氨氧化微生物總結(jié)

1、氨氧化微生物的研究這篇文章是本人通過(guò)查閱文獻(xiàn)總結(jié)。氮循環(huán)在整個(gè)地球生態(tài)物質(zhì)循環(huán)中起著重要的作用，其中微生物在地球氮循環(huán)中扮演著關(guān)鍵的角色。，但目前為止，微生物氮代謝機(jī)制依然存在許多未解之謎。本文通過(guò)氨氧化微生物的發(fā)展歷史，現(xiàn)狀進(jìn)行了大致的概括，并進(jìn)一步概述了氨氧化微生物的生理特性，且對(duì)今后的氨氧化微生物研究重點(diǎn)進(jìn)行了一定的展望。氮循環(huán)是描述自然界中氮單質(zhì)和含氮化合物之間相互轉(zhuǎn)換過(guò)程的生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)循環(huán)。微生物在其中發(fā)揮了主要作用。氮循環(huán)主要由固氮、氨化、硝化、反硝化等過(guò)程組成。目前，氮化合物引起的水體污染和富營(yíng)養(yǎng)化日益加劇，已經(jīng)造成了生態(tài)破壞、資源匱乏、水環(huán)境污染等嚴(yán)重后果。生物脫氮技術(shù)能夠有

2、效地去除污染水體和富營(yíng)養(yǎng)化水體及底泥環(huán)境中的氮素，具有十分重要的意義和極大的實(shí)用價(jià)值。生物脫氮的理論基礎(chǔ)是微生物作用下的硝化作用和反硝化作用。硝化作用作為自然界氮循環(huán)的重要環(huán)節(jié)之一，是指nh4+或nh3被氧化為no2-至no3-的一系列生化反應(yīng)。亞硝化作用則是硝化作用從nh4+或nh3到no2-的反應(yīng)過(guò)程，是氮素循環(huán)的重要環(huán)節(jié),由氨氧化細(xì)菌(又被稱(chēng)為初級(jí)硝化細(xì)菌)、亞硝化細(xì)菌來(lái)完成。從氮轉(zhuǎn)化的角度來(lái)看，亞硝化細(xì)菌在生態(tài)圈中居于重要地位,它們轉(zhuǎn)化無(wú)機(jī)氨態(tài)氮為亞硝酸鹽氮，與氨化細(xì)菌、硝化細(xì)菌等其它微生物共同作用，推動(dòng)氮素循環(huán)的不斷進(jìn)行。作為生物脫氮硝化階段的重要限速步驟，受到廣泛關(guān)注。在第一株氨氧

3、化細(xì)菌(Ammonia-oxidizingbacteria，AOB)被成功分離的一個(gè)多世紀(jì)里，AOB都被認(rèn)為是唯一具有氨氧化能力的微生物，直到21世紀(jì)初，古菌氨單加氧酶a亞基基因(Ammoniamonooxygenasea-subunit，amoA)的發(fā)現(xiàn)以及氨氧化古菌NitrosopumilusmaritimusSCM1的分離培養(yǎng)，才使好氧氨氧化微生物從細(xì)菌域擴(kuò)展到古菌域。氨氧化古菌(Ammonia-oxidizingarchaea，AOA)的發(fā)現(xiàn)，重新激起了人們對(duì)氨氧化微生物的研究熱情。目前，在土壤、湖泊、河口、深海、污水處理池等多種環(huán)境中均發(fā)現(xiàn)了大量AOA和AOB的16SrRNA基因、a

4、moA基因。AOA和AOB的研究對(duì)環(huán)境保護(hù)、工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)等都具有重要意義。雖然好氧氨氧化微生物的生理學(xué)、生態(tài)學(xué)、基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)等方面的研究使我們對(duì)它們有了一定了解，但由于研究方法的限制及其分布的復(fù)雜性和對(duì)環(huán)境脅迫的敏感性，目前仍無(wú)法確定AOA和AOB對(duì)全球氮循環(huán)的相對(duì)貢獻(xiàn)，也尚不清楚如何調(diào)控它們的活性使其在生態(tài)修復(fù)、廢水處理等方面發(fā)揮重要作用。其生理生態(tài)學(xué)差異將有助于我們進(jìn)一步研究不同環(huán)境中AOA和AOB的群落組成和活性，但目前很少有文章將兩者進(jìn)行比較。氨氧化微生物1.1好氧氨氧化微生物1.1.1氨氧化古菌2008年，科學(xué)家們通過(guò)系統(tǒng)發(fā)生學(xué)和酶學(xué)分析，將包括氨氧化古菌在內(nèi)的部分泉古菌類(lèi)群重

5、新劃分成一個(gè)新門(mén)奇古菌門(mén)。根據(jù)16SrRNA和amoA基因的系統(tǒng)發(fā)育分析，目前已知的AOA劃分為groupI.la、groupI.lb、ThAOA和groupI.la-associated四個(gè)類(lèi)群。N.maritimusSMC1是第一株分離培養(yǎng)的氨氧化古菌，屬于groupI.1a類(lèi)群，它的發(fā)現(xiàn)使古菌的氨氧化功能得到證實(shí)，是好氧氨氧化微生物研究的重要里程碑。之后，人們又成功地從貧瘠土壤、淡水沉積物、農(nóng)田等多種環(huán)境中富集了groupI.1a菌株。最近，從地?zé)釡厝懈患腘itrosotenuisuzonensis擴(kuò)大了我們對(duì)這類(lèi)AOA分布的認(rèn)識(shí)。2008年，第一株groupI.1b氨氧化古菌Nit

6、rososphaeragargensis從熱泉微生物席中被分離培養(yǎng)。隨后又有多株groupI.1b中的AOA被富集或分離，其中NitrososphaeraviennensisEN76是第一株從土壤環(huán)境中分離培養(yǎng)的AOA，它的純培養(yǎng)為在土壤環(huán)境中廣布的groupI.1b類(lèi)群古菌的研究提供了模式生物，是中溫古菌研究的又一里程碑。Nitrosocaldusyellowstonii則代表了在高溫環(huán)境中廣泛存在的一個(gè)分支嗜熱AOA類(lèi)群ThAOA。2011年富集到的Nitrosotaleadevanaterra是目前唯一的專(zhuān)性嗜酸氨氧化微生物，隸屬于groupI.1a-associated類(lèi)群。酸性土壤約

7、占無(wú)冰陸地表面30%,并且其中的硝化反應(yīng)速率較高，是研究全球氮循環(huán)不可缺少的一環(huán)，所以這個(gè)發(fā)現(xiàn)為進(jìn)一步研究氮的生物地球化學(xué)循環(huán)提供了重要條件。除了上述已分離或富集培養(yǎng)的AOA之外，基于amoA基因克隆文庫(kù)的分析表明，自然環(huán)境中還存在大量未知AOA。2012年P(guān)ester等將從NCBI、IMG/M以及Camera3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得的所有古菌amoA序列用距離矩陣法、最大簡(jiǎn)約法和最大似然法3種方法建樹(shù)，劃分為5個(gè)簇，其中Nitrosopumilis、Nitrososphaera、Nitrosocaldus、Nitrosotaleacluster分別對(duì)應(yīng)已知AOA分類(lèi)中的groupI.la、group

8、I.lb、ThAOA和groupI.la-associated類(lèi)群，而Nitrososphaerasistercluster類(lèi)群中還未有AOA被描述。Nitrosopumiliscluster在海洋水體和沉積物AOA中占主導(dǎo)地位，而Nitrososphaeracluster則主要存在于土壤以及潮間帶、河口等低鹽環(huán)境中。1.1.2氨氧化細(xì)菌目前為止，已知的AOB均屬于卩-變形菌綱的亞硝化單胞菌屬(Nitrosomonas)、亞硝化螺菌屬(Nitrosospira)和丫-變形菌綱的亞硝化球菌屬(Nitrosococcus)。Purkhold等根據(jù)16SrRNA基因的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)將卜變形菌綱中的AOB

9、分為10個(gè)簇。Avrahami等根據(jù)amoA基因系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)將卜變形菌綱中的AOB分為12個(gè)簇,其簇與16SrRNA基因系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中的相對(duì)應(yīng)，并新增加了Nitrosospiracluster9-12。2010年Dang等又在此基礎(chǔ)上新劃分出3個(gè)簇Nitrosospiracluster13-15。其中，Nitrosospiracluster2、3、4、10、11、12及Nitrosomonascluster7是土壤中主要的氨氧化細(xì)菌類(lèi)群，土壤酸度及氨濃度是影響其分布模式的主要環(huán)境因子。Nitrosomonascluster6a則是淡水生態(tài)系統(tǒng)、廢水以及生物濾池中的主要類(lèi)群,在河口和近岸等受淡水、廢

10、水影響較大的低鹽環(huán)境中也有發(fā)現(xiàn)。海洋環(huán)境中存在大量Cluster13-15氨氧化細(xì)菌類(lèi)群：Cluster13主要分布在近岸海洋環(huán)境中；Cluster14在近岸和深海的高鹽度環(huán)境均有發(fā)現(xiàn)；而Cluster15則主要存在于近岸和河口，特別在河口環(huán)境中尤為常見(jiàn)。由于缺少相應(yīng)已培養(yǎng)的AOB，Cluster9-15在16SrRNA基因進(jìn)化樹(shù)上還無(wú)法找到與其對(duì)應(yīng)的分支，需要通過(guò)更多的純培養(yǎng)AOB和克隆序列來(lái)進(jìn)一步確定。在已純培養(yǎng)的AOB中，Nitrosomonaseuropaea作為研究好氧氨氧化微生物生理、生化和系統(tǒng)發(fā)育等方面的模式生物之一，是目前研究最多的氨氧化微生物。Nitrosococcusoce

11、ani是丫-變形菌綱中唯一在海洋環(huán)境中廣泛存在的種。2014年,Urakawa等又定義了一個(gè)新種Nitrosospiralacus，其標(biāo)準(zhǔn)菌株APG3分離自淡水湖沉積物，是一株耐寒、廣pH的陸源氨氧化細(xì)菌。這種具有獨(dú)特生境選擇的AOB為自然界中氨氧化微生物的微生物生態(tài)學(xué)研究提供了新的認(rèn)知。1.2厭氧氨氧化微生物厭氧氨氧化菌種類(lèi)到目前為止，科學(xué)家已經(jīng)從淡水、海水中找到了6種屬的厭氧氨氧化菌。從而也證明了厭氧氨氧化細(xì)菌廣泛存在于自然環(huán)境中。將其按鹽度可分為淡水氨氧化菌和海水氨氧化菌。將其按生長(zhǎng)特性可分為自養(yǎng)氨氧化菌和異氧氨氧化菌，厭氧氨氧化(anaerobicammoniumoxidation,A

12、nammox)菌為自養(yǎng)型細(xì)菌，可在缺氧條件下以氨為電子供體，亞硝酸鹽為電子受體，產(chǎn)生N2。已發(fā)現(xiàn)的厭氧氨氧化菌均屬于浮霉?fàn)罹?Planctomycetales)的厭氧氨氧化菌科(Anammoxaceae)，共6個(gè)屬，分別為CandidatusBrocadia、CandidatusKuenenia、CandidatusAnammoxoglobus、CandidatusJettenia、CandidatusAnammoximicrobiummoscowii及CandidatusScalindua。其中，CandidatusScalindua發(fā)現(xiàn)于海洋次氧化層區(qū)域，稱(chēng)之為海洋厭氧氨氧化菌，其余5個(gè)

13、屬均發(fā)現(xiàn)于污水處理系統(tǒng)中，稱(chēng)之為淡水厭氧氨氧化菌。厭氧氨氧化細(xì)菌對(duì)全球氮循環(huán)具有重要意義，也是污水處理中重要的細(xì)菌。表1厭竄氟氧化菌種類(lèi)CLriiiiLlitsl3nMdiiaittimiihmiilnrCjiiHlidjlu.kuriNiii;-ikIiillisudirtfiHTTST-器imrni-liir；4iniiiiHliuiiiiJixiiLg自莽LLi111h：iri1lllXk-MHII4HU1.S11Jlll|llll代謝途徑2.1氨氧化在AOB中，AMO催化氨的好氧氧化生成羥胺，羥胺被周質(zhì)的羥胺氧化還原酶(Hydroxylamineoxidoreductase，HAO)氧

14、化成亞硝酸鹽。具體反應(yīng)如下：(1)2H+NH3+2e-+O2NH2OH+H2O；(2)NH2OH+H2ONO2-+4e-+5H+o其中第二步生成的電子中有兩個(gè)電子用來(lái)補(bǔ)償?shù)谝徊椒磻?yīng)，剩下的兩個(gè)電子經(jīng)過(guò)電子傳遞鏈傳遞到末端氧化酶從而形成質(zhì)子動(dòng)力勢(shì)；(3)2H+l/2O2+2e-fH2O(圖A)。對(duì)于古菌N.maritimus的氨氧化作用化學(xué)計(jì)量學(xué)分析表明其產(chǎn)生亞硝酸根所需的氧氣和氨的相對(duì)量與AOB的相似，它們總反應(yīng)式為NH3+1.5O2NO2-+H+H2OoVajrala等通過(guò)穩(wěn)定同位素示蹤法發(fā)現(xiàn)N.maritimus的氨氧化過(guò)程中有NH2OH的產(chǎn)生和消耗并且伴隨著能量的產(chǎn)生，證明羥胺是其氨氧化

15、過(guò)程的中間產(chǎn)物，AOA中的氨氧化過(guò)程可能與AOB相似，但是目前AOA的具體氨氧化過(guò)程尚未探明。在已知的AOA的基因組中還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)類(lèi)似于AOB中的羥胺氧化還原酶基因hao,可能在AOA中存在未知的酶可代替HAO氧化羥胺。另外，也有觀點(diǎn)認(rèn)為古菌的AMO或其他酶催化反應(yīng)可能產(chǎn)生HNO，HNO被硝酰氧化還原酶(Nitroxyloxidoreductase,NxOR)氧化生成N02-。而且與AOB相比，AOA中沒(méi)有細(xì)胞色素c基因而是存在大量編碼多銅氧化酶和質(zhì)體藍(lán)素域蛋白的基因，這表明AOA的電子傳遞機(jī)制與AOB不同。(圖1是推測(cè))0H+HjOHemeCytoplasmPeriplasm.廠HemeNHa

16、0H+HjOHemeCytoplasmPeriplasm.廠HemeNHaOH+H30-Nitrite+目*CytCmB&2Oj+4H+HCO2UQH22ua4H+CytC55434,35NifritReductionCarnexlC&malfiAllNifritReductionCarnexlC&malfiAll5耐笛I甲3創(chuàng)|汕Fig.1.PraposdAOArespirator)-pathwayTextindbcatesthectescrib-Klpo如bbhydraxyhmineIbkjetertandarrows.)andnitrnxyl(gmnpathways.RedarrawHi

17、ndicatedectranflowmotinvolvedinamnwidoxidation.BlueshadingdenotesblueooDwr-ontainingproteins.Pinkbsxindicatespossiblealternatrresairaterj/eleclronHe*的orecontainingQandQH2presenttheoidisdjndeducedquinone欣憶resiKrtily-圖1;可能的AOA呼吸通路文本描述的是可能的羥胺(藍(lán)色的文字和箭頭)和亞硝基(綠色)通道。紅色箭頭表示沒(méi)有參與氨氧化的電子流。藍(lán)色的陰影表示藍(lán)色的含銅蛋白。粉紅色的盒子表

18、明可能的替代呼吸電子庫(kù)。含有Q和QH2的六邊形分別代表氧化和還原的醌池。2.2固碳通常認(rèn)為氨氧化微生物是能利用氨作為唯一能源、以CO2作為主要碳源的化能自養(yǎng)微生物，但是AOA和AOB在固碳方面存在重要差異。AOB通過(guò)卡爾文循環(huán)固碳，每固定1分子的CO2需消耗3分子的ATP和2分子的NADPH,據(jù)估計(jì)其產(chǎn)生的能量80%用來(lái)固碳。而AOA基因組中包含乙酰輔酶A/丙酰輔酶A羧化酶、甲基丙二酰輔酶A差向異構(gòu)酶和變位酶、4-羥基丁酸脫氫酶等酶的編碼基因，通過(guò)3-羥基丙酸/4-羥基丁酸(3-hydroxypropionate/4-hydroxybutyrate，3HP/4HB)途徑固碳。研究表明，AOA固

19、定CO2的方式最節(jié)能，固定等量CO2所消耗的能量是AOB的2/3,比擁有相似固碳途徑的泉古菌消耗的能量還要低,這為它們?cè)诠褷I(yíng)養(yǎng)環(huán)境中生存提供了條件。不同的固碳途徑對(duì)氨氧化微生物生態(tài)適應(yīng)性有重要影響：3HP/4HB途徑中固定的是HCO3-，而HCO3-是海洋環(huán)境中主要的碳素存在形式，這為AOA在海洋中的廣泛分布提供了條件；而卡爾文循環(huán)固定的是CO2，且在AOB的基因組中有碳酸酐酶編碼基因，可以將HCO3-轉(zhuǎn)化成CO2，因此AOB利用的無(wú)機(jī)碳源范圍更廣。2.3產(chǎn)N2O研究表明AOA和AOB都能產(chǎn)生N2O。在AOB中主要通過(guò)2種途徑生成N2O：在有氧條件下，羥胺在HAO的作用下氧化成NO,進(jìn)而形成N

20、2o；在低氧條件下，AOB主要通過(guò)硝化菌反硝化作用在亞硝酸鹽還原酶的作用下將亞硝酸還原成NO，再經(jīng)一氧化氮還原酶(Nitricoxidereductase，NOR)還原成N2O。與AOB不同，目前對(duì)于AOA產(chǎn)生N2O的代謝過(guò)程仍然存在爭(zhēng)議，因?yàn)樵贏OA的基因組中既缺少類(lèi)似于AOB中的hao基因，又缺少參與硝化菌反硝化作用的nor基因。Loscher等研究表明AOA可通過(guò)未知的中間產(chǎn)物在氨氧化過(guò)程中產(chǎn)生N2O。Jung等通過(guò)同位素示蹤證明土壤AOA富集物產(chǎn)生的N2O存在N2O、N2O、N2O3種形式，它們可能分別由氨氧化、硝化菌反硝化作用及兩個(gè)代謝途徑結(jié)合產(chǎn)生。而純培養(yǎng)的N.viennensis

21、可能通過(guò)混合形成機(jī)制產(chǎn)生N20,在這個(gè)過(guò)程中來(lái)源于亞硝酸的N原子與來(lái)源于氨或者氨氧化作用中間產(chǎn)物的N原子通過(guò)酶學(xué)反應(yīng)結(jié)合生成N20。具體過(guò)程如圖2所示。AOA和AOA和AOB產(chǎn)N2O的途徑Figure2PathwayleadingtoN2Oproductionof圖2AOAandAOB(modifiedfrom)2.4厭氧氨氧化的可能反應(yīng)機(jī)理在厭氧氨氧化反應(yīng)中，目前假設(shè)的機(jī)理為以亞硝酸鹽作為電子受體，氨氮作為電子供體，直接轉(zhuǎn)為氮?dú)?。具體過(guò)程為N02-在亞硝酸鹽還原酶的作用下被還原成NH2OH產(chǎn)生5個(gè)質(zhì)子，然后nh3和nh2oh在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)被一種膜包裹的聯(lián)胺水解酶（HH）催化氧化為N2H4,在細(xì)胞

22、質(zhì)內(nèi)聯(lián)胺氧化酶（HZO）繼續(xù)把N2H4轉(zhuǎn)化為N2。其中N2H4的4個(gè)電子被由細(xì)胞色素C作為電子載體傳遞給輔酶Q，緊跟著由細(xì)胞色素bcl再將其傳給聯(lián)氨氧化酶和亞硝酸還原酶（NR），于是開(kāi)始新一輪的厭氧氨氧化。聯(lián)胺氧化酶（HZO）是一種負(fù)責(zé)將NH3氧化成N2的酶。這些電子結(jié)合了亞硝酸鹽還原酶，把N02攝初轉(zhuǎn)化為羥胺。因?yàn)閰捬醢毖趸磻?yīng)受到02的強(qiáng)烈但可逆的抑制，所以不可能由AMO（氨的單氧化酶）產(chǎn)生NH2OH。厭氧氨氧化型新陳代謝發(fā)生在厭氧氨氧化體中，它是一種由梯狀含脂膜包裹成的內(nèi)隔間，它至今只有在厭氧氨氧化細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)。通過(guò)該模型還可以看出，在厭氧氨氧化過(guò)程中細(xì)胞質(zhì)中的質(zhì)子不斷被消耗，厭氧氨氧化體內(nèi)不斷產(chǎn)生質(zhì)子。在這個(gè)過(guò)程中最終導(dǎo)致質(zhì)子動(dòng)力的積累，這種積累會(huì)產(chǎn)生一種質(zhì)子驅(qū)動(dòng)力P,最后通過(guò)三磷酸腺苷酶用于啟動(dòng)ATP。應(yīng)用3.1好氧氨氧化應(yīng)用好氧氨氧化過(guò)程常與反硝化或厭氧氨氧化等過(guò)程耦合產(chǎn)生n2,起