水質(zhì)生物毒性測量中藻類光合熒光參數(shù)與初始生物量的關(guān)系

1、水質(zhì)生物毒性測量中藻類光合熒光參數(shù)與初始生物量的關(guān)系微藻作為水生環(huán)境的初級生產(chǎn)者，個體小、繁殖快，對毒性反應(yīng)敏感，是評價污染化學品生物毒性極其重要的工具1-2。但廣泛使用的藻類生物測試指南，“淡水藻類和藍細菌，生長抑制試驗”（OECD 201）規(guī)定的指數(shù)生長測試至少需要72 h3，無法滿足水質(zhì)安全預(yù)警和污染物應(yīng)急監(jiān)測的需求。熒光動力學方法作為一種非破壞性、非侵入性的技術(shù)，可在幾分鐘內(nèi)獲悉光合系統(tǒng)狀態(tài)4，在實時檢測和水安全應(yīng)用方面具有潛在應(yīng)用價值5。該技術(shù)提供了藻類光合活性的直接信息，早期在除草劑（光合抑制劑）上進行了大量的研究6，現(xiàn)在也被用于測試其他化學品的毒性，如重金屬7-8、多環(huán)芳烴9等。

2、通過監(jiān)測藻類熒光動力學變化過程可獲取與光合系統(tǒng)密切相關(guān)的一系列光合熒光參數(shù)。這些參數(shù)對應(yīng)著光合作用電子輸運流的不同過程，快速反映有毒物質(zhì)對光合系統(tǒng)的影響，是理想的生物毒性測試終點。目前基于這些參數(shù)的毒性數(shù)據(jù)也非常多，但由于毒性測試方案的不同，導(dǎo)致產(chǎn)生的毒性數(shù)據(jù)有較大差異10。因此，有必要進行相關(guān)測試條件的分析，減少實驗室間的可變性11-12。在生長抑制試驗中，因為需要生物量的積累，每個細胞的毒物可用性取決于毒物的初始濃度和細胞密度，初始生物量會顯著影響藻類毒性試驗的結(jié)果，所以“淡水藻類和藍細菌，生長抑制試驗”（OECD 201）中對初始微藻生物量有明確要求。SINGH P K等也推薦使用較低生

3、物量的藻樣來進行藻類生長抑制毒性測試13。然而，這一結(jié)論在以光合熒光參數(shù)作為毒性測試終點時是否適用，至今無相關(guān)研究或可靠數(shù)據(jù)可證明。熒光動力學技術(shù)本質(zhì)上是采用光學探測器來監(jiān)測微藻體內(nèi)的葉綠素熒光信號變化，所以本文以葉綠素濃度作為生物量的衡量，以蛋白核小球藻作為受試對象，分析在敵草隆短期暴露下，作為毒性測試終點的光合熒光參數(shù)與初始生物量的關(guān)系，為基于光合熒光參數(shù)的生物毒性快速檢測方法建立提供重要依據(jù)。1 材料與方法1.1藻種培養(yǎng)與溶液配制蛋白核小球藻（C.pyrenoidosa， FACHB-5）為中國淡水水域的一種常見綠藻，具有分散均勻、不易粘壁的特性。因此本研究以蛋白核小球藻為受試藻種，采購

4、于中國科學院水生生物研究所淡水藻種庫。該藻種培養(yǎng)在恒溫搖床（MQD-S3R）中進行，光源為白色冷熒光燈管，培養(yǎng)條件為：溫度251 、轉(zhuǎn)速120 rmin-1、光照強度120 molm-2s-1、光暗比12 h12 h。待藻液培養(yǎng)23天，達到對數(shù)生長期，以其開展實驗研究。采用藻類分析儀（ FluoroProbe，德國BBE公司）對培養(yǎng)至對數(shù)生長期的蛋白核小球藻進行葉綠素濃度（生物量）測量，并根據(jù)實驗需要以滅菌后的BGII培養(yǎng)基對藻液進行稀釋，獲取一系列不同生物量的藻液，以開展不同生物量蛋白核小球藻對敵草隆（3-（3，4-dichlorophenyl）-1，1-dimethylurea，DCMU）

5、響應(yīng)研究。由于脅迫物質(zhì)敵草隆（DCMU，阿拉丁（中國上海），純度99%）在水中溶解度很低，因此使用二甲基亞砜（DMSO，阿拉?。ㄖ袊虾＃?，純度99%）作為溶劑配制DCMU脅迫下蛋白核小球藻的待測樣品，最終單個樣品體積為50 mL，DCMU的濃度分別為0、1、2、5、10、20、40 gL-1（樣品中DMSO含量小于0.1%），所有樣品以同樣方式制得3份。1.2光合熒光參數(shù)獲取采用ACT2FastOcean FRR藻類熒光系統(tǒng)（英國CTG公司）對DCMU脅迫下不同蛋白核小球藻的待測樣品進行光合熒光參數(shù)測量，以分析DCMU對不同初始生物量蛋白核小球藻光合熒光參數(shù)的影響。該系統(tǒng)由FastOcean

6、快速重復(fù)率熒光儀和ACT2實驗室系統(tǒng)組成。測量過程中，激發(fā)光源選擇450 nm的LED，光化光設(shè)置從0到800 molm-2s-1共8個光強值，獲取待測樣品的快速光曲線（Fast Light Curve，F(xiàn)LC），并得到如表1所示的11個光合熒光參數(shù)，單個樣品測量周期約為3 min。表1由FRRf獲取的光合熒光參數(shù)14Table 1Photosynthetic fluorescence parameters obtained from FRRf14ParameterDescriptionF0Minimum fluorescence yield （measured at open reactio

7、n centres state）FmMaximal fluorescence output （measured at closed reaction centres state）FvVariable fluorescence yield，F(xiàn)v=Fm-F0Fv/FmThe maximum photochemical quantum yield of PSIIYieldThe effective quantum yield of PSII photochemical energy conversionMaximal light utilization coefficient， initial sl

8、ope of the rP-E curverPRelative PSII electron transfer rateEkThe onset of light saturationPSAbsorption cross section of PSII photochemistry （without ambient light）esTime constant associated with the re-opening of a closed RCII with an emptyQB siteJVPPSII flux per unit volume2 結(jié)果與討論2.1初始生物量變化時不同光合熒光參

9、數(shù)毒性響應(yīng)分析圖1（a）和圖1（b）為10 gL-1 DCMU短期脅迫下（1 h和3 h），不同初始生物量樣品對應(yīng)光合熒光參數(shù)的毒性響應(yīng)情況，以處理組與空白組的比值（球型）表示。其中灰色實線（100%）表示空白組，球型分布于實線上方，表明該參數(shù)受到促進作用；球型分布于實線下方，表明該參數(shù)受到抑制作用。柱形指示的是不同光合熒光參數(shù)在初始生物量變化情況下獲得毒性測試數(shù)據(jù)的相對標準偏差（Relative Standard Deviation，RSD）。圖1短期脅迫下，不同初始葉綠素濃度對應(yīng)的11個光合熒光參數(shù)對10 gL-1 DCMU的毒性響應(yīng)情況Fig. 1Under short-term str

10、ess， the toxic response of 11 photosynthetic fluorescence parameters corresponding to different initial chlorophyll concentrations to 10 ugL-1 DCMU由圖1可知，參數(shù)Fv/Fm、Yield、rP、PS以及es的毒性測試結(jié)果基本不隨蛋白核小球藻初始生物量的變化而變化，當葉綠素濃度在201 000 gL-1的區(qū)間內(nèi)變化時，10 gL-1 DCMU脅迫1 h與3 h時該六個參數(shù)測試結(jié)果對應(yīng)相對標準偏差RSD均低于5%，對應(yīng)平均值分別為2.74%與3.12%；

11、而參數(shù)Ek、F0、Fm、Fv和JVP，其測試結(jié)果則明顯受到初始生物量的影響，當葉綠素濃度在201 000 gL-1區(qū)間內(nèi)變化時，DCMU脅迫1 h與3 h時五個參數(shù)測試結(jié)果對應(yīng)相對標準偏差RSD均高于10%，對應(yīng)平均值分別為14.66%與17.27%。以上結(jié)果表明，當葉綠素濃度在201 000 gL-1的區(qū)間內(nèi)變化時，短期脅迫下，光合熒光參數(shù)Fv/Fm、Yield、rP、PS以及es對DCMU的毒性測試結(jié)果更為穩(wěn)定，不受測試樣品初始生物量的影響。2.2光合熒光參數(shù)與生物量的相關(guān)性分析為充分了解光合熒光參數(shù)與生物量（葉綠素濃度）的關(guān)系，分析參數(shù)與生物量的相關(guān)性是否對毒性響應(yīng)穩(wěn)定性造成影響，進一步

12、測試了當?shù)鞍缀诵∏蛟迦~綠素濃度在201 000 gL-1的區(qū)間內(nèi)變化時，未受脅迫狀態(tài)下蛋白核小球藻11個光合熒光參數(shù)數(shù)值隨葉綠素濃度變化的規(guī)律，并分別計算了同一光合熒光參數(shù)在不同藻生物量下的相對標準偏差RSD，結(jié)果如圖2。圖211個光合熒光參數(shù)數(shù)值隨葉綠素濃度的變化趨勢Fig.2The trend of 11 photosynthetic fluorescence parameters with chlorophyll concentration由圖2可知，11個光合熒光參數(shù)可分為兩類，第一類為Fv/Fm、Yield、rP、PS和es，其數(shù)值基本不隨葉綠素濃度的變化而變化，當葉綠素濃度在201

13、 000 gL-1范圍變動時，F(xiàn)v/Fm、Yield、rP、PS和es測得數(shù)值的相對標準偏差RSD分別為3.00%，3.66%，3.80%，3.67%，0.09%和7.74%，具有很好的一致性，說明這類參數(shù)只表征蛋白核小球藻的光合信息，與藻類生物量變化不相關(guān)。第二類參數(shù)為Ek、F0、Fm、Fv以及JVP，這些參數(shù)隨葉綠素濃度變化表現(xiàn)出一定的變化趨勢，其數(shù)值受生物量影響，其中Ek與葉綠素濃度呈負相關(guān)，F(xiàn)0、Fm、Fv以及JVP與葉綠素濃度呈現(xiàn)正相關(guān)，說明這些參數(shù)的數(shù)值變化除了包含光合系統(tǒng)信息，也反映了一定的生物量信息。結(jié)合2.1節(jié)所得結(jié)論，可知當初始生物量發(fā)生變化時，光合熒光參數(shù)與生物量的相關(guān)性

14、會影響毒性測試結(jié)果的穩(wěn)定，與生物量無關(guān)的第一類參數(shù)獲取的毒性測試結(jié)果更穩(wěn)定。2.3不同初始生物量對應(yīng)光合熒光參數(shù)的毒性劑量效應(yīng)分析穩(wěn)定敏感的毒性劑量效應(yīng)分析是水質(zhì)生物毒性測量的關(guān)鍵。由于涉及參數(shù)眾多，為篩選出能與毒物建立良好劑量效應(yīng)的參數(shù)，并針對該參數(shù)提出最佳的初始生物量區(qū)間，本研究以處理組與空白組的比值作為縱坐標，DCMU的濃度為橫坐標，利用Logistic函數(shù)建立了不同初始生物量對應(yīng)光合熒光參數(shù)的劑量效應(yīng)曲線，得到了對應(yīng)曲線的相關(guān)系數(shù)R2以及毒性數(shù)據(jù)EC20（產(chǎn)生20%效應(yīng)對應(yīng)的毒物濃度）、EC50（產(chǎn)生50%效應(yīng)對應(yīng)的毒物濃度），如表2。并以參數(shù)Fv/Fm、Fm為例，展示了DCMU脅迫下

15、，參數(shù)Fv/Fm、Fm及對應(yīng)的毒性數(shù)據(jù)EC20隨測試樣品初始生物量的變化趨勢，如圖3。表2不同初始生物量下光合熒光參數(shù)獲得DCMU相關(guān)毒性數(shù)據(jù) （gL-1）及劑量效應(yīng)曲線擬合相關(guān)系數(shù)R2Table 2DCMU-related toxicity data （gL-1） and dose-effect curve fitting effect （R2） obtained by photosynthetic fluorescence parameters under different initial biomassParameterInitial chlorophyll concentration

16、/gL-1Recommended concentration/（gL-1）410201002005001 0002 000Fv/FmEC504015.3315.5815.7515.3516.0516.6217.16102 000EC206.833.213.303.172.993.423.373.43R20.9870.9980.9990.9970.9970.99411YieldEC5010.767.317.136.836.616.746.638.56102 000EC203.331.721.631.681.661.731.952.10R20.9990.99710.98710.99810.996E

17、C5011.577.766.436.246.216.126.667.16102 000EC203.782.101.841.861.811.932.342.20R20.9990.9890.9990.98710.99410.998rPEC5010.967.847.136.836.616.716.648.54102 000EC203.331.751.661.681.641.731.962.21R20.9990.99610.99710.99810.996PSEC5018.904.324.294.083.803.953.803.46102 000EC203.651.281.021.171.271.221

18、.131.30R20.9880.9790.9980.9840.9820.9240.9000.976esEC508.945.134.8544.854.434.454.684.65102 000EC205.182.021.931.921.761.992.242.34R20.9890.9880.99910.99910.9990.999EkEC5040-40-EC2022.518-2.084 88R20.526-0.625F0EC508.117.856.275.492.252.352.66-2001 000EC202.162.432.532.5611.0011.00-R20.8760.8870.972

19、110.9930.991-FmEC5040404040404040-2001 000EC208.807.666.385.233.533.383.59-R20.8670.8340.8100.8790.9860.9830.962-FvEC5040404040404040402001 000EC2022.1015.7415.4214.7911.7010.439.788.40R20.9910.9840.9950.9860.9670.9520.9980.650JVPEC50-40-EC20-5.289-R2-0.666-“-” Indicates that the curve can not be fi

20、tted圖3參數(shù)數(shù)值及對應(yīng)DCMU毒性數(shù)據(jù)EC20隨初始葉綠素濃度的變化趨勢Fig. 3The value of the parameter and the corresponding DCMU toxicity data EC20 change trend with the initial chlorophyll concentration由表2可知，在DCMU脅迫下，第一類參數(shù)Fv/Fm、Yield、rP、PS、es均呈現(xiàn)出良好的劑量效應(yīng)關(guān)系（R20.9），第二類參數(shù)中只有F0、Fm以及Fv呈現(xiàn)出良好的劑量效應(yīng)關(guān)系（R20.9）。以EC50、 EC20以及R2作為主要的分析參考依據(jù)（R20

21、.9，EC50和EC20數(shù)值較低），給出了當以參數(shù)Fv/Fm、Yield、rP、PS、es、F0、Fm以及Fv作為DCMU毒性測試終點時測試樣品初始生物量的最佳范圍。對第一類參數(shù)Fv/Fm、Yield、rP、PS、es，最佳的藻類初始葉綠素濃度（生物量）范圍為102 000 gL-1，在此范圍內(nèi)所獲取的毒性數(shù)據(jù)EC20、EC50數(shù)值低且穩(wěn)定，符合2.1節(jié)所述結(jié)論，但是當初始葉綠素濃度為4 gL-1時，EC50與EC20明顯偏高，分析原因是由于藻種具有群體依賴性15，過低的生物量會影響藻種的光合生理狀態(tài)，本研究中也確實發(fā)現(xiàn)當葉綠素濃度降到4 gL-1，藻光合活性Fv/Fm發(fā)生了突降（圖3（a）。對第二類參數(shù)F0、Fm與Fv，最佳的藻類初始葉綠素濃度（生物量）范圍為2001 000 gL-1，在此范圍內(nèi)所獲取的毒性數(shù)據(jù)EC20、EC50數(shù)值低且穩(wěn)定。此外，當初始葉綠素濃度為2 000 gL-1，劑量效應(yīng)曲線的擬合效果較差；當初始葉綠素濃度在4100 gL-1范圍內(nèi)時，葉綠素濃度越低，EC50與EC