宏基因組上機(jī)操作手冊

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上專心-專注-專業(yè)專心-專注-專業(yè)精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上專心-專注-專業(yè)目錄TOC o 1-3 h u 0. 準(zhǔn)備工作上機(jī)步驟如下：mkdir /Metagenome#新建工作目錄cd /Metagenome#進(jìn)入工作目錄cp -R /RealBio_Train/Metagenome/01_clean_reads ./#拷貝數(shù)據(jù)宏基因組比對宏基因組的序列可以通過SOAPaligner比對軟件，比對上目標(biāo)基因組，從而進(jìn)行物種注釋或計(jì)算物種豐度。SOAPaligner需要先對目標(biāo)基因組進(jìn)行建庫，建庫命令如下：2bwt-builder SOAPa

2、ligner用法：soap a -b -D -o -2 -m -x 其他重要參數(shù)：OptionType Content-rINT匹配到多處時(shí)的策略：0：不顯示；1：隨機(jī)顯示一個(gè)；2：全部-MINT匹配模式：0：只允許完全匹配；1：允許一個(gè)錯(cuò)配；2：允許兩個(gè)錯(cuò)配；4：最佳匹配-pINT程序運(yùn)行的線程個(gè)數(shù)上機(jī)內(nèi)容為：將拷貝得到的reads比對上微生物的基因組。上機(jī)步驟如下：cd /Metagenome#先進(jìn)入個(gè)人目錄下的工作目錄mkdir 02_alignment#新建02_alignment目錄cd 02_alignment#進(jìn)入比對目錄cp /RealBio_Train/Metagenome/

3、02_aligner/soapaligner.sh ./#拷貝比對腳本less test01.pm#查看比對結(jié)果less test01.sm#查看比對結(jié)果2. 宏基因組組裝基因組組裝是指將測序儀產(chǎn)出的大量的DNA片段（Reads）拼接成原始的待測物種的染色體序列，可以類比為拼圖游戲。本手冊指導(dǎo)你如何使用SOAPdenovo（2.04）組裝軟件對鳥槍法測序數(shù)據(jù)進(jìn)行組裝。2.1 組裝軟件：SOAPdenovoSOAPdenovo的功能是對二代測序數(shù)據(jù)進(jìn)行從頭組裝。使用SOAPdenovo前首先要清楚的是它的組裝配置文件，該文件包含以下信息：Option Content全局配置max_rd_len記

4、錄輸入數(shù)據(jù)的最大讀長，并根據(jù)這個(gè)配置輸入緩存大小。文庫配置，每個(gè)文庫需要以LIB表明avg_ins記錄當(dāng)前文庫插入片段大小。asm_flags用來配置流程中哪些步驟用到當(dāng)前文庫數(shù)據(jù)：1，表示當(dāng)前文庫只在構(gòu)建contig時(shí)用到；2，表示當(dāng)前文庫只在構(gòu)建scaffold時(shí)用到；3，表示當(dāng)前文庫在構(gòu)建contig與scaffold時(shí)都用到。rank配置構(gòu)建scaffold時(shí)當(dāng)前文庫的使用優(yōu)先級，由于單端的reads不用于構(gòu)建scaffold，該文庫不用設(shè)置rank參數(shù)。q1/q2，q配置當(dāng)前文庫數(shù)據(jù)路徑，q1/q2用于配置雙端的reads，q用于配置單端的reads本次上機(jī)使用到的完整的配置文件內(nèi)容

5、如下：配置文件完成后，即可開始進(jìn)行組裝。組裝分四步驟操作。四個(gè)步驟分別是：1. pregraph，De Bruijn圖構(gòu)建。輸入組裝配置文件，輸出圖信息文件，主要參數(shù)如下：OptionType Content-sCONFIG指定組裝配置文件-oPREFIX指定輸出文件的前綴，由用戶隨意設(shè)定-pINT指定使用的線程數(shù)目。SOAPdenovo使用了多線程技術(shù)以充分利用計(jì)算機(jī)資源，一般取運(yùn)行機(jī)子的cpu核心數(shù)目即可，如你的機(jī)器是雙核一個(gè)cpu的，那么可指定為2-KINT指定需要構(gòu)建De Bruijn圖的kmer大小，應(yīng)根據(jù)SOAPdenovo的版本設(shè)定。如使用31mer版本，則可取kmer為31，2

6、9，27等-dINT指定構(gòu)建完De Bruijn圖后，需要對深度小于多少的kmer進(jìn)行過濾，一般設(shè)置為12. 構(gòu)建contig。輸入上一步驟產(chǎn)生的圖文件，輸出contig序列文件，主要參數(shù)如下：OptionType Content-gPREFIX輸入圖文件前綴，應(yīng)該與上面步驟中的-o參數(shù)一致-DINT設(shè)定在進(jìn)行構(gòu)建contig時(shí)，需要對深度低于該設(shè)定參數(shù)的contig連接邊進(jìn)行過濾。默認(rèn)取值為1-MINT設(shè)定在進(jìn)行構(gòu)建contig時(shí)，可以先對相似的序列進(jìn)行合并，參數(shù)最大取值為3，表示最大程度合并相似序列；最小取值為0，表示不對相似序列進(jìn)行合并。這里取經(jīng)驗(yàn)值2-R選擇是否利用reads的相鄰km

7、er信息解決短重復(fù)序列，一般選擇利用3.測序數(shù)據(jù)map回contig序列。在搭建scaffold前，需要先將輸入數(shù)據(jù)比對回contig序列中，輸出比對信息。SOAPdenovo在這一步中會(huì)將reads打碎成kmer，將一個(gè)個(gè)kmer比對回contig上，涉及到的參數(shù)有：OptionType Content-sSTR輸入組裝配置文件-gSTR輸入De Bruijn圖文件的前綴，應(yīng)該與上面步驟1中的-o參數(shù)一致-pINT指定多線程運(yùn)行使用的cpu個(gè)數(shù)4.搭建scaffold。輸入上步產(chǎn)生的contig文件和原始數(shù)據(jù)的比對信息文件，SOAPdenovo將根據(jù)比對的pair關(guān)系信息，搭建scaffol

8、d，主要參數(shù)有：OptionType Content-gSTR輸入De Bruijn圖文件的前綴，應(yīng)該與上面步驟1中的-o參數(shù)一致-F可選參數(shù)選擇是否在搭建完scaffold后對其進(jìn)行補(bǔ)洞。SOAPdenovo內(nèi)置有補(bǔ)洞流程，主要思路是把落在內(nèi)洞中的reads進(jìn)行局部組裝，把裝好的序列嵌入到內(nèi)洞中去，完成補(bǔ)洞工作-u可選參數(shù)選擇是否需要對高深度的contig進(jìn)行屏蔽后再搭建scaffold。SOAPdenovo默認(rèn)會(huì)對高深度的contig進(jìn)行屏蔽，以減少重復(fù)序列的影響，選擇此參數(shù)，將不對高深度的contig進(jìn)行屏蔽-L INT，可選參數(shù)選擇選取多長以上的contig進(jìn)行scaffold搭建。S

9、OAPdenovo默認(rèn)選取kmer+2上機(jī)內(nèi)容為：將上一步得到的clean reads進(jìn)行SOAPdenovo組裝，得到contig。上機(jī)操作的步驟如下：cd /Metagenome#先進(jìn)入個(gè)人目錄下的工作目錄mkdir 03_assembly#新建03_Assembly 目錄cd 03_assembly#進(jìn)入組裝目錄mkdir CFGcp /RealBio_Train/Metagenome/03_assembly/CFG/test01.cfg CFG/ #拷貝 組裝的config文件到當(dāng)前目錄mkdir shell#新建腳本目錄cp /RealBio_Train/Metagenome/03_

10、assembly/shell/test01_Kmer31.sh shell/#拷貝組裝腳本到腳本目錄mkdir assemble#新建結(jié)果目錄mkdir assemble/test01sh shell/test01_Kmer31.sh#運(yùn)行組裝腳本less assemble/test01/test01.scafSeq#查看組裝結(jié)果ss.o assemble/test01/test01.scafSeq#查看組裝統(tǒng)計(jì)結(jié)果模仿CFG/test01.cfg，生成test02文件的config文件CFG/test02.cfg，插入片段長度為412；模仿shell/test01_Kmer31.sh，生成關(guān)

11、于test02文件的組裝腳本shell/test02_Kmer37.sh，kmer值設(shè)為37mkdir assemble/test02sh shell/test02_Kmer37.sh#運(yùn)行組裝腳本less assemble/test02/test02.scafSeq#查看組裝結(jié)果ss.o assemble/tets02/test02.scafSeq#查看組裝統(tǒng)計(jì)結(jié)果2.2 組裝軟件：Meta-VelvetMeta-Velvet是在原來基因組組裝軟件Velvet基礎(chǔ)上改進(jìn)的，適合宏基因組數(shù)據(jù)的組裝軟件。主要參數(shù)如下：OptionType Content-cov_cutoffINT or aut

12、oDe Bruijn圖中節(jié)點(diǎn)過濾參數(shù)，節(jié)點(diǎn)層數(shù)小于該參數(shù)即被過濾-ins_lengthINT插入片段長度，reads長度加上gaps長度-exp_covINT or auto基因組覆蓋層數(shù)，這里選auto上機(jī)內(nèi)容為：將上一步得到的test03樣品的clean reads進(jìn)行SOAPdenovo組裝，得到contig。上機(jī)操作的步驟如下：cd /Metagenome#先進(jìn)入個(gè)人目錄下的工作目錄cd 03_assembly#進(jìn)入組裝目錄cp /RealBio_Train/Metagenome/03_assembly/shell/test03_Kmer31.sh shell/#拷貝組裝腳本到腳本目錄

13、mkdir assemble/test03sh shell/test03_Kmer31.sh#運(yùn)行腳本less assemble/test03/meta-velvetg.contigs.fa#查看組裝結(jié)果ss.o assemble/test03/meta-velvetg.contigs.fa#查看統(tǒng)計(jì)結(jié)果3 基因預(yù)測宏基因組一般使用MetaGeneMark預(yù)測contig中的cds（coding sequence）序列。OptionType Content-a輸出基因堿基序列-d輸出基因蛋白序列-f可選參數(shù)選擇輸出格式：L為lst文件，G為gff文件，一般使用gff文件作為輸出格式-k利用RB

14、S序列預(yù)測基因起始位點(diǎn)-r輸出RBS序列的打分與間隔序列上機(jī)內(nèi)容為：將上一步得到的clean reads進(jìn)行SOAPdenovo組裝，得到contig。上機(jī)操作的步驟如下：cd /Metagenome#先進(jìn)入個(gè)人目錄下的工作目錄mkdir 04_gene_predict#新建04_Gene_predict目錄cd 04_gene_predict#進(jìn)入基因預(yù)測目錄cat .03-assembly/assemble/test01.tst01.scafSeq contig.fa #將上步得到的3個(gè)文件的contig文件寫入04_gene_predict/contig.faperl filter.pl

15、 contig.fa contig.filter.fa#過濾500bp以下的contigcp /RealBio_Train/Metagenome/04_gene_prediction/gene_prediction.sh /Metagenome/04_gene_predict#拷貝基因預(yù)測腳本cp /RealBio_Train/soft/metagenemark/MetaGeneMark_linux_64/mgm/gm_key /.gm_key#拷貝權(quán)限sh /Metagenome/04_gene_predict/gene_prediction.sh#運(yùn)行腳本less /Metagenome/

16、04_gene_predict/gene.gff#查看gff文件ss.o /Metagenome/04_gene_predict/gene.cds 100#查看統(tǒng)計(jì)信息4 構(gòu)建基因集宏基因組研究未知菌的方法大多通過基因集，相當(dāng)于環(huán)境中微生物基因的集合。通過預(yù)測出來的基因，其中有一部分是序列相近或完全相同的。這里需要進(jìn)行去冗余的步驟，所用到的軟件為CD-HIT。CD-HIT是根據(jù)序列相似性，將序列進(jìn)行聚類的軟件。OptionType Content-cDOUBLE配合-G 0，配置identity參數(shù)，即完全匹配的堿基數(shù)與匹配上的堿基數(shù)的比值-aSDOUBLE配置coverage參數(shù)，即匹配上的堿基數(shù)與較短的基因堿基數(shù)的比值上機(jī)內(nèi)容為：將之前得到的基因序列合并，并去冗余，得到非冗余的基因集。上機(jī)操作的步驟如下：cd /Metagenome#先進(jìn)入個(gè)人目錄下的工作目錄mkdir 05_gene_catalog#新建05_Gene_catalog 目錄cd 05_gene_catal