抗肝損傷與肝纖維化藥實(shí)驗(yàn)法

1、第48章抗肝損傷與肝纖維化藥物實(shí)驗(yàn)法2010.41肝臟是人體最大的腺體，位于腹腔的右上方。分左葉、右葉、方葉及尾狀葉四個(gè)葉。肝臟功能 代謝功能 (合成多種蛋白質(zhì)和脂類(lèi)) 膽汁分泌（有助脂肪的消化和吸收)） 解毒功能 防御功能 參與凝血及抗凝血 造血功能（胚胎時(shí)期)2肝臟的細(xì)胞:實(shí)質(zhì)細(xì)胞(肝細(xì)胞)及非實(shí)質(zhì)細(xì)胞(肝星狀細(xì)胞枯否細(xì)胞pit細(xì)胞竇內(nèi)皮細(xì)胞 )Pit細(xì)胞大顆粒淋巴細(xì)胞-位于肝血竇內(nèi)的Nk細(xì)胞。 3 第1節(jié) 急性肝損傷動(dòng)物模型作用：篩選改善肝細(xì)胞損傷的藥物并評(píng)價(jià)其活性主要內(nèi)容：1.四氯化碳肝損傷動(dòng)物模型2.急性氨基半乳糖肝損傷動(dòng)物模型3.急性對(duì)乙酰氨基酚肝損傷動(dòng)物模型4.急性乙醇性肝損傷動(dòng)

2、物模型 5.大鼠肝缺血-再灌注模型41. 四氯化碳肝損傷動(dòng)物模型 【原理】 1)CCL4對(duì)肝細(xì)胞膜直接溶解作用。 2) 活性代謝產(chǎn)物對(duì)肝細(xì)胞的損傷。CCL4在肝細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中經(jīng)細(xì)胞色素P450酶的代謝，生成活潑的三氯甲基和氯自由基。 與細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞膜的大分子發(fā)生共價(jià)結(jié)合，膜脂質(zhì)過(guò)氧化，膜的結(jié)構(gòu)和功能完整性被破壞； 抑制細(xì)胞膜及線粒體膜上鈣泵的活性, 胞漿Ca2+升高，Ca2+-ATP酶激活, ATP耗竭導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷壞死。5 動(dòng)物：以大鼠使用最多，雌雄兼用，280g左右。 方法： 大鼠一般以CCL4原液1 mlkg體重一次性ip或sc注射。也可經(jīng)ig給藥，0.8-1.6mlkg，配成1:11:3

3、橄欖油或精制花生油稀釋后ig。 小鼠對(duì)CCL4亦較敏感，配成1橄欖油或精制花生油稀釋液，按10-20mlkg ig或ip注射。 觀察指標(biāo)： 1.給CCL4后16-24h處死動(dòng)物，測(cè)定血清ALT和AST（）變化，甘油三酯(GT )、乳酸脫氫酶(LDH )、總膽酸(TBARS )及肝指數(shù)升高, 谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)（檢測(cè)試劑盒）。 2.肝病理形態(tài)學(xué)檢查。 6【注意事項(xiàng)和評(píng)價(jià)】 (1)此模型是一種經(jīng)典的實(shí)驗(yàn)性肝損傷模型。形態(tài)學(xué)上主要表現(xiàn)為肝小葉中央?yún)^(qū)壞死和脂肪變性，轉(zhuǎn)氨酶ALT和AST升高，并能靈敏地反映肝損傷的程度。ALT和AST 16-24h后達(dá)到高峰，升高十倍左右，90h后可恢復(fù)

4、到正常范圍。 （2）可先給藥物7-10天，以評(píng)價(jià)藥物對(duì)肝損傷的保護(hù)。 (3) CCL4可由呼吸道、皮膚吸收，對(duì)人體有一定的毒性，注意個(gè)人防護(hù)。78 2.急性氨基半乳糖肝損傷動(dòng)物模型 【基本原理】 氨基半乳糖(Galactoamine，GalN) ，常用其鹽酸鹽，生理鹽水溶解。 機(jī)制：GalN屬間接肝毒劑，肝損傷與其在肝內(nèi)的代謝及隨后對(duì)核酸合成的影響有關(guān)。GalN引起肝細(xì)胞壞死。分為三個(gè)步驟：第一步，GalN在肝內(nèi)代謝引起VDP-葡萄糖胺的聚積，同時(shí)引起尿嘧啶核苷酸和UTP（尿苷三磷酸）缺乏；第二步，這些代謝異常引起肝細(xì)胞膜損傷；第三步，鈣離子內(nèi)流增加破壞細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)，進(jìn)而引起代謝紊亂，導(dǎo)致細(xì)胞

5、的死亡。9(1)動(dòng)物：大鼠，250350g，雌雄兼用。(2)方法：將GalN以無(wú)菌生理鹽水配成10溶液，1 mol/L NaOH調(diào)pH至7.0，ip一次性注射500-850mgkg（大于1000mgkg，引起廣泛性肝壞死）。(3)檢測(cè)指標(biāo)：給藥16-24h處死動(dòng)物，測(cè)定血清ALT （）和AST（）， GT ( )、 LDH ( )、TBARS ()及肝指數(shù)() 。 肝病理形態(tài)學(xué)檢查。10【評(píng)價(jià)】(1) 小鼠不敏感。(2) GalN與CCl4所致肝損傷的組織學(xué)變化顯然不同。GalN損傷則呈彌漫性的多發(fā)性片狀壞死，脂肪變性不如CCl4明顯，嗜酸性小體較多見(jiàn)，與病毒性肝炎所造成的損傷類(lèi)似。GalN肝

6、毒性的專(zhuān)一性較佳，對(duì)人安全無(wú)毒。 GalN肝損傷模型是研究病毒性肝炎的發(fā)病機(jī)制及其藥物治療的較好模型。113急性對(duì)乙酰氨基酚肝損傷動(dòng)物模型【基本原理】1.大劑量對(duì)乙酰氨基酚代謝中產(chǎn)生大量N-乙酰-對(duì)苯醌亞胺(NAPQI)，超過(guò)了GSH的解毒能力，未被清除的NAPQ I與生物大分子共價(jià)結(jié)合，導(dǎo)致蛋白質(zhì)巰基被氧化和芳基化而影響功能。2.對(duì)乙酰氨基酚在肝內(nèi)代謝過(guò)程中產(chǎn)生自由基可引起肝細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化，并通過(guò)破壞鈣穩(wěn)態(tài)而產(chǎn)生細(xì)胞毒性。12【操作步驟】 (1)動(dòng)物：昆明小鼠，雄性，2535g。 (2)方法：將對(duì)乙酰氨基酚溶于40無(wú)菌生理鹽水，一次性ip注射300-500m g/kg，24h后取血。 (3

7、)觀察指標(biāo)： 血清ALT和AST測(cè)定。 肝作組織學(xué)檢查。13【評(píng)價(jià)】(1)對(duì)乙酰氨基酚（撲熱息痛），乙酰氨基酚肝損傷是研究藥物性肝損傷的常用動(dòng)物模型。(2)對(duì)乙酰氨基酚肝損傷的組織學(xué)變化主要表現(xiàn)以中央靜脈為中心的圓盤(pán)狀大量細(xì)胞壞死，但出血和脂肪變性不如CCL4肝損傷明顯。（3）大鼠對(duì)對(duì)乙酰氨基酚不敏感，小鼠十分敏感。144.急性乙醇性肝損傷動(dòng)物模型 【基本原理】 1.大量飲酒除經(jīng)醇脫氫酶(ADH)氧化外，還可誘導(dǎo)微粒體乙醇氧化系統(tǒng)(MEOS），催化乙醇產(chǎn)生乙醛毒性物質(zhì)。 2.乙醇誘導(dǎo)MEOS活性不但不能使乙醇氧化產(chǎn)生ATP，還增加氧和NADPH（還原型輔酶）的消耗，造成肝內(nèi)能量的耗竭，引起肝細(xì)

8、胞損害。15【試驗(yàn)步驟】 （1）動(dòng)物：雄性大鼠，180220g。（2）方法： ig 56度白酒，7ml/kg，每日2次。12周后表現(xiàn)為肝細(xì)胞脂肪變性，伴輕度氣球樣變和炎細(xì)胞浸潤(rùn)。（3）檢測(cè)指標(biāo)：1.給CCL4 16-24h處死動(dòng)物，測(cè)定血清ALT和AST（）變化，甘油三酯(GT )、乳酸脫氫酶(LDH )、總膽酸(TBARS )及肝指數(shù)升高, 谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px) 。（檢測(cè)試劑盒） 肝病理形態(tài)學(xué)檢查 。 16【注意事項(xiàng)與評(píng)價(jià)】灌胃法造模符合人類(lèi)飲酒習(xí)慣。用于酒精性肝損傷藥物篩選。175.大鼠肝缺血-再灌注模型【基本原理】 暫時(shí)阻斷肝血流，一段時(shí)間肝細(xì)胞并無(wú)明顯損傷，但隨后再灌注反

9、而出現(xiàn)損傷。發(fā)生嚴(yán)重缺血性損傷的細(xì)胞，再灌注不能使損傷減輕，反而使之加重。再灌注損傷的因素主要與自由基損傷和細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載有關(guān)。18缺血時(shí)，ATP大量分解，依次生成AMP腺苷次黃嘌呤黃嘌呤。黃嘌呤在黃嘌呤脫氫酶的作用下，經(jīng)非氧化的途徑進(jìn)一步分解而生成尿酸。再灌時(shí)，由于細(xì)胞內(nèi)Ca2+突然增加，激活某種蛋白酶，使黃嘌呤脫氫酶轉(zhuǎn)變?yōu)檠趸?，同時(shí)由于再灌注增加了氧的供應(yīng)，黃嘌呤便在黃嘌呤氧化酶的作用下，通過(guò)有氧氧化途徑生成尿酸，并生成大量氧自由基、羥自由基(OH)和H202。自由基和生物大分子作用，可使之受損。同時(shí)由于肝細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載，使細(xì)胞膜及細(xì)胞器受損，細(xì)胞出現(xiàn)能量障礙。19【操作步驟】

10、(1)動(dòng)物： 大鼠，200250g ， 。 (2)方法：戊巴比妥鈉(50mgkg)麻醉大鼠。打開(kāi)腹腔，分離肝門(mén)靜脈、肝動(dòng)脈和膽總管，用小型動(dòng)脈夾將三者一同夾閉30一60min后，松開(kāi)動(dòng)脈夾讓血液重新灌注。 (3)觀察指標(biāo)：分別于再灌流30min和60min取靜脈血測(cè)定血清ALT和AST活力。取肝組織，測(cè)定MDA含量。20第2節(jié) 小鼠免疫性肝損傷模型211. LSP誘發(fā)的小鼠自身免疫性肝炎 【基本原理】 肝細(xì)胞膜特異性脂蛋白(LSP)是一組大分子肝細(xì)胞膜脂蛋白抗原。 乙型病毒性肝炎患者血清中抗LSP持續(xù)陽(yáng)性。 LSP是器官特異而非種屬特異。 小鼠LSP-1與兔肝細(xì)胞有交叉抗原性，故用兔LSP反復(fù)

11、免疫小鼠，可以引起機(jī)體產(chǎn)生高滴度的抗LSP抗體。 同時(shí)輔以人乙型肝炎疫苗等刺激，可誘發(fā)小鼠自身免疫性肝炎。22【操作步驟】 (1)分離LSP：日本大耳兔，放血處死，取肝，用pH8.0的蔗糖溶液制成50(w/v)的肝勻漿，4，105000g離心1 h，取上清液過(guò)分離柱，收集第1峰，濃縮、透析，即取得LSP；測(cè)定蛋白含量，置-20C，備用。(2)制作自身免疫性肝炎模型：C57 BL小鼠，雌性，202g，用兔LSP(0.5mgml)加等量弗氏不完全佐劑和人乙型肝炎疫苗(0.25ugm1)，sc 0.1 ml，每周一次，于第4次免疫后第7天處死，檢測(cè)血清抗LSP滴度和肝組織學(xué)變化。(3)血清抗LSP測(cè)

12、定：采用E LISA方法.23【注意事項(xiàng)與評(píng)價(jià)】LSP是一種弱抗原，不能誘發(fā)明顯的肝損傷。同時(shí)輔以人乙型肝炎病毒刺激，則可促進(jìn)自身免疫性肝炎的產(chǎn)生。24 2.卡介苗+脂多糖誘導(dǎo)小鼠免疫性肝損傷 【基本原理】 預(yù)先給小鼠注射卡介苗(BCG),可使多核中性粒細(xì)胞或巨噬細(xì)胞聚集于肝，繼后再用低劑量大腸桿菌脂多糖(LPS)攻擊注射，可激發(fā)這些細(xì)胞釋放對(duì)肝細(xì)胞有毒性作用可溶性因子，造成免疫性肝損傷。25【操作步驟】 昆明種小鼠，雌性，243g。NS配制卡介苗溶液，每108活菌/ml ，尾靜脈0.2ml。 2h后ig給藥或溶媒，連續(xù)12d。12d后尾靜脈注入LPS （7.5ug/0.2ml）。禁食12h。

13、稱(chēng)體重，摘眼球取血，離心(250g，20min)，收集血清，測(cè)ALT、AST。 另取:(1)肝臟、胸腺，稱(chēng)重，計(jì)算肝和胸腺指數(shù); (2)肝左葉送病理組織學(xué)檢查; (3)每組取3只鼠，體外檢測(cè)脾細(xì)胞的ConA增殖 （4）檢測(cè)腹腔巨噬細(xì)胞分泌TNF與IL-1等。 26【注意事項(xiàng)與評(píng)價(jià)】(1)每批卡介苗所含活菌數(shù)有所差異，實(shí)驗(yàn)前應(yīng)做活菌數(shù)的檢測(cè)。(2)由于卡介苗活菌數(shù)檢測(cè)不精確，且容易造成污染，可用滅活的短小棒狀桿菌（CP)替代。選模型方法是：給小鼠iv 0.5-1 mg CP，9天后iv 10ugLPS，12-16h后處死動(dòng)物，采集血和肝臟標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)。273.鴨乙型肝炎病毒性肝損傷動(dòng)物模型 【基

14、本原理】 由于受人乙型肝炎病毒(HBV)宿主專(zhuān)一，需尋找類(lèi)似于HBV的其它動(dòng)物肝炎病毒以用于研究。鴨乙型肝炎病毒(DHBV)與 HBV同屬于嗜肝DNA病毒科，因此DHBV感染的鴨可用于研究HBV致病機(jī)制和篩選抗肝炎病毒藥物的研究。28【操作步驟】(1) DHBV毒種獲?。簭淖匀桓腥綝HBV陽(yáng)性的成年家鴨取血清，測(cè)定其DHBV滴度，根據(jù)與定量克隆DHBV DNA比較，計(jì)算每ml血清所含的病毒顆粒數(shù)，分裝在-70保存。(2)實(shí)驗(yàn)用鴨：選血清斑點(diǎn)雜交試驗(yàn)DHBV DNA陰性的北京雛鴨(1-3天內(nèi))。(3) 感染方法：接種病毒量在5108/ml（血清稀釋?zhuān)?。ip給予血清0.5ml。(4)觀察指標(biāo)：30

15、日后處死，檢測(cè)血清和肝組織DNA提取物的DHBV DNA。29【注意事項(xiàng)與評(píng)價(jià)】(1)鴨種來(lái)源：不同鴨種對(duì)DHBV的易感程度有所差異，北京鴨對(duì)DHBV易感。(2)DHBV接種時(shí)機(jī)：鴨胚孵化1-5天內(nèi)的雛鴨及5天后的小鴨或成年鴨。接種時(shí)鴨齡越大，感染維持的時(shí)間即越短，但鴨胚時(shí)期接種病毒技術(shù)要求很高，雛鴨的孵出率難控制，故多認(rèn)為孵出后l3天內(nèi)(多選擇24h內(nèi))接種病毒時(shí)機(jī)最佳。(3)接種途徑：DHBV接種途徑包括：iv，ip，im，肝內(nèi)注射il，胚內(nèi)注射ie等。一般認(rèn)為，在其它條件相同的條件下，ip，iv，ie接種感染率最高，im接種次之，最可靠的方法可能為ip、il。30 (5)感染DHBV鴨肝

16、炎的評(píng)價(jià)：理想的感染DHBV鴨肝炎模型應(yīng)具備:血清中有持續(xù)穩(wěn)定的病毒癥即DHBV DNA(+)，鴨肝內(nèi)應(yīng)有DHBV DNA或(和)DNAP。感染了DHBV的家鴨其血清DHBV DNA和DHBV DNAP的水平在整個(gè)持續(xù)感染期間有很大的波動(dòng)性，甚至可以出現(xiàn)暫時(shí)的轉(zhuǎn)陰現(xiàn)象，但此時(shí)肝組織DHBV DNA的檢測(cè)仍能夠顯示出乙肝病毒的感染狀態(tài)，因此，肝組織病毒DNA的檢測(cè)比血清病毒DNA的檢測(cè)更具重要性，更能可靠地反映出病毒感染的真實(shí)情況。314.刀豆蛋白A誘導(dǎo)小鼠急性免疫性肝損傷模型 【基本原理】刀豆球蛋白A(Con A)是植物性蛋白的一種。給小鼠靜脈注射Con A后，可激活T淋巴細(xì)胞，導(dǎo)致與人類(lèi)自身

17、免疫性肝炎相似的肝損害。Con A進(jìn)入小鼠體內(nèi)后可使肝臟中NO合成酶及TNF-、INF-表達(dá)增高，而TNF-和INF-可激活iNOS系統(tǒng)，從而使NO合成增加導(dǎo)致肝損傷。32【操作步驟】（1）動(dòng)物：79周齡小鼠，體重1825g。（2）方法：Con A溶解于生理鹽水中，以1030mg/kg的劑量（0.3ml）一次尾靜脈注射。（3）觀察指標(biāo)：Con A注射后24小時(shí)取小鼠血清和肝臟，測(cè)定小鼠血清中ALT和AST活力，并取肝作組織學(xué)檢查?！咀⒁馐马?xiàng)】多數(shù)小鼠對(duì)Con A敏感而發(fā)生自身免疫性肝炎，但免疫缺陷小鼠和無(wú)胸腺裸鼠對(duì)Con A不敏感。33 第3節(jié) 脂肪性肝病脂肪性肝病包括乙醇性肝病和非乙醇性脂肪

18、性肝病。研究其發(fā)病機(jī)制、評(píng)價(jià)診斷方法、篩選防治該病的有效藥物的理想動(dòng)物模型應(yīng)具備：1）人類(lèi)脂肪性肝病的特征；2) 病變有一定發(fā)展過(guò)程，從單純性脂肪肝、脂肪性肝炎、肝纖維化至最終的肝硬化有相對(duì)明顯的分期，符合人類(lèi)脂肪肝的演變過(guò)程；3) 簡(jiǎn)便易行，模型形成率高，死亡率低；4) 造模停止后病變逆轉(zhuǎn)緩慢，便于藥物干預(yù)試驗(yàn)。34一、高脂飼料誘發(fā)的脂肪肝【基本原理】脂肪肝的發(fā)病主要為：進(jìn)入肝內(nèi)的脂肪酸過(guò)多，TG的合成超過(guò)將其轉(zhuǎn)運(yùn)出肝臟的能力；肝內(nèi)脂肪酸氧化障礙，利用減少，TG合成增加；VLDL的合成及分泌障礙，肝臟內(nèi)源性TG不能運(yùn)出；脂蛋白代謝酶的活性下降等?！静僮鞑襟E】（1）動(dòng)物： SD大鼠，雄性，20

19、0250g。（2）方法：每日ig高糖、高脂、高蛋白乳劑，乳劑組成見(jiàn)表（略），實(shí)驗(yàn)開(kāi)始14周乳劑ig 2.5、5、7.5、10ml/kg每周遞增，后2周持續(xù)10ml/kg，共6周。（3）觀察指標(biāo)： 檢測(cè)血清ALT、AST、TG、HDL-C、LDL-C（低密度脂蛋白-膽固醇 ）、TG含量 肝組織作病理組織學(xué)檢查。35【注意事項(xiàng)與評(píng)價(jià)】（1）加入與豬油等量的植物油，更符合人類(lèi)的膳食結(jié)構(gòu)，植物油富含多不飽和脂肪酸，易發(fā)生過(guò)氧化反應(yīng)，產(chǎn)生自由基和醛類(lèi)物質(zhì)，醛類(lèi)物質(zhì)可與抗谷胱甘肽等抗氧化劑的活性部位結(jié)合，減少對(duì)自由基的清除，引起二次攻擊的發(fā)生。（2）6周后，大鼠出現(xiàn)彌漫性脂肪變性，肝細(xì)胞體積增大，胞質(zhì)內(nèi)充

20、滿(mǎn)大量脂肪空泡。部分造模動(dòng)物甚至有輕至中度肝實(shí)質(zhì)炎癥，即成功復(fù)制出肥胖、高脂血癥、脂肪肝，甚至脂肪性肝炎模型。36二、低蛋白、乏膽堿高脂飲食脂肪性肝炎模型【基本原理】飼料中缺乏蛋白質(zhì)不能合成載脂蛋白，以致甘油三酯積存肝內(nèi)；膽堿缺乏引起磷脂酰膽堿合成不足，從而導(dǎo)致極低密度脂蛋白合成下降，無(wú)法將甘油三酯運(yùn)出肝外，引起肝內(nèi)脂肪堆積，形成脂肪變性?！静僮鞑襟E】（1）動(dòng)物：大鼠，雄性，200250g。（2）方法：缺乏蛋氨酸和膽堿的飼料喂大鼠。 飼料配方成分：蔗糖360g、右旋麥芽糖200g、豬油250g、植物纖維素50g、玉米粉50g、食鹽7.5g、黑豆30g、CaCO3 2.5g、MgO 1.5g、維

21、生素A15 000 U、維生素D2 1500U、維生素E 0.5g。（3）檢測(cè)指標(biāo)：進(jìn)行肝病理形態(tài)學(xué)檢查。37 【注意事項(xiàng)與評(píng)價(jià)】（1）第8天肝細(xì)胞內(nèi)有少量脂滴，第14天約1/3肝細(xì)胞含有細(xì)顆粒狀脂滴，第21天約2/3以上肝細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)脂滴，第28天可見(jiàn)肝細(xì)胞內(nèi)充滿(mǎn)脂肪空泡。（2）此種模型與人類(lèi)脂肪性肝炎改變相類(lèi)似，但其造模方法與人類(lèi)膳食情況不同，人類(lèi)與嚙齒類(lèi)動(dòng)物不同，其肝臟不存在膽堿缺乏問(wèn)題。38三、乙醇灌胃動(dòng)物模型【基本原理】乙醇在乙醇脫氫酶的催化下脫氫氧化，使三羧酸循環(huán)障礙和脂肪酸氧化減弱。乙醇可致磷酸甘油增多而促進(jìn)甘油三酯合成，致使脂肪在肝細(xì)胞內(nèi)沉積；同時(shí)乙醇能激活氧分子，產(chǎn)生氧自由基導(dǎo)

22、致肝細(xì)胞膜的脂質(zhì)過(guò)氧化及體內(nèi)還原型谷胱甘肽的耗竭；乙醇對(duì)CYP2E1的誘導(dǎo)可加重乙醇代謝產(chǎn)物的肝毒性，使肝臟內(nèi)皮細(xì)胞窗孔改變，導(dǎo)致肝細(xì)胞脂肪攝取增多，促進(jìn)脂肪肝的形成?！静僮鞑襟E】（1）動(dòng)物：大鼠，雄性，150170g。（2）方法：灌服50%(V/V）乙醇10ml/kg，每日2次，同時(shí)以10%的乙醇為唯一飲料。（3）檢測(cè)指標(biāo)：14周后處死動(dòng)物，進(jìn)行肝病理組織學(xué)檢查?！驹u(píng)價(jià)】造模14周出現(xiàn)肝細(xì)胞脂肪變及乙醇性肝炎樣改變，可見(jiàn)肝臟間質(zhì)反應(yīng)性增生。39四、高脂飲食+乙醇灌胃動(dòng)物模型【基本原理】高脂飲食可導(dǎo)致脂肪代謝異常；乙醇所造成的脂肪在肝臟中的堆積主要由于乙醇及其氧化產(chǎn)物與肝內(nèi)脂質(zhì)代謝的相互作用，

23、乙醇以及活性氧在線粒體損傷中起主要作用?？赡芤蛩兀河坞x脂肪酸(FFA)輸送入肝增多； 肝臟合成FFA增加或TG合成增多； FFA在肝線粒體中的氧化減少； 肝臟分解脂肪的能力下降； 極低密度脂蛋白(VLDL)合成和分泌減少，致肝臟輸出TG的能力下降。40【操作步驟】（1）動(dòng)物：大鼠，雄性，200220g。（2）方法：以乙醇+脂肪乳劑灌胃，bid，6周。造模前3天以30%(v/v)乙醇5g/(kgd）適應(yīng)性灌胃，自第4天起，每3天乙醇的濃度增加5%，劑量增加0.6g/(kgd），至乙醇濃度55%，劑量8g/(kgd）止。脂肪乳劑灌胃量10ml/(kgd）不變。（3）觀察指標(biāo)：第6周末，麻醉，腹主動(dòng)

24、脈采血，取肝臟相同部位，制備肝勻漿，進(jìn)行病理組織學(xué)檢查。 檢測(cè)血清ALT、AST、ALP、TG、SOD、MDA、GSH-PX及肝勻漿TG、SOD、MDA、GSH-PX含量?！驹u(píng)價(jià)】6周后，大鼠出現(xiàn)典型脂肪肝病變：肝細(xì)胞腫脹，細(xì)胞內(nèi)充滿(mǎn)大小不一的脂滴。41 第4節(jié) 肝纖維化動(dòng)物模型肝纖維化是肝細(xì)胞發(fā)生壞死及炎癥刺激時(shí)，肝內(nèi)纖維結(jié)締組織異常增生的病理過(guò)程，它是慢性肝病重要的病理特征，也是進(jìn)一步向肝硬化發(fā)展的主要中間環(huán)節(jié)。理想的動(dòng)物模型應(yīng)當(dāng)是： 與人類(lèi)疾病特征相似； 病變有一定的發(fā)展過(guò)程，即有明顯的肝纖維化形成過(guò)程的分期； 形成率高，死亡率低； 造模方法簡(jiǎn)便易行。42 常用的肝纖維化動(dòng)物模型1. C

25、Cl4誘發(fā)的肝纖維化模型 【基本原理】 四氯化碳(CCl4)在肝P450酶作用,形成三氯甲基自由基和氯自由基，啟動(dòng)脂質(zhì)過(guò)氧化作用,損傷肝細(xì)胞。長(zhǎng)期反復(fù)多次給予CCl4 ，可致肝內(nèi)纖維增生，并逐漸加重形成肝硬化。43【操作步驟】(1)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：大鼠，雄性，100-150g。 (2)造模方法：將CCl4與橄欖油或精制花生油按l：l比例配比。按CCl4 1mlkg，ig 2次/周，持續(xù)10周。 (3)觀察指標(biāo)： 檢測(cè)血清總膽紅素、總蛋白、型膠原，型前膠原肽以及肝羥脯氨酸含量； 肝組織作HE染色和膠原纖維染色的病理組織學(xué)檢查。44【評(píng)價(jià)】 (1)灌胃法優(yōu)點(diǎn)在于CC4可直接經(jīng)門(mén)靜脈到達(dá)肝，1.5h肝內(nèi)即

26、可達(dá)最高水平，故宜采用這種給藥途徑。 (2)方法改進(jìn)：?jiǎn)渭僀Cl4造模方法簡(jiǎn)單，但時(shí)間較長(zhǎng)。改用ccl4+苯巴比妥的方法（誘導(dǎo)藥酶），縮短實(shí)驗(yàn)周期。動(dòng)物在飲用苯巴比妥(35mgd)，2周后，灌胃CCl4 ，開(kāi)始劑量為0.04ml，以后按體重調(diào)整CCl4用量，1次/周。 用此方法縮短時(shí)間，早期肝纖維化4-6周形成，8-10周形成肝硬化。是目前常用的方法。452.異種血清誘導(dǎo)的免疫性肝纖維化模型 【基本原理】 慢性肝病遷延不愈的本質(zhì)與免疫反應(yīng)有關(guān)。 異種血清作抗原，反復(fù)注射動(dòng)物，在體內(nèi)形成抗異種血清蛋白的抗體，通過(guò)免疫復(fù)合物的形成而造成肝免疫反應(yīng)，激發(fā)肝內(nèi)靜止的貯脂細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，并分泌膠

27、原，導(dǎo)致肝纖維化。46【操作步驟】 (1)血清蛋白皮下致敏階段：雄性大鼠，120-150g 。將人血白清蛋白用生理鹽水稀釋?zhuān)c等量的不完全弗氏佐劑乳化。大鼠皮下多點(diǎn)注射，每次注射0.5ml(內(nèi)含清蛋白4mg)，共4次。前2次間隔14天，第3、4次間隔10天。末次致敏后10天，從大鼠尾靜脈抽血1 ml，用間接ELISA法測(cè)定血清抗人血白清蛋白抗體，取抗體陽(yáng)性大鼠實(shí)驗(yàn)。47 (2)血清蛋白尾靜脈攻擊階段：大鼠經(jīng)尾靜脈注射白蛋白，2次/周。第1周注射劑量為2.5mg只，以后每次攻擊增加0.5mg，直至4.5 mg，維持此劑量，至少2個(gè)月。 【注意事項(xiàng)與評(píng)價(jià)】 (1)致敏結(jié)束后，選擇抗人血清清蛋白抗體

28、陽(yáng)性的大鼠作實(shí)驗(yàn)。 (2)攻擊階段中所用血清蛋白的劑量影響模型形成時(shí)間和死亡率，增大血清蛋白劑量，可使實(shí)驗(yàn)周期縮短，但增加動(dòng)物的死亡率。483.豬血清誘導(dǎo)的免疫性肝纖維化。方法：新鮮豬血，350g離心20min，制得血清，濾過(guò)除菌，-20保存。Ip 豬血清0.5ml(約含30mg蛋白質(zhì))，每周2次，共8周。該方法簡(jiǎn)便，實(shí)驗(yàn)周期較短。注射豬血清4周即見(jiàn)肝內(nèi)膠原纖維形成纖維束，8周后纖維化的動(dòng)物數(shù)增多，第1 2周，即停止注射豬血清4周后，仍有明顯的纖維間隔存在，分割肝小葉形成假小葉。494.膽總管結(jié)扎致肝纖維化(肝硬化)動(dòng)物模型 【基本原理】 肝外或肝內(nèi)膽管梗阻導(dǎo)致繼發(fā)性膽汁性肝硬化。采用膽總管結(jié)

29、扎，在狗、大鼠、兔、猴等動(dòng)物中制作出實(shí)驗(yàn)性繼發(fā)性膽汁性肝硬化模型。主要用于肝硬化的血流動(dòng)力學(xué)研究。50【操作步驟】(1)動(dòng)物：雜種狗，12-2 1 kg。 (2)實(shí)驗(yàn)方法：無(wú)菌上腹正中切口，抬高肝緣，拉開(kāi)十二指腸，分離膽總管2-3cm，穿刺抽出膽汁為準(zhǔn)。在近十二指腸處和近膽囊處用4號(hào)絲線各結(jié)扎兩道，從中切斷膽總管。肌注青霉素80萬(wàn)u天，3天，防感染。51(3)血流動(dòng)力學(xué)檢查：結(jié)扎10周后，禁食12h。戊巴比妥鈉靜脈麻醉(25mgkg)，分別插入導(dǎo)管：經(jīng)股動(dòng)脈插管監(jiān)測(cè)平均動(dòng)脈壓(MAP)及心率(HR)；經(jīng)股靜脈插管至下腔靜脈監(jiān)測(cè)下腔靜脈壓(ICVP)；經(jīng)腸系膜靜脈插管至門(mén)靜脈。測(cè)門(mén)靜脈壓(Ppv

30、)；經(jīng)右頸外靜脈插管至肝靜脈，測(cè)定肝靜脈壓(FHVP)，嵌塞肝靜脈壓(WHVP)及肝靜脈壓力梯度(HVPG)。52【注意事項(xiàng)與評(píng)價(jià)】(1)插管前于管內(nèi)預(yù)先注入肝素防止凝血。各項(xiàng)指標(biāo)均輸入多道生理記錄儀同步記錄。(2)膽總管結(jié)扎肝硬化動(dòng)物模型制作方法簡(jiǎn)單、周期較短。但有時(shí)膽管再通，組織學(xué)發(fā)生逆轉(zhuǎn)，膽汁過(guò)度淤積及死亡率高。535.D-GalN致肝纖維化模型動(dòng)物：大鼠，150-200g,雌雄兼用。方法：（1）生理鹽水配成10%的溶液, ip 250mg/kg, 一天一次。每周6次。（2）5個(gè)月，肝小葉出現(xiàn)紊亂, 增生的膽管及纖維母細(xì)胞向四周成星狀伸展;（3）6個(gè)月后,肝小葉結(jié)構(gòu)完全紊亂,被分割成多個(gè)

31、小結(jié)節(jié),周?chē)薪Y(jié)締組織包繞。 【評(píng)價(jià)】溶液配制簡(jiǎn)便, 但該模型亦存在周期長(zhǎng)等不足。546.乙醇誘導(dǎo)的肝纖維化模型【基本原理】乙醇代謝產(chǎn)物乙醛對(duì)肝臟產(chǎn)生直接損害，其中肝臟使輔酶I(NAD)轉(zhuǎn)變?yōu)檫€原性輔酶I(NADH)，NAD/NADH比例下降使三羧酸循環(huán)受抑制，脂肪氧化減弱，肝內(nèi)脂肪酸合成增多，超過(guò)肝臟處理能力，形成脂肪肝，最終形成肝纖維化。（1）動(dòng)物：大鼠，180220g，雌雄兼用。 55方法：以低脂肪（占總熱量的7%）、高蛋白（占熱量的13%），并含一定的膽堿和糖類(lèi)（占熱量的41%）的飼料喂養(yǎng)。起初3日給予大鼠2%的蔗糖溶液自由飲用，然后在2%的蔗糖溶液中加5%乙醇(v/v)，以后每隔4日

32、提高乙醇濃度5%直至15%，其后改為每周增加5%的乙醇濃度直至乙醇的終濃度為40%。造模16周出現(xiàn)肝腺泡III區(qū)輕度脂肪變，25周時(shí)肝脂肪變加重，并伴有肝細(xì)胞壞死、門(mén)管區(qū)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和中央靜脈周?chē)w維化?！咀⒁馐马?xiàng)與評(píng)價(jià)】（1）雌性造模大鼠肝脂肪變高于雄性，但肝病理學(xué)改變并無(wú)性別差異。（2）通過(guò)食用固體食物和以乙醇溶液作為飲料，飲食組成比例與人類(lèi)接近，與人類(lèi)乙醇性肝損傷相接近。567.二甲基硝胺（DMN）誘導(dǎo)的肝硬化【基本原理】二甲基硝胺具有肝毒性、細(xì)胞毒性和免疫毒性，長(zhǎng)期給大鼠可導(dǎo)致肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞發(fā)生廣泛壞死、纖維組織蓄積、肝臟萎縮、血清蛋白濃度下降、總膽紅素升高、血小板數(shù)減少等而導(dǎo)致肝纖維化、

33、肝硬化。57【操作步驟】 （1）動(dòng)物：大鼠，雄性，180200g。（2）方法：ip 1%DMN生理鹽水溶液，10mg/kg，1周1次。34周后開(kāi)始出現(xiàn)肝纖維化；注射5周后，肝臟有肝實(shí)質(zhì)纖維化的彌散性小結(jié)節(jié)分布；第6、7周時(shí)大鼠肝酷似人的肝硬化?！咀⒁馐马?xiàng)與評(píng)價(jià)】（1）此模型與人類(lèi)肝硬化早期改變及膠原纖維沉積相似，可作為篩選抗纖維化藥物模型。（2）此模型癌變率較高。（3）環(huán)境污染嚴(yán)重。588.復(fù)合因素建立肝纖維化模型 【基本原理】高脂乳劑富含多不飽和脂肪酸，易發(fā)生過(guò)氧化反應(yīng)產(chǎn)生自由基和醛類(lèi)物質(zhì)，加速非乙醇性脂肪肝的形成。而CCl4 在肝內(nèi)經(jīng)混合功能氧化酶作用形成三氯甲基自由基，通過(guò)引發(fā)活性氧自由

34、基的產(chǎn)生，啟動(dòng)脂質(zhì)過(guò)氧化作用，導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷，誘導(dǎo)肝纖維化產(chǎn)生。富含多不飽和脂肪酸的花生油通過(guò)激活肝內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，促進(jìn)CCl4引起的大鼠肝損傷，兩者協(xié)同，可加速脂肪性肝纖維化的形成。59【操作步驟】 （1）動(dòng)物：大鼠，雄性，200220g。（2）方法：以高脂乳劑灌胃（1次/天），同時(shí)配以40%CCl4花生油溶液1ml/kg作背部后側(cè)皮下注射（2次/周）；每天給以足量的18%蔗糖溶液，自由飲用。（3）檢測(cè)血清ALT、AST、透明質(zhì)酸、層粘連蛋白、型膠原、型前膠原肽以及肝羥脯氨酸含量; 肝組織作HE染色和膠原纖維染色的病理組織學(xué)檢查。 60【評(píng)價(jià)】（1）復(fù)合因素作用于動(dòng)物，可以縮短造模時(shí)間，提

35、高成功率。（2）6周可見(jiàn)肝細(xì)胞點(diǎn)狀及點(diǎn)灶狀壞死、匯管區(qū)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、周?chē)w維輕度增生等早期纖維化癥狀表現(xiàn)；8周表現(xiàn)出肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，肝索排列紊亂，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，間質(zhì)纖維組織增生等明顯的肝纖維化癥狀。61第5節(jié) 離體大鼠肝灌流方法 【基本原理】 離體大鼠肝灌流技術(shù)是在麻醉狀態(tài)下用外科手術(shù)使肝形成體外循環(huán)，由蠕動(dòng)泵將氧飽和的特定灌流液恒速壓入循環(huán)管道，流經(jīng)過(guò)濾裝置、加溫裝置、門(mén)靜脈套管到肝，從上腔或下腔靜脈流出，流出液可取樣進(jìn)行分析或再流回貯液池進(jìn)行再循環(huán)。在一段時(shí)間內(nèi)使離體肝維持其正常的生理和生化功能，在人工控制劑量和排除整體影響的條件下，動(dòng)態(tài)地研究藥物及其他化學(xué)物質(zhì)在肝的代謝規(guī)律及其對(duì)肝功能的

36、影響。62【實(shí)驗(yàn)材料】（1）灌流儀：灌流儀有以下幾個(gè)組成部分：蠕動(dòng)泵與醫(yī)用硅橡膠管系統(tǒng)，貯液槽與氣體交換裝置，控制灌流系統(tǒng)的隔水式恒溫裝置，可除去灌流液中破碎細(xì)胞或其他凝集物的過(guò)濾裝置。（2）灌流介質(zhì)：人造灌流液進(jìn)行灌流。 1）無(wú)紅細(xì)胞的人造灌流液。 2）含紅細(xì)胞的灌流液。63【操作步驟】（ 1）動(dòng)物及手術(shù)：大鼠，200250g。ip戊巴比妥鈉50mg/kg，腹腔U型剪開(kāi)，將腹腔內(nèi)臟器移向大鼠左側(cè)，即可見(jiàn)膽管及肝門(mén)靜脈；先插入膽管導(dǎo)管，并固定；然后在門(mén)靜脈近肝端與幽門(mén)靜脈分支之間穿入一手術(shù)絲線，打一活套，然后插入門(mén)靜脈插管，迅速固定，立即開(kāi)始灌流，打開(kāi)上、下腔靜脈，沖去肝內(nèi)殘血；將肝完整無(wú)損地

37、分離出來(lái)，置灌流儀中灌流。 雙向灌流需在插入門(mén)靜脈插管灌流后，結(jié)扎下腔靜脈，打開(kāi)胸腔，由上腔靜脈插入另一套管，再分離出整個(gè)肝。2）臟器灌流：將肝移到灌流儀的臟器托盤(pán)上，先用灌流液沖洗肝內(nèi)殘存血液。調(diào)整灌流速度，檢查流出液速度，保持灌流液能通暢流出。64【注意事項(xiàng)與評(píng)價(jià)】（1）手術(shù)過(guò)程要迅速、仔細(xì)，保持肝被膜完整，盡量不要污染肝。整個(gè)手術(shù)要求在1015min內(nèi)完成，門(mén)靜脈插管時(shí)，斷血時(shí)間不超過(guò)12min。（2）在大鼠離體肝灌流中，各項(xiàng)條件一經(jīng)選定便應(yīng)保持恒定，以維持肝的穩(wěn)定活力。一般灌流溫度為37，灌流液PO2至少45mmHg，灌流速度視不同灌流介質(zhì)而不同。65第6節(jié)大鼠肝細(xì)胞原代培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)方法

38、【基本原理】大鼠肝細(xì)胞分離方法是在肝離體灌流技術(shù)中引進(jìn)膠原酶，藉膠原酶消化肝細(xì)胞間組織而達(dá)到分散肝細(xì)胞的目的。然后再經(jīng)分離純化而得到所需用的肝細(xì)胞或非實(shí)質(zhì)細(xì)胞，進(jìn)行原代培養(yǎng)。66【操作步驟】 (1)肝細(xì)胞的分散：先用無(wú)鈣灌流液作預(yù)灌流，沖去殘血，除去或減少肝細(xì)胞間的鈣離子，以減少細(xì)胞間的粘著力。然后再用含鈣的膠原酶灌流液灌流，以消化細(xì)胞間質(zhì)而分散肝細(xì)胞。67 1)動(dòng)物手術(shù)：大鼠麻醉，背位固定。剝?nèi)ジ共科つw，75酒精消毒腹膜，無(wú)菌剪開(kāi)，內(nèi)臟移至左側(cè)，暴露肝門(mén)靜脈和下腔靜脈。離肝入口1-1.5cm處將肝門(mén)靜脈以及下腔靜脈與周?chē)M織分離開(kāi)，各穿一根手術(shù)棉線，打一活套備用。并經(jīng)下腔靜脈注射0.06肝素

39、鈉生理鹽水溶液0.50.6ml。將靜脈插管沿已分離的肝門(mén)靜脈插入，使針頭前端達(dá)左右肝靜脈分支交匯處，迅速結(jié)扎棉線，固定門(mén)靜脈插管。立即開(kāi)始灌流。 68 2)預(yù)灌流：經(jīng)無(wú)菌過(guò)濾，37和混合氣體(9502，5C02)飽和的無(wú)鈣灌流液灌流，剪斷下腔靜脈。灌流速度從慢至快，最后保持在4050mlmin。打開(kāi)胸腔，前腔靜脈管處系一棉線，從右心房處插管至前腔靜脈處，然后扎緊手術(shù)絲線，以防針管脫落。隨之將后腔靜脈處的棉線扎緊，迫使灌注液改由前腔靜脈插管處流出。先作在位灌流數(shù)分鐘，然后邊灌流邊切斷肝與周?chē)M織的聯(lián)系，將肝移置肝托盤(pán)內(nèi)繼續(xù)灌流。不要損傷肝包膜。灌流液約500ml。693)酶灌流：換用37的通人0

40、2的膠原酶灌流液。膠原酶的濃度一般約為0.05左右。pH7.5，含鈣而不含鎂，含有機(jī)緩沖劑(如HEPES)。灌流速度仍維持4050mlmin。膠原酶價(jià)貴，可設(shè)計(jì)循環(huán)灌流裝置以節(jié)省用酶量。如果灌流通暢，則肝顏色均勻。由于肝細(xì)胞間質(zhì)被消化，灌流液進(jìn)入細(xì)胞間隙，因而可見(jiàn)到肝逐漸腫脹?？筛鶕?jù)經(jīng)驗(yàn)，肉眼觀察肝腫脹程度來(lái)選擇最佳灌流時(shí)間。一般酶灌流約需815min。4)分散肝細(xì)胞：取下肝，將之移至盛有適當(dāng)培養(yǎng)液(DMEM)的平皿中，撕去肝包膜后，輕輕振搖肝，肝細(xì)胞即可散落于培養(yǎng)液中而成肝細(xì)胞懸液。70 (2)肝細(xì)胞的純化 1)肝細(xì)胞的純化：在錐形瓶肝細(xì)胞懸液37振蕩培養(yǎng)15min。細(xì)胞碎片、庫(kù)普弗細(xì)胞等則

41、為由損傷細(xì)胞排出的粘性物質(zhì)粘結(jié)成小塊，可過(guò)濾時(shí)除去；完整的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞則從外形不規(guī)則漸變?yōu)閳A形，因而更加分散，也更易于通過(guò)濾網(wǎng)。 振蕩培養(yǎng)結(jié)束后立即將錐瓶置冰水中冷卻，用雙層尼龍網(wǎng)(200目)過(guò)濾。濾液4C。200rmin離心3-5min，棄-上清，同上離心三次，培養(yǎng)液重懸，得到絕大部分為肝細(xì)胞懸液。71 (4)肝細(xì)胞的培養(yǎng)：作短時(shí)間培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)可將適當(dāng)稀釋的肝細(xì)胞于合適的小試管內(nèi)作振蕩培養(yǎng)。 如需作較長(zhǎng)時(shí)培養(yǎng)，則要選用大小合適的培養(yǎng)皿加入適量的肝細(xì)胞，于C02培養(yǎng)箱內(nèi)(5%C02與95空氣)進(jìn)行單層細(xì)胞培養(yǎng)。如采用經(jīng)過(guò)處理的塑料培養(yǎng)皿，則約經(jīng)1.5-2h培養(yǎng)細(xì)胞即可貼壁；如采用未經(jīng)處理的玻璃培養(yǎng)

42、皿，則需經(jīng)8h左右肝細(xì)胞方能完全貼壁。72【注意事項(xiàng)】(1) 灌流過(guò)程中如果肝顏色不均勻或出現(xiàn)花斑，即表明灌流不暢。灌流不暢時(shí)不僅細(xì)胞問(wèn)質(zhì)消化不夠，減少分散的細(xì)胞產(chǎn)量，而且分散所得細(xì)胞的活率和功能也差。缺氧/壓力增高都會(huì)使肝細(xì)胞損傷。灌流不暢的可能原因有：肝位置不佳致血管扭曲；插管插入過(guò)深，或插管尖頭的斜面過(guò)長(zhǎng)，堵塞了門(mén)脈血管的分支；灌流液中存在小顆粒物質(zhì)或微小氣泡而堵塞小血管；麻醉過(guò)深或手術(shù)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，或麻醉前動(dòng)物過(guò)度緊張、應(yīng)激反應(yīng)等兒茶酚胺類(lèi)分泌過(guò)多等因素使血管收縮。(2)灌流液必須含有足夠的緩沖劑系統(tǒng)，以保證酶灌流過(guò)程中pH維持在最適范圍。73 第7節(jié) 大鼠肝星狀細(xì)胞及 庫(kù)普弗細(xì)胞原代培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)方法 【基本原理】大鼠肝星狀細(xì)胞(HSC)及庫(kù)普弗細(xì)胞(KC)分離方法是在肝離體灌流技術(shù)中，利用鏈霉蛋白酶裂解肝細(xì)胞、膠原酶解除肝非實(shí)質(zhì)細(xì)胞間的連接、DNA酶降解DNA，形成較為完全的單細(xì)胞懸液，根據(jù)HSC和KC密度的不同，采用密度梯度離心的方法分離出HSC和