實驗五-感受態(tài)制備與轉(zhuǎn)化-酶切電泳

1、實驗五感受態(tài)的制備、質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化和篩選2015-10-30實驗安排感受態(tài)的制備質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化第二天，觀察結(jié)果質(zhì)粒酶切-電泳檢測 上次實驗產(chǎn)物（質(zhì)粒） 酶切電泳點樣安排電泳上樣：1、所有同學各自的酶切產(chǎn)物（10-20 l）2、每排點樣孔需有兩種質(zhì)粒：pUC119、pUC119-U63、同一人的“酶切前”與“酶切后”相鄰點樣實驗步驟加1.5ml培養(yǎng)物于EP管，4000rpm10min 加入冰冷CaCl2溶液300 l，重懸菌體 沉淀中加入冰冷CaCl2溶液120 l，重懸菌體感受態(tài)制備冰浴15-30min， 4000rpm10min收集沉淀，去上清收集沉淀，去上清（去掉培養(yǎng)基）實驗步驟每管感受態(tài)中加質(zhì)粒

2、5 l，混勻42 ，熱激90秒，勿搖動每管加LB 500 l，37搖床，復(fù)蘇30-40min 鋪200 l 菌液到LB瓊脂平板，涂勻轉(zhuǎn)化冰上靜置20-30min如何設(shè)計實驗的參照體系（對照組）？篩選實驗步驟LB培養(yǎng)基（X-gal, IPTG, Amp）LB培養(yǎng)基感受態(tài)+質(zhì)粒（ pUC119-U6 or pUC119）感受態(tài)（無質(zhì)粒）pUC119-U6pUC119對照組B？對照組A？基因克隆應(yīng)用酶學的方法，在體外將各種來源的遺傳物質(zhì)（同源的或異源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）與載體DNA接合成一具有自我復(fù)制能力的DNA分子復(fù)制子(replicon)，繼而通過轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細胞，篩選出

3、含有目的基因的轉(zhuǎn)化子細胞，再進行擴增提取獲得大量同一DNA分子，也稱DNA克隆或重組DNA (recombinant DNA) 。 基因克隆示意圖基因克隆操作過程： 分分離目的基因 切限制酶切目的基因與載體接拼接重組體 轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)入受體菌 篩篩選重組體 受體菌條件安全宿主菌 限制酶和重組酶缺陷處于感受態(tài)(competent) 導(dǎo)入方式轉(zhuǎn)化 (transformation)轉(zhuǎn)染 (transfection)感染 (infection)重組DNA導(dǎo)入受體菌LB 0.18M0.1M CaCl20.1M CaCl2H2O細胞膨脹：低滲環(huán)境胞膜收縮：低溫環(huán)境離子擴散： DNA-Ca2熱休克： 42 1L LB

4、培養(yǎng)基:10g 胰蛋白胨5g 酵母提取物10g NaCl 重組體的篩選重組DNA導(dǎo)入受體菌后，經(jīng)過培養(yǎng)使其大量繁殖，再設(shè)法將含有目的基因的菌落區(qū)分鑒定出來，這一過程即為篩選（screening）或選擇（selection）。重組體的篩選 1. 直接選擇法(1) 抗藥性標記選擇(2) 標志補救(marker rescue) 互補（藍白斑篩選）(3) 分子雜交法原位雜交Southern印跡 2. 免疫學方法如免疫化學方法及酶免檢測分析等 互補的檢測藍白斑篩選感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)化效率的檢驗1g的完整質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細胞中，得到的轉(zhuǎn)化細菌的數(shù)量。例如，取1l（0.1 ng/l）完整的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化100l的感受態(tài)細胞. 向轉(zhuǎn)化反應(yīng)液中加入900l培養(yǎng)液，讓細菌恢復(fù)一小段時間，取100l鋪板.培養(yǎng)過夜，產(chǎn)生1000個菌落。轉(zhuǎn)化0.1 ng DNA，用SOC稀釋到1000l后，取1/10涂平板，則涂平板共用0.01 ng DNA 質(zhì)粒。轉(zhuǎn)化率1000克隆/0.01 ng DNA =105 cfu/ng=108 cfu/g轉(zhuǎn)化效率1106 cfu/g DNA可滿足普通的亞克隆實驗；11