實驗六PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳檢測教案(優(yōu)秀版)word資料

1、實驗六 PCR 產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳檢測教案（優(yōu)秀版）word 資料題 PCR 產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳檢測瓊脂糖是一種線性多糖聚合物，天然聚合長鏈狀分子，在沸水中溶解，45開始形成多孔性剛性濾孔，凝膠孔徑的大小取決于瓊脂糖的濃度，濃度越高，孔隙越小，其分辨能力就越強。DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動時有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)。（1）電荷效應(yīng)【等電點】當(dāng) DNA溶液 pH pI，+當(dāng) DNA溶液 pH=pI。溶解度最小。（2）分子篩效益觀察瓊脂糖凝膠中 DNA最常用的方法是利用熒光染料溴化乙錠進行染色。溴化乙錠是一種高度靈敏的熒光染色劑，用于觀察瓊脂糖凝膠中的DNA分子。溴化乙錠在紫外光照射下能發(fā)射熒光

2、，當(dāng)DNA樣品在瓊脂 DNA分子中的堿基對之間形成絡(luò)合物，這種絡(luò)合物在紫外光下發(fā)射的熒光要比單純的 DNA分子要強的多，便于DNA的檢測。三、實驗器材1.電泳儀北京市六一儀器廠，DYCZ-24DN型2.移液槍：5l3.微波爐4.錐形瓶：250ml6.容量瓶：1000ml四、實驗材料與藥品實驗材料：實驗五中雞血 DNA PCR產(chǎn)物1.DNA Marker作用：主要用途就是DNA 分子凝膠電泳時，加樣用做對比來檢測瓊脂糖凝膠是否有問題。通過其大小可以粗略估算樣品 DNA分子量的大小。商品信息：2000bp，50 次，紫色液體理化性質(zhì)：DNA Marker 是分子量不同的 DNA片段，主要成分 、甘

3、油、溴酚藍儲存：短期 4保存，長期-20保存。危害：避免與皮膚眼睛接觸。2. GoldView核酸染色劑EB）的新型核酸染料，其靈敏度與EB 相當(dāng)，使用方法與之完全相同，在100ml 瓊脂糖膠溶液中加入 5l 即可。在紫外透射光下雙鏈 DNA 呈現(xiàn)綠色熒光，也可用于染。商品信息：1ml/瓶理化性質(zhì)：儲存：室溫保存 2 年。危害：雖然未發(fā)現(xiàn) GoldView有致癌作用，但對皮膚、眼睛會有一定的刺激，操作時應(yīng)戴上手套?！臼褂梅椒ā?. 將100ml瓊脂糖凝膠溶液（濃度一般為 0.8%2%）在微波爐中融化。2. 加入5l，輕輕搖勻，避免產(chǎn)生氣泡。3. 冷卻至不燙手時倒膠，待瓊脂糖凝膠完全凝固后上樣電

4、泳。4. 電泳完畢在紫外燈下觀察?！咀⒁馐马棥?. 膠厚度不宜超過0.5cm，膠太厚會影響檢測的靈敏度。2. 加入 GoldView的瓊脂糖凝膠反復(fù)融化可能會對核酸檢測的靈敏度產(chǎn)生一定影響，但不明顯。作用：制備瓊脂糖凝膠原料，分離和鑒定核酸。商品信息：100g/瓶 90 35-40時形成良好的半固體狀的凝膠，這是它具有多種用途的主要特征和基礎(chǔ)。儲存：陰涼干燥處密閉儲存。危害：無4.三羥甲基氨基甲烷（Tris）作用：生物緩沖劑，用于凝膠電泳配置緩沖液。商品信息：500g/瓶理化性質(zhì)：是一種白色結(jié)晶或粉末。溶于乙醇和水，微溶于乙酸乙酯、苯，不溶于乙醚、四氯化碳，對銅、鋁有腐蝕作用，有刺激性的化學(xué)物

5、質(zhì)。儲存：有吸濕性，在陰涼干燥處密閉儲存。危害：對眼睛、皮膚、呼吸道有刺激作用。作用：TBE緩沖液成分之一。商品信息：分析純，500g/瓶醚類及香精油中，水溶液呈弱酸性。儲存：陰涼干燥處密閉儲存。危害：有刺激性。6.乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-2Na）作用：螯合Mg2+或 Mn2+離子DNase）活性，活性依賴于鈣離子，并能被鎂離子或二價錳離子激活。商品信息：瓶/250g。理化性質(zhì)：無味無臭或微咸的白色或乳白色結(jié)晶或顆粒狀粉末。溶于水，不溶于乙醇、乙醚，其水溶液 pH值約為5.3?？捎蒃DTA與氫氧化鈉和碳酸鈣作用制得。儲存：于陰涼、通風(fēng)的庫房。遠離火種、熱源。應(yīng)與氧化劑分開存放，切忌混儲。配

6、備相應(yīng)品種和數(shù)量的消防器材。儲區(qū)應(yīng)備有合適的材料收容泄漏物。危害：對粘膜和上呼吸道有刺激作用。對眼睛、皮膚有刺激作用。本品可燃，具刺激性。7. 6DNA LodingBuffer作用：第一，里邊的指示劑溴酚藍和二甲苯氰 FF起到指示的作用，顯示電泳的進程，以便我們適時終止電泳；第二，里邊的成分甘油可以加大樣品密度，使樣品密度大于TBE，從而沉降到點樣孔中，防止樣品飄出點樣孔。商品信息：5ml/瓶。含溴酚蘭、二甲苯青和甘油等，按5ul樣品加 1ul Buffer，混勻直接上樣。理化性質(zhì)：儲存：2-8兩年。危害：有刺激性。五、實驗試劑TBEPH8.0）緩沖液【5TBEPH8.0Tris 108g

7、+ 硼酸27.5g + 0.5M EDTA 20ml 定容到1000ml 高壓滅菌 4保存臨用時用水稀釋 10 倍 TBE緩沖液（PH8.0）【0.5M EDTAPH8.0）溶液】水800ml + EDTA-2Na 186.1g 劇烈攪拌 用 NaOH調(diào) pH值至8.0（約需20g NaOH顆粒） 定容至 1L 分裝后高壓滅菌備用。注意：EDTA-2Na 在 PH值接近8.0時才能完全溶解。2.1.0%瓊脂糖溶液瓊脂糖 0.5g +TBE緩沖液50ml 放入錐形瓶中混勻 微波爐中加熱溶解六、實驗步驟（一）1%瓊脂糖凝膠的制備1.選擇合適的凝膠托盤放置于制膠器的合適區(qū)域。瓶中，加入 100ml

8、TBE緩沖液。3.將錐形瓶放入微波爐中加熱使瓊脂糖充分溶解。5l GoldView核酸染色劑加入其中，搖晃充分混勻。5.待膠冷卻至 60度左右，將融化的瓊脂糖小心的倒入制膠器中，速度要快，再把梳子（試樣格）插入凝膠托盤兩邊槽內(nèi)。6.讓膠自然冷卻至完全凝固（約需20-30TBE 1-2mm應(yīng)除去。（二）加樣DNA Marker用移液槍加入凝膠的第一個孔中。6DNA LodingBuffer（每5ul產(chǎn)物加入 1ul），混勻后，用移液槍加入到樣品孔內(nèi)，每孔加2ul。3.蓋好上蓋，連接電泳儀電源與電泳儀之間的電泳導(dǎo)線，注意不要接錯正負極。4.調(diào)好電壓，打開電源開始電泳，根據(jù)指示劑遷移的位置，判斷是否中止電泳。切斷電源后，再取出凝膠。（三）凝膠紫外觀察：凝膠取出于紫外監(jiān)測儀或凝膠成像系統(tǒng)中觀察，照相，保存，記錄結(jié)果。七、注意事項1.瓊脂糖融化時，檔位不宜太高。2.制膠和加樣過程中要防治氣泡的產(chǎn)生。3.必須戴手套操作，嚴格注意防護。4.加樣時，Tip 頭不宜插入樣品孔太深，也不要穿破膠孔壁，否則樣品滲漏或DNA帶