臨床免疫學(xué)檢驗(yàn)-課件-第12章-免疫組織化學(xué)技術(shù)

1、第十二章 免疫組織化學(xué)技術(shù)第十二章 免疫組織化學(xué)技術(shù)（Immunohistochemistry Technique，IHCT）又稱免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)，是指用標(biāo)記的特異性抗體在組織細(xì)胞原位通過(guò)抗原抗體反應(yīng)和組織化學(xué)的呈色反應(yīng)，對(duì)相應(yīng)抗原進(jìn)行定性、定位、定量測(cè)定的一項(xiàng)免疫檢測(cè)方法。免疫組織化學(xué)技術(shù)的概念和特點(diǎn)（Immunohistochemistry Techniqu特點(diǎn)：將免疫反應(yīng)的特異性、組織化學(xué)的可見(jiàn)性、分子生物學(xué)技術(shù)的敏感性結(jié)合。借助顯微鏡（電子或熒光）、在細(xì)胞或亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)、檢測(cè)各種抗原（蛋白、多肽、酶、激素、病原體等）。結(jié)構(gòu)、功能與代謝的動(dòng)態(tài)觀察，為疾病診斷、機(jī)制研究提供有力手段。特點(diǎn)：分

2、類(lèi)：酶免疫組織化學(xué)技術(shù)熒光免疫組織化學(xué)技術(shù)免疫金（銀）組織化學(xué)技術(shù)親和組織化學(xué)技術(shù)免疫標(biāo)記電鏡組織化學(xué)技術(shù)分類(lèi)：第一節(jié) 酶免疫組織化學(xué)技術(shù)定義:是在一定條件下，應(yīng)用酶標(biāo)抗體(抗原)與組織或細(xì)胞標(biāo)本中的抗原(抗體)發(fā)生反應(yīng)，催化底物產(chǎn)生顯色反應(yīng)，通過(guò)顯微鏡識(shí)別標(biāo)本中抗原(抗體)的分布位置和性質(zhì)，也可通過(guò)圖像分析技術(shù)達(dá)到定量的目的。第一節(jié) 酶免疫組織化學(xué)技術(shù)定義:是在一定條件下，應(yīng)用酶標(biāo)抗體一、組織處理 常用的標(biāo)本有組織切片、組織印片和細(xì)胞涂片等。優(yōu)點(diǎn)：染色標(biāo)本可長(zhǎng)期保存，可用普通光鏡觀察結(jié)果，可觀察組織細(xì)胞的細(xì)微結(jié)構(gòu)。 一、組織處理 常用的標(biāo)本有組織切片、組織印片和細(xì)胞涂片等。二、技術(shù)分類(lèi)（一）

3、酶標(biāo)記抗體免疫組化技術(shù)（二）非標(biāo)記抗體酶免疫組化技術(shù)二、技術(shù)分類(lèi)（一）酶標(biāo)記抗體免疫組化染色定義:借助交聯(lián)劑的共價(jià)鍵將酶直接連接在抗體上，酶標(biāo)抗體與靶抗原反應(yīng)后，再通過(guò)對(duì)底物的特異性催化作用，生成不溶性有色產(chǎn)物，達(dá)到對(duì)抗原定性、定量、定位檢測(cè)的目的。常用的方法: 直接法 間接法（一）酶標(biāo)記抗體免疫組化染色定義:借助交聯(lián)劑的共價(jià)鍵將酶直接組織抗原第一抗體過(guò)氧化物酶直接法 直接法 HRP標(biāo)記在特異性抗體（第一抗體）上，抗原- 抗體 HRP復(fù)合物，加入底物顯色。有色物質(zhì)沉積在抗原抗體反應(yīng)部位，從而可對(duì)組織或細(xì)胞抗原進(jìn)行定位，定性，定量分析。特點(diǎn)：一步完成，方法簡(jiǎn)便、省時(shí)，專一性強(qiáng)，非特異染色輕，但敏

4、感性差，一種標(biāo)記抗體只能檢測(cè)一種抗原。組織抗原第一抗體過(guò)氧化物酶直接法 直接法特點(diǎn)：一步完成，方 間接法兩步法 HRP標(biāo)記在第二抗體即抗抗體， 抗原-特異性抗體-第二抗體 HRP復(fù)合物特點(diǎn)：敏感性較直接法高，一種標(biāo)記抗體能用于相應(yīng)動(dòng)物制備的多種特異性抗體，檢測(cè)多種抗原。但較直接法費(fèi)時(shí)，非特異染色稍重。 間接法兩步法特點(diǎn)：敏感性較直接法高，一種標(biāo)記抗體能用于間接法酶標(biāo)記抗體免疫組化間接法酶標(biāo)記抗體免疫組化（二）非標(biāo)記抗體酶免疫組化染色特點(diǎn):用酶免疫動(dòng)物，制備效價(jià)高、特異性強(qiáng)的抗酶抗體酶通過(guò)免疫學(xué)反應(yīng)與抗酶抗體及組織抗原上的第一抗體結(jié)合，最后經(jīng)酶分子催化底物的顯色反應(yīng)，達(dá)到對(duì)抗原的檢測(cè)避免了酶標(biāo)記

5、抗體對(duì)抗體的損傷，提高了方法的敏感性。主要有四種技術(shù)類(lèi)型：酶橋法PAP法雙橋PAP法堿性磷酸酶抗堿性磷酸酶法（APPAAP）法（二）非標(biāo)記抗體酶免疫組化染色特點(diǎn):主要有四種技術(shù)類(lèi)型：技術(shù)類(lèi)型1.酶橋法：抗酶抗體作為第三抗體（Ab3），通過(guò)第二抗體作橋抗體（Ab2），將結(jié)合在組織抗原上的第一抗體（Ab1）與第三抗體連接起來(lái)，最后形成酶聯(lián)的抗原-抗體復(fù)合物，底物顯色。底物+HRP+二抗/Ab2兔源一抗/Ab1Ag+兔源抗酶抗體/Ab3AgAgAg-Ab1-Ab2-Ab3-HRP復(fù)合物AgAg1.一抗和三抗都是兔源性，屬于雙抗原夾心法，都能與二抗連接2.三抗抗體酶再與HRP連接，避免了抗體的損傷和非

6、特異染色3.二抗在種屬上與一抗（抗原）和三抗（酶）存在免疫學(xué)反應(yīng)，二抗為羊抗兔IgG技術(shù)類(lèi)型1.酶橋法：抗酶抗體作為第三抗體（Ab3），通過(guò)第二 優(yōu)點(diǎn)： 敏感性較酶標(biāo)法有所提高 缺點(diǎn)：操作分四步，較復(fù)雜如果抗酶抗體與酶結(jié)合弱，在操作中酶常被沖洗掉如果抗酶抗體的非特異性成分與橋聯(lián)抗體結(jié)合，結(jié)果就與抗酶抗體競(jìng)爭(zhēng)橋抗的結(jié)合位點(diǎn)，也會(huì)影響方法的敏感性。 優(yōu)點(diǎn)：2. PAP法：1970年發(fā)現(xiàn)，是酶橋法的改良法。PAP法將酶橋法的第三抗體（抗酶抗體）與酶形成一種穩(wěn)定可溶性(PAP復(fù)合物) ：2個(gè)抗酶抗體+3個(gè)HRP(五角形結(jié)構(gòu)）+底物+二抗/Ab2兔源一抗/Ab1AgAg+兔源PAP復(fù)合物AgAgAg-A

7、b1-Ab2-PAP復(fù)合物技術(shù)類(lèi)型2. PAP法：1970年發(fā)現(xiàn)，是酶橋法的改良法。PAP法將特點(diǎn):要求第一抗與抗酶抗體的動(dòng)物種屬相同（兔源性） PAP復(fù)合物穩(wěn)定，酶不易洗脫，避免了酶橋法的弊端 PAP不存在游離的Ig,不易產(chǎn)生非特異染色，因此特異性、敏感性和重復(fù)性好。 特別適用石蠟切片中微量抗原的檢測(cè)或回顧性研究特點(diǎn):3.雙橋PAP法 基本原理:是在PAP法中通過(guò)兩次連接橋抗體和PAP而建立起來(lái)的，通過(guò)雙橋可結(jié)合更多的PAP復(fù)合物于抗原分子上。具有放大作用，適用于組織細(xì)胞微量抗原的檢測(cè)。技術(shù)類(lèi)型兩種放大原理A：重復(fù)橋聯(lián)抗體與PAP復(fù)合物中抗酶抗體未飽和抗原位置結(jié)合，主要機(jī)制。B：重復(fù)橋聯(lián)抗體

8、與第一抗體抗體未飽和抗原位置結(jié)合Ab1Ab2Ab33.雙橋PAP法技術(shù)類(lèi)型兩種放大原理A：重復(fù)橋聯(lián)抗體與PAP4. APAAP法：有些組織細(xì)胞富含內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，染色時(shí)就不宜使用HRP體系。用堿性磷酸酶代替HRP建立的堿性磷酸酶(AP)-抗堿性磷酶(AAP)法，簡(jiǎn)稱APAAP法，如骨髓。+底物二抗/Ab2兔源一抗/Ab1Ag兔源APAAP復(fù)合物AgAgAgAg-Ab1-Ab2-APAAP復(fù)合物技術(shù)類(lèi)型4. APAAP法：有些組織細(xì)胞富含內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，染色時(shí)四、酶免疫組化染色中的常用的酶及顯色底物（一）辣根過(guò)氧化物酶（HRP） 最常用底物二氨基聯(lián)苯胺（DAB)顯棕色。此外還有，氨基乙基卡巴

9、唑（AEC），產(chǎn)物呈橘紅色；4-氯-1-萘酚，反應(yīng)物為灰藍(lán)色。（二）堿性磷酸酶（ALP）偶氮偶聯(lián)反應(yīng)：底物-萘酚磷酸鹽，水解后與快藍(lán)與快紅形成深藍(lán)色或紅色沉淀物。靛藍(lán)四唑反應(yīng)：形成藍(lán)紫色沉淀。四、酶免疫組化染色中的常用的酶及顯色底物（一）辣根過(guò)氧化物酶HRP染色結(jié)果比AP染色結(jié)果保存時(shí)間長(zhǎng)；含有內(nèi)源性HRP的組織切片（淋巴組織和腫瘤組織）首選標(biāo)記酶為AP；AP和HRP結(jié)合可進(jìn)行雙重或3重免疫組化標(biāo)記。HRP和AP染色比較HRP染色結(jié)果比AP染色結(jié)果保存時(shí)間長(zhǎng)；HRP和AP染色比較CD68 胞漿陽(yáng)性ER 核陽(yáng)性E-鈣粘素 膜陽(yáng)性CD68 胞漿陽(yáng)性ER 核陽(yáng)性E-鈣粘素 膜陽(yáng)性五、酶免疫組織化學(xué)技

10、術(shù)的應(yīng)用提高病理診斷準(zhǔn)確性；癌基因蛋白的臨床應(yīng)用；對(duì)腫瘤細(xì)胞增生程度的評(píng)價(jià)，如Ki67為增殖細(xì)胞核抗原；腫瘤轉(zhuǎn)移和腫瘤分期 ；指導(dǎo)腫瘤靶向治療。五、酶免疫組織化學(xué)技術(shù)的應(yīng)用提高病理診斷準(zhǔn)確性；第二節(jié) 熒光免疫組化技術(shù)定義:采用熒光素標(biāo)記的已知抗體（或抗原）作為探針，檢測(cè)待測(cè)組織、細(xì)胞標(biāo)本中的靶抗原（或抗體），形成的抗原抗體復(fù)合物上帶有熒光素，在熒光顯微鏡下，分辨出抗原(或抗體）的所在位置及其性質(zhì)，并可利用熒光定量技術(shù)計(jì)算其含量。以達(dá)到對(duì)抗原(或抗體）物質(zhì)定位、定性和定量測(cè)定的目的。第二節(jié) 熒光免疫組化技術(shù)定義:采用熒光素標(biāo)記的已知抗體（或一 、標(biāo)本的制作標(biāo)本的類(lèi)型： 涂片和印片 組織切片 培養(yǎng)

11、的粘附細(xì)胞 懸浮細(xì)胞 活細(xì)胞標(biāo)本的保存 ： 標(biāo)本固定干燥后，最好立即檢測(cè) 保持干燥、置4甚至-20 以下保存一 、標(biāo)本的制作標(biāo)本的類(lèi)型：二、熒光免疫組化染色優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)便、特異性高 缺點(diǎn)：敏感度偏低、一種熒光抗體只能檢測(cè)一種抗原，抗體制備麻煩抗原標(biāo)記抗體標(biāo)本載玻片 直接法二、熒光免疫組化染色優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)便、特異性高 抗原標(biāo)優(yōu)點(diǎn)：較直接法靈敏，敏感性高510倍，標(biāo)記一種抗體可以鑒定多種抗原。缺點(diǎn)：非特異熒光、操作時(shí)間較長(zhǎng)間接法二、熒光免疫組化染色優(yōu)點(diǎn)：較直接法靈敏，敏感性高510倍，標(biāo)記一種抗體可以鑒定 用兩種熒光素分別標(biāo)記兩種不同的特異性抗體，對(duì)同一標(biāo)本中的相應(yīng)兩種抗原同時(shí)顯示兩種顏色的熒光。

12、 標(biāo)記抗體A抗原A抗原B標(biāo)記抗體B標(biāo)本載玻片雙標(biāo)記熒光免疫染色法二、熒光免疫組化染色 用兩種熒光素分別標(biāo)記兩種不同的特異性抗體，對(duì)同一標(biāo)本中的CD31，heart鸚鵡熱衣原體包涵體鑒定CD31，heart鸚鵡熱衣原體包涵體鑒定 三、熒光免疫組化技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：Ag和Ab的特異性與形態(tài)的檢查結(jié)合在一起。能做到快速、敏感、定位。缺點(diǎn)：對(duì)組織細(xì)胞進(jìn)行微細(xì)結(jié)構(gòu)的觀察做不到。標(biāo)本不能永久保存，熒光有自然消退現(xiàn)象，需及時(shí)觀察并照相。有非特異性熒光的干擾 三、熒光免疫組化技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：四、熒光免疫技術(shù)的應(yīng)用病原體檢測(cè)自身抗體檢測(cè)免疫病理檢測(cè)細(xì)胞表面抗體和受體檢測(cè)蛋白質(zhì)、激素、藥物、腫瘤標(biāo)志物、過(guò)敏原等

13、測(cè)定四、熒光免疫技術(shù)的應(yīng)用病原體檢測(cè)第三節(jié) 親合組織化學(xué)技術(shù)廣義的：抗原-抗體，植物凝集素-糖類(lèi)，生物素-親和素，SPA-IgG，陽(yáng)離子-陰離子，配體-受體親和組織化學(xué)（Affinity histochemistry）是利用兩種物質(zhì)之間的高度親合力而建立的一種方法。植物凝集素、生物素和葡萄球菌A蛋白等，都對(duì)某種組織成分具有高親和力的特點(diǎn)，可以與標(biāo)記物如熒光素、酶、同位素、鐵蛋白及膠體金等結(jié)合。采用熒光顯微鏡、酶加底物的顯色反應(yīng)、放射自顯影或電子顯微鏡，在細(xì)胞或亞細(xì)胞水平進(jìn)行對(duì)應(yīng)親和物質(zhì)的定位或定量。第三節(jié) 親合組織化學(xué)技術(shù)廣義的：抗原-抗體，植物凝集素-糖類(lèi)親和組織化學(xué)技術(shù)生物素-親和素法葡萄

14、球菌蛋白A法凝集素法生物素-鏈霉親和素法親和組織化學(xué)技術(shù)生物素-親和素法一、生物素-親合素法 生物素/Biotin: 即維生素H，是一種堿性蛋白，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單。咪唑酮環(huán)結(jié)合親和素戊酸側(cè)鏈結(jié)合抗體或其他分子親合素/Avidin: 抗生物素蛋白，天然親和素是四聚體，具有4個(gè)與生物素親和力極高的結(jié)合位點(diǎn)。鏈酶親和素/streptavidin,SA：由鏈霉菌屬細(xì)菌分泌的一種蛋白質(zhì)，與親和素有類(lèi)似的生物學(xué)特性，具有4個(gè)生物素分子結(jié)合位點(diǎn)。III噻吩環(huán)一、生物素-親合素法 生物素/Biotin: 即維生素H，是（一）親合素-生物素-過(guò)氧化酶復(fù)合物技術(shù)Avidin Biotin Peroxidase Compl

15、ex technique，ABC原理：預(yù)先按一定比例將親合素與酶標(biāo)生物素結(jié)合形成可溶性的ABC復(fù)合物。當(dāng)其與檢測(cè)反應(yīng)體系中的生物素化抗體（直接法）或生物素化第二抗體（間接法）相遇時(shí)，ABC中末飽和的親和素結(jié)合部位即可與抗體上的生物素結(jié)合，使抗原抗體反應(yīng)體系與ABC標(biāo)記體系連成一體進(jìn)行檢測(cè)。Ag-Ab-生物素-親和素-酶標(biāo)生物素（ABC)（一）親合素-生物素-過(guò)氧化酶復(fù)合物技術(shù)Avidin Bi待測(cè)抗原 非特異性抗原A-親合素 B-生物素 E-酶ABC 直接法原理示意圖（一）親合素-生物素-過(guò)氧化酶復(fù)合物技術(shù)Avidin Biotin Peroxidase Complex technique，A

16、BC待測(cè)抗原 A-親合素 B-生物素 E-酶ABC 直接ABC 間接法原理示意圖待測(cè)抗原非特異性抗原A-親合素 B-生物素 E-酶（一）親合素-生物素-過(guò)氧化酶復(fù)合物技術(shù)Avidin Biotin Peroxidase Complex technique，ABCABC 間接法原理示意圖待測(cè)抗原A-親合素 B-生物素 缺點(diǎn)：有些組織如肝、腎、白細(xì)胞、脂肪組織和乳腺等有內(nèi)源性生物素活性，需要對(duì)組織進(jìn)行預(yù)處理ABC復(fù)合物在中性時(shí)帶正電荷，容易與細(xì)胞核等帶負(fù)電荷結(jié)構(gòu)非特異結(jié)合；親合素為糖蛋白，可以與凝集素等碳水化合物結(jié)合。 優(yōu)點(diǎn)：敏感性高：橋聯(lián)放大作用特異性高一抗和二抗工作濃度低操作時(shí)間縮短可以多重標(biāo)

17、記（一）親合素-生物素-過(guò)氧化酶復(fù)合物技術(shù)Avidin Biotin Peroxidase Complex technique，ABC 缺點(diǎn)： 優(yōu)點(diǎn)：（一）親合素-生物素-過(guò)氧化酶復(fù)合物技術(shù)A（二）橋聯(lián)親合素-生物素技術(shù)Bridged Avidin-Biotin technique， BRAB原理：是以游離的親合素作為橋聯(lián)劑，利用親合素的多價(jià)性，將檢測(cè)反應(yīng)體系中抗原、生物素化抗體復(fù)合物與標(biāo)記生物素聯(lián)結(jié)起來(lái)，達(dá)到檢測(cè)反應(yīng)分子的目的。 最終形成的抗原-生物素化抗體-親合素-酶標(biāo)生物素復(fù)合物可積聚大量的酶分子；加入相應(yīng)酶作用底物后，即會(huì)產(chǎn)生強(qiáng)烈的酶促反應(yīng)，從而提高檢測(cè)的靈敏度。（二）橋聯(lián)親合素-生物

18、素技術(shù)Bridged Avidin-BRAB 直接法原理示意圖待測(cè)抗原 非特異性抗原A-親合素 B-生物素 E-酶Ag-Ab-生物素-親和素-酶標(biāo)生物素（二）橋聯(lián)親合素-生物素技術(shù)Bridged Avidin-Biotin technique， BRABBRAB 直接法原理示意圖待測(cè)抗原 A-親合BRAB 間接法原理示意圖待測(cè)抗原非特異性抗原A-親合素 B-生物素 E-酶（二）橋聯(lián)親合素-生物素技術(shù)Bridged Avidin-Biotin technique， BRABBRAB 間接法原理示意圖待測(cè)抗原A-親合素 B-生物素 （三）標(biāo)記親和素-生物素技術(shù)Labelled Avidin-bio

19、tin technique，LAB原理:以標(biāo)記親合素直接與免疫復(fù)合物中的生物素化抗體連接進(jìn)行檢測(cè)，Ag-Ab-生物素-親和素-酶。以測(cè)IL-2為例（三）標(biāo)記親和素-生物素技術(shù)Labelled Avidin特點(diǎn):相當(dāng)高的靈敏度，省略了加標(biāo)記生物素步驟，操作較BRAB法簡(jiǎn)便。間接LAB法采用生物素化第二抗體，可進(jìn)一步提高 檢測(cè)靈敏度。（三）標(biāo)記親物素-生物素技術(shù)特點(diǎn):（三）標(biāo)記親物素-生物素技術(shù)（四）鏈霉親合素-生物素法 (LSAB）原理：利用生物素結(jié)合的二抗與酶標(biāo)記的鏈霉親合素蛋白就組合成酶標(biāo)鏈霉親合素-生物素方法。（labelled streptavidin biotin technique,

20、LSAB）Ag-Ab1-Ab2-生物素-鏈酶親和素-酶（四）鏈霉親合素-生物素法 (LSAB）原理：利用生物素結(jié)合LSAB法具有幾大特點(diǎn)：敏感性高：酶標(biāo)記SA,可結(jié)合更多的生物素化的二抗，放大效應(yīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)ABC法，且分子量小，穿透力強(qiáng)，增加敏感性。低背景著色:等電點(diǎn)低（6-6.5），所帶正電荷少，減少非特異性吸附。操作時(shí)間縮短:ABC法需100min，減少到35min。一抗?jié)舛鹊停ㄋ模╂溍褂H合素-生物素法 (LSAB）LSAB法具有幾大特點(diǎn)：（四）鏈霉親合素-生物素法 (LSA二、葡萄球菌A蛋白法定義:葡萄球菌蛋白A/SPA是一種從金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁分離的蛋白質(zhì)，由于它能與多種動(dòng)物IgG的F

21、c段結(jié)合，用SPA標(biāo)記物（酶、熒光素、放射性物質(zhì)等）顯示抗原與抗體結(jié)合反應(yīng)的各種免疫檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。二、葡萄球菌A蛋白法定義:葡萄球菌蛋白A/SPA是一種從金黃SPA可以和人及多種動(dòng)物的IgG結(jié)合（人、豚鼠、兔、豬、小鼠、猴等），解決了不同動(dòng)物檢測(cè)時(shí)，需分別標(biāo)記相應(yīng)二抗的問(wèn)題；結(jié)合部位是Fc段，因此不會(huì)影響抗體的活性 ；具有雙價(jià)結(jié)合力，可結(jié)合兩個(gè)IgG分子。對(duì)IgG亞型的結(jié)合有選擇性，可能出現(xiàn)的假陰性結(jié)果。 SPA可結(jié)合人IgG1、2或4，但不結(jié)合IgG3。常用HRP標(biāo)記，染色程序基本同酶標(biāo)記抗體法，僅二抗改用SPA-HRP，Ag-Ab-SPA-HRP 。二、葡萄球菌A蛋白法SPA可以和人及多種動(dòng)物

22、的IgG結(jié)合（人、豚鼠、兔、豬、小鼠三、凝集素法凝集素 / lectin ：一類(lèi)從植物種子、無(wú)脊椎動(dòng)物和較高等動(dòng)物組織中提純的糖蛋白或結(jié)合糖的蛋白質(zhì)，可使紅細(xì)胞凝集故稱凝集素，具有與特定糖基專一結(jié)合的特性。凝集素法一方面利用凝集素可以與標(biāo)記物結(jié)合，另一方面又可以與細(xì)胞膜糖基結(jié)合所形成一種親合反應(yīng)。凝集素受體：存在細(xì)胞膜上的糖蛋白和糖脂中寡糖。是研究腫瘤細(xì)胞膜糖變化的理想工具。三、凝集素法凝集素 / lectin ：一類(lèi)從植物種子、無(wú)脊直接法是將標(biāo)記物直接標(biāo)記在凝集素上，與組織細(xì)胞相應(yīng)的糖蛋白或糖脂相結(jié)合。間接法是先將凝集素與組織細(xì)胞膜糖基結(jié)合，然后再用標(biāo)記的抗凝集素抗體與結(jié)合在細(xì)胞上的凝集素反

23、應(yīng)。糖-凝集素-糖法，這種方法是利用生物細(xì)胞膜的特殊糖基與凝集素結(jié)合后，再用標(biāo)記的已知糖基與其反應(yīng)，形成一個(gè)“三明治樣”的結(jié)合物。三、凝集素法直接法是將標(biāo)記物直接標(biāo)記在凝集素上，與組織細(xì)胞相應(yīng)的糖蛋白或第四節(jié) 免疫電鏡技術(shù)第四節(jié) 免疫電鏡技術(shù)一、免疫標(biāo)記電鏡技術(shù)的原理免疫電子顯微鏡技術(shù)（Immunoelectron Microscope， IEM）：是利用高電子密度的顆粒性標(biāo)記物（如膠體金、鐵蛋白等）標(biāo)記抗體，或用經(jīng)免疫組織/細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)能產(chǎn)生高電子密度產(chǎn)物，在電子顯微鏡下對(duì)高電子密度標(biāo)記的抗原（抗體）進(jìn)行亞細(xì)胞水平定位的技術(shù)。特點(diǎn):定位更為精確，可定位至細(xì)胞膜、細(xì)胞器 ；在探索病因、發(fā)病機(jī)制

24、、組織發(fā)生等方面有其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)。一、免疫標(biāo)記電鏡技術(shù)的原理免疫電子顯微鏡技術(shù)（Immunoe二、免疫標(biāo)記電鏡技術(shù)標(biāo)本的制備要求 保存良好的細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)，注意保持組織的抗原性；在組織固定與取材時(shí)選用固定劑不宜過(guò)強(qiáng)；選擇的試劑能順利穿過(guò)組織；在免疫染色方面，又分為包埋前染色、包埋后染色和超薄切片免疫染色三種。二、免疫標(biāo)記電鏡技術(shù)標(biāo)本的制備要求 保存良好的細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)，優(yōu)點(diǎn)切片染色前不經(jīng)過(guò)鋨酸后固定、脫水及樹(shù)脂包埋等過(guò)程，抗原未被破壞，易于獲得良好的免疫反應(yīng)；可在免疫反應(yīng)陽(yáng)性部位定位作超薄切片，提高電鏡下的檢出率；特別適用于含抗原量較少的組織；包埋前染色缺點(diǎn)：經(jīng)過(guò)一系列的免疫染色步驟，常出現(xiàn)一定的超

25、微結(jié)構(gòu)損傷。優(yōu)點(diǎn)包埋前染色缺點(diǎn)：經(jīng)過(guò)一系列的免疫染色步驟，常出現(xiàn)一定的超 組織標(biāo)本經(jīng)過(guò)固定、脫水及樹(shù)脂包埋、制成超薄切片后，再進(jìn)行免疫組化染色。包埋后染色優(yōu)點(diǎn)超微結(jié)構(gòu)保存較好，方法簡(jiǎn)便，陽(yáng)性結(jié)構(gòu)有高度的可重復(fù)性，還能在同一張切片上進(jìn)行多重免疫染色。缺點(diǎn)抗原活性在電鏡生物樣品處理過(guò)程中可能減弱甚至喪失。 組織標(biāo)本經(jīng)過(guò)固定、脫水及樹(shù)脂包埋、制成超薄切片后，再 將組織置于2.3mol/L蔗糖液中，以液氮速凍，在冰凍超薄切片機(jī)上切片，切片厚度可略厚于常規(guī)樹(shù)脂切片。超薄冷凍切片優(yōu)點(diǎn)不需經(jīng)固定、脫水、包埋等步驟，直接進(jìn)行免疫染色，所以抗原性保存較好，兼有包埋前和包埋后染色的優(yōu)點(diǎn)。 將組織置于2.3mol/

26、L蔗糖液中，以液氮速凍，在冰免疫膠體金染色法免疫膠體鐵細(xì)胞化學(xué)染色法酶免疫電鏡技術(shù)三、常用的免疫標(biāo)記電鏡技術(shù)免疫膠體金染色法三、常用的免疫標(biāo)記電鏡技術(shù)三、常用的免疫標(biāo)記電鏡技術(shù)（一）免疫膠體金染色法免疫膠體金技術(shù)是以膠體金作為示蹤標(biāo)志物應(yīng)用于抗原抗體檢測(cè)的一種新型的免疫標(biāo)記技術(shù)。三、常用的免疫標(biāo)記電鏡技術(shù)（一）免疫膠體金染色法免疫膠體金技分類(lèi)：1.透射電鏡（TEM) 根據(jù)染色步驟分直接法和間接法；根據(jù)標(biāo)記與包埋前后的關(guān)系，分為包埋前和后標(biāo)記法2.掃描電鏡(SEM) 根據(jù)膠體金能發(fā)射二次電子的能力，可用作標(biāo)記物。一般選20-75nm的顆粒，用于細(xì)胞表面成分研究。免疫膠體金染色法分類(lèi)：免疫膠體金染

27、色法應(yīng)用：細(xì)胞表面成份的研究；與冷凍蝕刻技術(shù)結(jié)合-細(xì)胞膜蛋白顆?；蚱渌こ煞葸M(jìn)行精細(xì)定位；電鏡原位雜交技術(shù)，能夠在超微水平上精確定出基因位點(diǎn)。應(yīng)用：用膠體金-SPA復(fù)合物-Ab-Ag 法觀察核糖體蛋白在染色質(zhì)中的分布，bar=0.5m研究細(xì)菌的菌毛（丁香假單胞菌）bar=0.5m用膠體金-SPA復(fù)合物-Ab-Ag 法觀察核糖體蛋白在染色質(zhì)（二）免疫膠體鐵細(xì)胞化學(xué)染色法 膠體鐵是一種陽(yáng)離子膠體，將抗體分子標(biāo)記上膠體鐵，通過(guò)普魯士藍(lán)反應(yīng)呈色，膠體鐵顆粒有一定大小，還具有一定電子密度，可用在電鏡和光鏡水平的抗原定位研究。（三）酶免疫電鏡技術(shù) 酶的高效催化作用，對(duì)底物反應(yīng)形成不同的電子密度，用電子顯微

28、鏡觀察，通過(guò)對(duì)酶的定位對(duì)抗原或抗體定位。（二）免疫膠體鐵細(xì)胞化學(xué)染色法 膠體鐵是一種陽(yáng)離子膠體第 五節(jié) 免疫組織化學(xué)技術(shù)的臨床應(yīng)用（自學(xué)）第 五節(jié) 免疫組織化學(xué)的基本過(guò)程包括：抗原的提取與純化；免疫動(dòng)物或細(xì)胞融合，制備特異性抗體以及抗體的純化；將標(biāo)記物與抗體結(jié)合形成標(biāo)記抗體；標(biāo)本的處理與制備；抗原抗體免疫學(xué)反應(yīng)以及標(biāo)記物呈色反應(yīng)；觀察結(jié)果。第六節(jié)免疫組織化學(xué)技術(shù)要點(diǎn)免疫組織化學(xué)的基本過(guò)程包括：第六節(jié)免疫組織化學(xué)技術(shù)要點(diǎn)（一）標(biāo)本的主要來(lái)源活體組織：各種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及人體活檢標(biāo)本；各種體液及穿刺液：直接涂片或離心沉淀；培養(yǎng)細(xì)胞：懸浮細(xì)胞離心沉淀作細(xì)胞涂片、 單層細(xì)胞直接涂片固定。一、標(biāo) 本 的 處

29、理（一）標(biāo)本的主要來(lái)源一、標(biāo) 本 的 處 理(二）標(biāo)本的固定與保存固定目的：良好的固定是免疫組織化學(xué)結(jié)果可靠的重要保證。固定的意義：防止細(xì)胞自溶、保持細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)、保持組織的抗原性、防止標(biāo)本脫落、去除脂質(zhì)、抑制細(xì)菌的繁殖。固定的原則：不損傷組織細(xì)胞的固有形態(tài)、結(jié)構(gòu)、抗原性和細(xì)胞膜的通透性；不干擾固定后的抗原與抗體的識(shí)別與結(jié)合。(二）標(biāo)本的固定與保存固定目的：良好的固定是免疫組織化學(xué)結(jié)果固定劑的選擇：必須根據(jù)其性質(zhì)及所進(jìn)行的組織化學(xué)反應(yīng)選擇適當(dāng)?shù)墓潭▌?蛋白質(zhì)類(lèi)抗原：乙醇或甲醇微生物類(lèi)抗原：丙酮或三氯化碳多糖類(lèi)抗原：10%福爾馬林固定類(lèi)脂豐富的組織：用有機(jī)溶劑處理單一固定液：甲醛、酒精等混合固

30、定液：如Bouin液、Zenker液等。Bouin液：苦味酸飽和液（1.22%）75 ml，福爾馬林25 ml，冰醋酸5ml。 (二）標(biāo)本的固定與保存固定劑的選擇：必須根據(jù)其性質(zhì)及所進(jìn)行的組織化學(xué)反應(yīng)選擇適當(dāng)?shù)目乖潭▌┕潭囟扰c時(shí)間蛋白質(zhì)95%乙醇室溫，315min免疫球蛋白丙酮4，30 min酶四氯化碳4，30 min激素1%多聚甲醛4，45 h細(xì)菌丙酮，甲醇室溫，310min病毒丙酮、無(wú)水乙醇、四氯化碳4，3060 min類(lèi)脂10%甲醛室溫，310min細(xì)胞懸液1%的多聚甲醛室溫，2 min各種抗原的固定方法抗原固定劑固定溫度與時(shí)間蛋白質(zhì)95%乙醇室溫，315min制片方法的評(píng)價(jià)：冰凍切

31、片：適用不穩(wěn)定的抗原（首選）石蠟切片：形態(tài)研究的主要方法?？捎^察細(xì)胞結(jié)構(gòu)的理想方法、陳舊切片的回顧性研究，可長(zhǎng)期保存(二）標(biāo)本的固定與保存取材固定脫水浸蠟包埋切片制片方法的評(píng)價(jià)：(二）標(biāo)本的固定與保存取材固定脫水浸蠟包埋切二、抗 原 的 保 存 與 修 復(fù)抗原修復(fù):使遮蔽的組織抗原決定簇重新暴露的方法，即抗原修復(fù)。常用的方法有： 酶消化法 鹽酸水解法 微波法 高壓鍋法 煮沸法不同方法適用不同類(lèi)型的抗原的修復(fù)，通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)探討合適的條件。二、抗 原 的 保 存 與 修 復(fù)抗原修復(fù):使遮蔽的組織抗原三、抗 體 的 處 理 與 保 存（一）抗體的選擇注意選擇具有高特異性、穩(wěn)定的優(yōu)質(zhì)抗體多克隆抗體：敏感

32、性較高、特異性相對(duì)較低，有交叉反應(yīng)，適用石蠟包埋的組織切片，單克隆抗體：特異性較高、敏感性相對(duì)較低三、抗 體 的 處 理 與 保 存（一）抗體的選擇注意選擇具（二）抗體的稀釋抗原抗體反應(yīng)要比例合適才能達(dá)到預(yù)期效果使用前根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出抗體的最佳稀釋度三、抗 體 的 處 理 與 保 存（二）抗體的稀釋抗原抗體反應(yīng)要比例合適才能達(dá)到預(yù)期效果三、抗（三）抗體的保存分裝密封保存，避免對(duì)抗體的污染并注明標(biāo)記（批號(hào)、名稱、效價(jià)、量）根據(jù)廠家提供的保存條件保存避免反復(fù)凍融而使抗體效價(jià)降低三、抗 體 的 處 理 與 保 存（三）抗體的保存分裝密封保存，避免對(duì)抗體的污染三、抗 體 的四、結(jié) 果 判 斷（一）設(shè)

33、立對(duì)照實(shí)驗(yàn)：陽(yáng)性對(duì)照：已知陽(yáng)性抗原，證明顯色程序正確。陰性對(duì)照：不含已知抗原的標(biāo)本為對(duì)照，主要目的排 除假陽(yáng)性?？瞻讓?shí)驗(yàn)：用PBS代替第一抗體，排除內(nèi)源性的生物素和內(nèi)源性酶。替代試驗(yàn)：用同種動(dòng)物免疫前或非免疫血清，替代第一抗體，排除異嗜性抗原所致的非特異性反應(yīng)。吸收或阻斷試驗(yàn)：過(guò)量的已知抗原與第一抗體反應(yīng)，結(jié)果應(yīng)為陰性或弱陽(yáng)性，確認(rèn)天然抗原引起的抗原抗體反應(yīng)必須設(shè)立對(duì)照四、結(jié) 果 判 斷（一）設(shè)立對(duì)照實(shí)驗(yàn)：必須設(shè)立對(duì)照 陽(yáng)性細(xì)胞顯色分布類(lèi)型： 細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核、細(xì)胞膜表面陽(yáng)性細(xì)胞顯色：抗原分布于細(xì)胞核（二）陽(yáng)性結(jié)果四、結(jié) 果 判 斷 陽(yáng)性細(xì)胞分布分為: 散在、 灶性、彌散分布 顯色深淺反映抗原存在的數(shù)量，可以作為定性、定位、定量的依據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞呈灶性分布 陽(yáng)性細(xì)胞顯色分布類(lèi)型：陽(yáng)性細(xì)胞顯色：抗原分布于細(xì)胞核（二）（三）陰性結(jié)果和抗原不表達(dá)陰性結(jié)果抗原不表達(dá)；只有少數(shù)細(xì)胞陽(yáng)性（只要是在抗原所在部位）也要視為陽(yáng)性表達(dá)；不能認(rèn)為個(gè)別細(xì)胞陽(yáng)性而不作陽(yáng)性看待。四、結(jié) 果 判 斷（三）陰性結(jié)果和抗原不表達(dá)陰性結(jié)果抗原不表達(dá)；四、結(jié) 果（三）特異性染色與非特異性染色特異性染色非特異性染色分布在特定的部位, 具結(jié)構(gòu)性（細(xì)胞質(zhì)、核及細(xì)胞表面）無(wú)分布規(guī)律，常出現(xiàn)在切片邊緣、刀痕或皺折部位及壞死或擠壓的細(xì)胞區(qū)域 由于細(xì)胞內(nèi)抗原含量不同，所以顯色不均一不限于單個(gè)細(xì)胞，而是累及一片細(xì)胞，均勻顯色陽(yáng)性與陰性