益痛清對膜性腎病模型的治療及其機制研究

1、益痛清對膜性腎病模型的治療及其機制研究膜性腎病N，ebranusnephrpathy是以電子致密物在腎小球毛細血管壁上皮下沉積為特征的原位免疫復合物腎炎。近年來大量臨床理論征明，中醫(yī)藥對N的治病有較好的療效，尤其在緩解蛋白尿方面。益腎清配方是以黃芪、小薊、川芎、海風藤及車前子五種中藥組成，具有補氣升陽、清熱化瘀、涼血止血、利水清濁的功能，可減輕或緩解N的蛋白尿、保護腎功能、修復腎小球構造的病理損傷。1材料1.1藥品和拭劑益腎清，棕紅色粉末，1g粉末相當于13.75g生藥，北京制藥四廠提供。小牛血清白蛋白，帝道生物；大腸桿菌內毒素，北京邦定；生化試劑盒，北京中生。1.2動物雄性新西蘭家兔，1.5

2、-2.0kg，中國藥品生物制品檢定所提供。BALB/小鼠和57BL/6J小鼠，18-22g，雌雄各半，雄性istar大鼠，150-200g均由北京大學區(qū)學部實驗動物科學部提供。1.3儀器ZS-1A型半自動生化分析儀，北京中生；TJ-6離心機和LSl701液閃儀，Bekan；VIS-7220型可見分光光度計，北京瑞利。2方法2.1益腎情治療陽離子化牛血清白蛋白-BSA誘導的家免N。2.1.1模型制作參考Bder1982年所用的方法制備-BSA并制作模型。42只家兔測定各項血尿生化指標后，隨機選出8只作為正常組，其余動物全部制作模型。首先每只動物iv-BSAlg及大腸桿菌內毒素1g，一周后開場每天

3、iv-BSA10g，4-7周時劑量加倍。待模型成功后除選兩只模型動物送病理檢查外，其余隨機分為模型組、益腎清10g、5g、2.5g生藥/kg體重劑量組并給藥治療。2.1.2觀察工程每周動物稱重一次。分別于實驗前、造模成功、藥物治療4周和8周時測定血尿生化指標。動物殺檢，作腎臟病理組織學檢查。2.2益腎清對正常小鼠免疫功能的影晌2.2.1非特異性免疫碳粒廓清法將40只BALB/小鼠隨機分成益腎清28g、14g、7g生藥/kg體重劑量組和溶劑對照組0.25%溶液。連續(xù)給藥20天后，小鼠iv印度墨汁0.05l/10g體重，于1in和5in時分別取血20l，加到2l0.1%的碳酸鈉溶液中搖勻比色(68

4、0n)測光密度。計算廓清指數(shù)K和吞噬指數(shù)。2.2.2體液免疫血清溶血素的分光光度測定法將40只57BL/6J小鼠分組給藥同非特異性免疫。連續(xù)給藥20天后，小鼠ip20%SRB0.2，免疫后第4天取血，離心得血清，稀釋500倍作溶血反響，比色540n。計算樣品半數(shù)溶血值H50。2.2.3細胞免疫淋巴細胞轉化實驗3H-TdR摻人法將40只57BL/6J小鼠分組給藥同非特異性免疫。連續(xù)給藥20天后，制備小鼠脾細胞懸液，參加培養(yǎng)板，同時參加nA或LPS，5%2培養(yǎng)72小時。終止培養(yǎng)前6小時，加人3H-TdR終濃度為2i/l。搜集細胞，測定樣品放射強度。計算nA和LPS誘導細胞轉化率。2.3益腎清對大鼠

5、的利尿作用將40只雄性安康istar大鼠食18h后，隨機分成益腎清20g、10g、5g生藥/kg體重劑量組和溶劑對照組生理鹽水，給藥5l/100g體重。給藥后半小時壓大鼠下腹部排盡余尿，分別放人代謝籠中，搜集給藥后1、2、3、4、5小時的尿量。2.4益腎清對大鼠血液流流變學的影晌將40只雄性安康iStar大鼠隨機分成益腎清20g、10g生藥/體重劑量組、模型組生理鹽水和溶劑對照組生理鹽水，給藥7天。最后一天除溶劑對照組外，其余四組動物sAdr0.2l，共2次，兩次間隔6h，間隔中間將功物放入冰水浴中5in給予冷刺激，造成血瘀模型。末次注射Adr18h后，腹主動脈取血，肝素抗凝，B轉子剪切速率由

6、高到為307.20s-1、153.60s-1、61.44s-1、30.72s-1、15.36s-1，不同切變率下測全血表觀粘度b；別離血漿，307.20s-1下測血漿粘度p。2.5統(tǒng)計學處理組間比擬用t檢驗。3結果3.1益腎清對-BSA誘導的家兔N的治療作用3.1.1一般情況模型組動物于造模后不同程度的攝食減少、精神不振、體重減輕、水腫、少尿等現(xiàn)象。給藥后治療組動物水腫逐漸消失，模型組也有自愈趨勢。治療組動物體重高于模型組，但仍低于正常組，各組沒有顯著性差異。3.1.2血尿生化指標造模第3周模型組有動物出現(xiàn)蛋白尿，至造模第7周所有模型組動物均出現(xiàn)蛋白尿，TP24、BUN、H比正常組顯著升高P0

7、.01，ALB明顯降低(P0.05)，TRIG也明顯升高(P0.05)說明模型己經形成。藥物治療4周時，僅益腎清10g生藥/kg體重劑量組的TP24比模型組明顯降低(P0.05)，其余各組各指標均無明顯交化。治療8周時，治療組的TP24、BUN、TRIG及H均比模型組明顯降低P.01或P0.05，ALB明顯上升P0.05，根本恢復至正常程度。3.1.3腎臟病理組織學檢查3.1.3.1肉眼觀察實驗完畢時，動物殺檢，發(fā)現(xiàn)正常組的腎臟和脾臟外觀外表光滑，色澤正常。益腎清各治療組的外觀色澤及大小無明顯變化。而模型組的腎臟兩端鈍圓，中間略隆起，外表不甚光滑，個別腎及脾臟明顯增大，腎臟、脾臟的臟器系數(shù)均比

8、正常組明顯增大(P0.05)。3.1.3.2病理改變正常組免疫熒光檢查陰性，光鏡和電鏡檢查未見異常。模型組IgG、3沿腎小球毛細血管壁高強度顆粒狀沉積，3沉積較弱。光鏡檢查可見GB增厚，系膜增生并有少量粒細胞浸潤，電鏡檢查可見GB彌漫增厚，上皮下多數(shù)電子致密物沉積，上皮細胞足突交融。益腎清各治療組的免疫熒光檢查與模型組相比無差異。10g、5g生藥/kg體重劑量組的光鏡和電鏡檢查已根本恢夏正常，2.5g生藥/體重劑量的的光鏡檢查已恢復正常，但電鏡檢查仍有GB輕度增厚和節(jié)段性上皮細胞足突交融現(xiàn)象。3.2益腎清對正常小鼠免疫功能的影響益腎清28g、14g生藥/kg體重劑量組，小鼠的、H50及nA和L

9、PS誘導細胞轉化的才能比溶劑對照組明顯增強P0.05或P0.01。各劑量組之間有明顯的量效關系。3.3益腎清對大鼠的利尿作用益腎清20g、10g生藥/kg體重劑量組，大鼠1小時尿量及5小時內總尿量與溶劑對照組相比都有顯著增加P0.01，提示其有較強的利尿作用。3.4益腎清對大鼠血液流變學的影響血瘀模型組動物的b值和p值皆顯著高于溶劑對照相P0.01，標志模型的形成；益腎清20g、10g生藥/kg體重劑量組，大鼠的b值和p值比模型組均顯著降低P0.01，P0.05。說明益腎清能降低血瘀大鼠全血的高、低切變粘度及血漿粘度，提示其有活血化瘀的作用。4討論自1982年以來，Bder等用-BSA成功誘導

10、了家兔N之后，陽離子抗原已被廣泛地應用于腎炎的實驗研究。該模型與人類N頗為相似，具有一定的代表性。它發(fā)病率高，重復投好，病理改交一致，合適腎炎發(fā)病機理及防治的研究。本實驗成功地復制了-BSA誘導的家免N模型。比擬正常組，模型組動物TP24和BUN明顯升高，ALB顯著降低，TRIG和H也顯著增加，這些指標的變化與文獻報導一致。根據N的病理改變可分四期。本打破的模型組IgG、3沿腎小球毛細血管壁高強度顆粒狀沉積。光鏡檢查可見GB增厚，系膜增生并有少量粒細胞浸潤，電鏡檢查可見GB彌漫增厚，上皮下多數(shù)電子致密物沉積上皮細胞足突交融。此病癥與N期病理病癥相符，說明此實驗模型復制成功。益腎清的主要成分有：黃芪、小薊、川芎、海風藤及車前子。黃芪主補氣升陽，利水退腫。小薊主清熱解毒，涼血止血，清下焦熱結，可控制炎癥反響。川芎與海風藤協(xié)同作用，