā)濃縮法、冷凍枯燥法、吸取濃縮法。1蒸發(fā)濃縮法蒸發(fā)濃縮法概念及原理蒸發(fā)是工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)過程中常用的發(fā)酵產(chǎn)品濃縮方法之一。蒸發(fā)的目的是使溶液中的溶劑在肯定的溫度和壓力下加熱后汽化除去，從而提高溶液中溶質(zhì)的濃度。這里所指的溶液是由不揮發(fā)的溶質(zhì)與液體溶劑所組成，蒸發(fā)過程只有溶劑汽化而溶質(zhì)不汽化。蒸發(fā)濃縮裝置的設(shè)計蒸發(fā)是溶液外表的溶劑分子獲得的動能超過了溶液內(nèi)溶劑分子間的吸引力脫離液面進入空間 的過程。蒸發(fā)快慢與溫度、蒸發(fā)面積及液面蒸汽分子密度等因素有關(guān)。因此，蒸發(fā)濃縮裝置常依

20、據(jù)加熱、擴大液體外表積、減壓、和加速空氣流淌等因素而設(shè)計蒸發(fā)濃縮裝置的分類常用的蒸發(fā)濃縮過程可分為常壓蒸發(fā)濃縮和真空減壓蒸發(fā)濃縮過程。依據(jù)構(gòu)造型式不同，常壓蒸發(fā)設(shè)備有中心循環(huán)管式蒸發(fā)器、橫管式蒸發(fā)器、夾套式蒸發(fā)器、夾套帶攪拌外循環(huán)蒸發(fā)器、強制循環(huán)蒸發(fā)器等，真空減壓蒸發(fā)設(shè)備依據(jù)二次蒸氣的利用的狀況，可分為單效蒸發(fā)和多效蒸發(fā)。冷凍濃縮法冷凍濃縮法：是工業(yè)發(fā)酵中生物大分子和具有生理活性的發(fā)酵產(chǎn)品濃縮常用的一種有效方法。冷凍濃縮法原理：在冷凍時水分結(jié)成冰，鹽類及發(fā)酵產(chǎn)品不進入冰內(nèi)而留在冰外，濃縮時先將待濃縮的溶液冷凍使之變成固態(tài)，然后緩慢的融解，利用溶劑與溶質(zhì)熔點的差異而到達除去大局部溶劑的目的。如酶

21、制劑和蛋白質(zhì)。吸取濃縮法吸取濃縮法：是一種通過吸取劑直接吸取出去溶液中溶劑分子使溶液濃縮的方法。應(yīng)用吸取濃縮法時要求吸取劑不與溶液起化學(xué)反響，而且對大分子類的發(fā)酵產(chǎn)品不起吸取作用，易于溶液分開，吸取劑除去溶劑后能重復(fù)使用。沉淀技術(shù)沉淀定義：通過轉(zhuǎn)變條件或參加某種試劑，使發(fā)酵產(chǎn)物離開溶液，生成不溶性顆粒而沉降析出的過程。作用：濃縮作用大于純化作用，是初步分別的一種手段。優(yōu)點：沉淀法具有設(shè)備簡潔、本錢低、原料易得、收率高、濃縮倍數(shù)高和操作簡潔等優(yōu)點。缺點：過濾困難、產(chǎn)品質(zhì)量較低、需要重精制。鹽析原理：高濃度中性鹽存在下，使生物分子在水溶液中溶解的溶解度降低而產(chǎn)生沉淀的方法，多用于蛋白質(zhì)酶的分別。常

22、用的鹽類是硫酸銨。優(yōu)點：本錢低，不需要特別昂貴的設(shè)備。操作簡潔、安全。對很多生物活性物質(zhì)具有穩(wěn)定作用。等電點沉淀原理：利用兩性電解質(zhì)在低離子強度下，調(diào)整至等電點，可使各種兩性電解質(zhì)所帶凈電荷為零， 能大大降低其溶解度，形成沉淀。不同的兩性電解質(zhì)具有不同的等電點，從而將其分別開。優(yōu)點：操作簡潔，試劑消耗少，引入雜質(zhì)少。缺點: 不能完全沉淀析出，常與鹽析法、有機溶劑沉淀法或其他沉淀劑一起協(xié)作使用，以提高沉淀力量和分別效果。應(yīng)用：主要用于在分別純化流程中去除雜蛋白，而不用于沉淀目的物。等電點操作時要留意：溶液中離子的種類和濃度對生物分子等電點的影響。等電點四周的鹽溶作用。目的產(chǎn)物的不穩(wěn)定性。有機溶劑

23、沉淀定義：與水互溶的有機溶劑乙醇、丙酮等能使蛋白質(zhì)在水中的溶解度顯著降低。多用于生物小分子、多糖、核酸和蛋白質(zhì)等產(chǎn)品的提取。機理：降低溶液的介電常數(shù)，由于分子間的靜電引力和溶劑的介電常數(shù)成反比，參加有機溶劑， 蛋白質(zhì)分子間的引力增加，溶解度降低。常用有機溶劑：乙醇、甲醇、丙酮等。優(yōu)點：區(qū)分力量比鹽析法高，一種溶質(zhì)只在一個比較窄的有機溶劑范圍內(nèi)沉淀；沉淀不需脫鹽；有機溶劑密度低，與沉淀物密度差大，簡潔進展固液分別；有機溶劑簡潔蒸發(fā)，不會在成品中殘留，適用于食品、藥品的制備。缺點：簡潔引起蛋白質(zhì)變性失活，并且有機溶劑易燃、易爆，對安全要求較高。非離子型多聚物沉淀定義：水溶性的非離子多聚物如聚乙二醇

24、PEG、葡聚糖右旋糖酐硫酸鈉等，可用于沉淀分別蛋白質(zhì)尤其是不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)、DNA 和 RNA 等。應(yīng)用最多的是 PEG。機制：多聚物與有機溶劑相像，能降低水化度使蛋白質(zhì)沉淀；與大分子形成復(fù)合物，發(fā)生共沉淀作用等優(yōu)點：其操作條件溫存，不易引起生物大分子的變性，沉淀效能高，很少量的沉淀劑就可以使相當(dāng)多的生物大分子沉淀，且沉淀后的多聚物也簡潔除去，無毒、不行燃，對大多數(shù)蛋白質(zhì)有保護作用。應(yīng)用：廣泛用于蛋白質(zhì)、核酸、細菌和病毒等的分別純化。離子交換層析技術(shù)定義：利用離子交換劑上的可交換離子與四周介質(zhì)中被分別的各種離子間的親和力不同，經(jīng)過交換平衡到達分別的目的的一種柱層析法。在以離子交換劑為固定相，液體

25、為流淌相的系統(tǒng)中進展。優(yōu)點：靈敏度高，重復(fù)性、選擇性好，分析速度快等優(yōu)點，是當(dāng)前最常用的層析法之一。離子交換劑的組成構(gòu)造及其特性離子交換樹脂的外形構(gòu)造示意圖凝膠色譜技術(shù)凝膠過濾法又稱為分子篩層析，是利用凝膠的網(wǎng)狀構(gòu)造為固定相，依據(jù)分子大小進展分別的一種方法。凝膠過濾所用的介質(zhì)是由交聯(lián)葡萄糖、瓊脂糖或聚丙烯酰胺形成的凝膠珠。凝膠珠的內(nèi)部是多孔的網(wǎng)狀構(gòu)造。單個凝膠珠本身象“篩子”，不同類型凝膠的篩孔的大小不同。凝膠過濾層析過程示意圖典型的凝膠類型交聯(lián)葡聚糖凝膠：Sephadex 聚丙烯酰胺凝膠：Sephacryl瓊脂糖凝膠：Sepharose 和 Bio-Gel其它：有機凝膠 Sepharon，交

26、聯(lián)聚醚 Toyopeal，纖維素凝膠，改性剛性填料等。親和層析技術(shù)定義：利用生物分子物質(zhì)具有的特異的親和力而進展分別的一種層析技術(shù)。很多生物大分子具有與其構(gòu)造相對應(yīng)的特異分子可逆結(jié)合的特性，如抗原與抗體、酶與底物或抑制劑、激素與受體等，這種結(jié)合往往是特異的而且是可逆的，生物大分子間的這種結(jié)合力稱為親和力。親和層析的根本特點純化過程簡潔、快速，且分別效率高特別適用于分別純化一些含量低、穩(wěn)定性差的生物大分子純化倍數(shù)大，產(chǎn)物純度高必需針對某一分別對象制備專一的配基及尋求穩(wěn)定的層析條件價格相對較昂貴；在洗脫中，交聯(lián)在層析介質(zhì)上的配基可能脫落并進入產(chǎn)品中，從而造成不良影響，如抗體、染料等配基。選擇并制備

27、適宜的親和吸附劑是親和層析能否取得成功的關(guān)鍵之一。它包括基質(zhì)和配體的選擇、基質(zhì)的活化、配體與基質(zhì)的偶聯(lián)等。依據(jù)配體對待分別物質(zhì)的親和性的不同，可以將其分為兩類：特異性配體和通用性配體。 特異性配體一般是指只與單一或很少種類的蛋白質(zhì)等生物大分子結(jié)合的配體。如生物素和親和素、抗原和抗體、酶和它的抑制劑、激素受體等，它們結(jié)合都具有很高的特異性，用這些物質(zhì)作為配體都屬于特異性配體。配體的特異性是保證親和層析高區(qū)分率的重要因素。通用性配體一般是指特異性不是很強，能和某一類的蛋白質(zhì)等生物大分子結(jié)合的配體，如各種凝集素可以結(jié)合各種糖蛋白，核酸可以結(jié)合 RNA、結(jié)合 RNA 的蛋白質(zhì)等。通用性配體對生物大分子

28、的專一性雖然不如特異性配體，但通過選擇適宜的洗脫條件也可以得到很高的區(qū)分率。通用配體還具有構(gòu)造穩(wěn)定、偶聯(lián)率高、吸附容量高、易于洗脫、價格廉價等優(yōu)點，所以在試驗中得到了廣泛的應(yīng)用。基質(zhì)一般不能直接與配體連接，偶聯(lián)之前需要活化?；|(zhì)的活化是指通過對基質(zhì)進展肯定的化學(xué)處理，使基質(zhì)外表外表上的一些化學(xué)基團轉(zhuǎn)變?yōu)橐子诤吞囟ㄅ潴w結(jié)合的活性基團。不同的基質(zhì)有不同的活化方法。親和層析純化生物大分子通常承受柱層析的方法。洗脫方法非特異性洗脫：轉(zhuǎn)變緩沖液的 pH、離子強度、介電常數(shù)或溫度使物質(zhì)構(gòu)象轉(zhuǎn)變，濃縮、洗脫后馬上中和稀釋或透析，使蛋白質(zhì)快速恢復(fù)到自然構(gòu)造特異性洗脫：再次利用生物學(xué)特異性只洗脫和配基專一作用的

29、酶，不洗脫由于非專一吸附上去的雜蛋白，特異性強。再生親和層析拄可在一次層析后用大量洗脫劑連續(xù)洗滌，然后再用平衡緩沖液平衡，經(jīng)處理后的層析柱能再次使用。親和層析的應(yīng)用分別和純化區(qū)分化學(xué)或遺傳學(xué)上修飾的酶純化親和標(biāo)記的活性中心肽段和蛋白質(zhì)構(gòu)造爭辯純化人工合成的多肽和蛋白質(zhì)解釋酶作用機理第三節(jié)發(fā)酵產(chǎn)物的成品加工結(jié)晶技術(shù)定義：物質(zhì)從液態(tài)或氣態(tài)形成晶體的過程，是制備高純度固體物質(zhì)特別是小分子物質(zhì)的重要方法之一。結(jié)晶是溶質(zhì)從溶液中析出形成相的過程，只是同類分子離子才能排列成晶體，具有高度的選擇性。結(jié)晶過程本錢低、設(shè)備簡潔、操作便利，以廣泛應(yīng)用于氨基酸、抗生素、維生素、味精等制品的精制。1. 結(jié)晶過程的分析

30、結(jié)晶形成的過程：過飽和溶液的形成前提晶核的形成晶體的生長以過飽和度為推動力結(jié)晶與溫度、濃度的關(guān)系飽和曲線：表示物質(zhì)溶解度與溫度的關(guān)系穩(wěn)定區(qū)(不飽和區(qū))：不會發(fā)生結(jié)晶不穩(wěn)定區(qū)(過飽和區(qū))：結(jié)晶能自動生成介穩(wěn)區(qū)：結(jié)晶不能自動進展，向處于介穩(wěn)區(qū)的溶液中參加晶體，能誘導(dǎo)結(jié)晶產(chǎn)生，晶體能生長。結(jié)晶的方法冷卻結(jié)晶濃縮結(jié)晶化學(xué)反響結(jié)晶鹽析結(jié)晶晶核的形成晶核：過飽和溶液中生成的微小晶體粒子，是晶體生長過程的核心。成核是一個相變過程， 即在母液相中形成固相小晶芽。晶核的大小粗估為數(shù)十納米至幾微米。晶核形成時需要消耗肯定的能量才能形成固-液界面。在過飽和溶液中，能量在某一瞬間、某一區(qū)域大于某一能閾值時，才有利于晶核的形成。晶體