高效液相色譜法測定乳制品中的三聚氰胺

1、 1高效液相色譜法測定液態(tài)奶中三聚氰胺的含量1華南師范大學(xué)化學(xué)與環(huán)境學(xué)院，廣州 5100062華南師范大學(xué)化學(xué)與環(huán)境學(xué)院分析化學(xué)爭辯所，廣州 510006摘 要 為建立液態(tài)奶中三聚氰胺含量的高效液相色譜測定方法，通過超聲提取，離心，有機濾膜凈化， C18 液相色譜柱4.6150m5 A液：0.9508g辛烷磺酸鈉+1.0640g1L溶液B70%A+30%。1.0mL/mi40239 n2y=58093x+1060.1，R2=0.99860.01561.0mg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。樣品在三氯乙酸和乙腈體積比=3：1 101.63%。關(guān)鍵詞 高效液相色譜，三聚氰胺，液態(tài)奶引言三聚氰胺儀器檢測

2、方法概述三聚氰胺(melamine)是一種重要的氮雜環(huán)有機化工原料1，俗稱蜜胺。因其含氮量大于66%，且我國通常承受“凱氏定氮法”估測食品和飼料中的蛋白含量，三聚氰胺常被不法商 國家質(zhì)量監(jiān)視檢驗檢疫總局與國家標(biāo)準化治理委員會聯(lián)合公布 GB/T 22388-20222HPL液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法LC-MS/MS及氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法GC-MS三種檢測方法與標(biāo)準。三聚氰胺的檢測方法還包括酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法等。高效液相色譜法HPLC高效液相色譜法的定量限為2.0mg/kg，具有操作簡潔、靈敏度高，測定周期短等優(yōu)點。 復(fù)性依據(jù)選擇的檢測條件如檢測器、色譜柱等的不同而產(chǎn)生變化。試樣用三氯乙酸溶

3、液-乙腈提取，經(jīng)陽離子交換固相萃取柱凈化后，用高效液相色譜測 定，外標(biāo)法定量。本方法的定量限為2.0mg/kg。在添加濃度2mg/kg10mg/kg 濃度范圍內(nèi)，回收率在80%110%之間，相對標(biāo)準偏差小于10%。液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法LC-MS/MS液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法定量限為0.01mg/kg，是一種利用液相色譜法分別與用質(zhì)譜法定性 和乙腈的淋洗作用下在色譜柱上實現(xiàn)分別 具有更強定性功能，且檢出限更低。-質(zhì)譜/質(zhì)譜法測定和確證，外標(biāo)法定量。本方法的定量限為0.01mg/kg。在添加濃度0.01mg/kg0.5mg/kg 濃度范圍內(nèi)，回收率在80%110%之間，相對標(biāo)準偏差小于10%。氣相色

4、譜-質(zhì)譜聯(lián)用法GC-MS GC-MS/MS*E-mail:* 2氣相色譜-質(zhì)譜法相較其他方法，靈敏度更高，其檢出限為0.05mg/kg。檢測原理是：原化試劑進展硅烷化衍生，衍生產(chǎn)物承受選擇離子監(jiān)測質(zhì)譜掃描模式(SIM)或多反響監(jiān)測質(zhì)譜掃描模式(MRM)，用化合物的保存時間和質(zhì)譜碎片的豐度比進展定性分析，外標(biāo)法定量。 素，因此更多爭辯人員優(yōu)先選用高效液相色譜法測定三聚氰胺。 掃描模式SI或多反響監(jiān)測質(zhì)譜掃描模式MR，用化合物的保存時間和質(zhì)譜碎片的-GC-MS 法的定量限為0.05mg/kg，氣相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法GC-MS/MS 法0.005mg/kg。GC-MS 法在添加濃度0.05mg/kg

5、2mg/kg 濃度范圍內(nèi)，回收率在 70%110%之間，相對標(biāo)準偏差小于 10%； GC-MS/MS 法在添加濃度0.005mg/kg1mg/kg 濃度范圍內(nèi)，回收率在90%105%之間，相對標(biāo)準偏差小于10%。酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法ELISA 方法的原理是通過抗體、抗原相互結(jié)合，使參加底物顯色從而來篩選樣品是否含ELISA 法一般只用于大批樣品檢測三聚氰胺殘留量時的初步篩選ELISA 10-6以上5Erica6ELISA 試劑盒分析寵物食品三聚氰胺的殘留量，回收率為88%，方法檢出限為9ng/mL。試驗原理高效液相色譜法的定量限為2.0mg/kg2 復(fù)性依據(jù)選擇的檢測條件如檢測器、色譜

6、柱等的不同而產(chǎn)生變化。試樣用三氯乙酸溶液-乙腈提取，其中包括超聲提取、沉淀蛋白、過濾，得到測試液后， 大于 2%3；承受多點校正外標(biāo)法進展定量分析，待測樣液中三聚氰胺的響應(yīng)值應(yīng)在標(biāo)準曲線2mg/kg10mg/kg 80%110%之間2。試驗局部試劑與儀器試劑色譜純色譜純色譜純CAS 108-78-01，純度大于99.025%28其余試劑均為分析純，試驗用水均為純潔水怡寶飲用水。甲醇水溶液50：準確量取50mL甲醇和50mL水，混勻備用。三氯乙酸溶液10g/：準確稱取1.0g 三氯乙酸，用水溶解后，轉(zhuǎn)移至100mL中，定容至刻度，混勻備用。乙酸鋅溶液10g/：準確稱取1.0g乙酸鋅，用水溶解后，

7、轉(zhuǎn)移至100mL定容至刻度，混勻備用。硫酸鉛飽和溶液：準確稱取1.0g 硫酸鉛，用水溶解后，轉(zhuǎn)移至100mL 容量瓶中，定容至刻度，混勻備用。0.9508g 1.0640g 980mL 水溶解，調(diào)整pH=3.0 1000mL塑料試劑瓶中，定容至刻度，混勻備用。三聚氰胺標(biāo)準儲藏液2.5mg/m：準確稱取0.2500準確到0.1m100mL 50%2.5mg/mL 的4避光保存。儀器SHIMADZU SPD-M10A VP0.0001 4000 r/min50mL；一次性注射器，10mL；有機濾膜，0.45m；離心管；玻璃棒；膠頭滴管。試驗步驟樣品處理參照GB/T 22388-2022220mL準

8、確至0.1m兩份于50mL0.1g準確至 0.1mg的三聚氰胺標(biāo)準品，另一份則不加；15mL10g/L 5mL 10 min。靜置2min，在離心機4000 r/min 10min。上清液經(jīng)三氯乙酸溶潮濕的濾紙過濾后，取10mL 濾液準確0.1mL25mL 0.45m 有機濾膜過濾，上機測試。只轉(zhuǎn)變提取劑中三氯乙酸和乙腈的參加比例，參加 10mL10g/L 三氯乙酸溶液和 10mL乙腈。其他步驟不變，以同樣的方法進展樣品處理。15mL10g/L 5mL 乙腈，15mL 飽和硫酸5mL乙腈。其他步驟不變，以同樣的方法進展樣品處理。高效液相色譜測定度分別為：0.0156 mg/mL、0.0312

9、mg/mL、0.0625 mg/mL、0.1250 mg/mL、0.250 mg/mL、1.00 mg/mL，濃度由低到高進樣檢測，以峰高-濃度作圖，得到標(biāo)準曲線回歸方程。稀釋后再進樣分析。結(jié)果計算。試樣中三聚氰胺的含量由色譜數(shù)據(jù)處理軟件處理得出，計算回收率。儀器工作參數(shù)色譜柱：依利特C18液相色譜柱4.6150m5 A 沖液0.9508g 辛烷磺酸鈉+1.0640g 檸檬酸，配成 1L 溶液；B 液：甲醇；色譜條件： 70%A+30%B。流速：1.0mL/min。柱溫：40。波長：239 nm。進樣量：2L。結(jié)果與爭辯三聚氰胺標(biāo)準品色譜圖2.3 色譜條件下，得到三聚氰胺標(biāo)準樣品的色譜圖，如圖

10、1 20min，9.7min左右，有較明顯的拖尾現(xiàn)象。圖1三聚氰胺標(biāo)準品色譜圖標(biāo)準曲線與線性范圍2L標(biāo)準曲線，結(jié)果如表1、圖2 所示?；貧w方程為y=58093x+1060.1，相關(guān)系數(shù)R2=0.9986，說0.01561.0mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。表1峰高與三聚氰胺質(zhì)量濃度的線性關(guān)系c(mg/mL)0.01560.03120.06250.12500.2501.00峰高12172300431791721678258800圖2峰高與三聚氰胺質(zhì)量濃度的線性關(guān)系不同提取條件下測定樣品添加三聚氰胺標(biāo)準品的回收率選擇待測樣品添加同一水平的標(biāo)準品，分別依據(jù)4 種不同的樣品處理方法進展提取凈化，測定三聚

11、氰胺的質(zhì)量濃度，計算回收率，結(jié)果見表22 可以看出，4 個樣品的回收101.63%，85.97%，44.60%，90.64%。其中，由三氯乙酸和乙腈體積比=3：1組成的提取劑的回收率最高，為 101.63%。*E-mail:*4 5分析可能緣由如下：第一，蒙牛液態(tài)奶本身含有局部三聚氰胺。其次，先加提取劑，再參加 2L，使測試 結(jié)果偏高。三氯乙酸、乙腈和鉛離子都是沉淀蛋白的試劑，三氯乙酸能使蛋白質(zhì)分子的肽鏈斷裂， 乙酸可能滲入分子內(nèi)部而使之較難被完全除去 好。因此，三氯乙酸+乙腈組成的提取劑是最好的選擇，但其混合比例還有待進一步爭辯。2 不同提取條件下測定樣品添加三聚氰胺標(biāo)準品的回收率n = 1

12、樣提取劑體積比本底值加標(biāo)量保存時間測得值回收率品/(mg/mL)/(mg/mL)/min/(mg/mL)/%1=3：1nd0.787210.3880.8000101.632乙酸鋅：乙腈=3：1nd0.796810.3970.685085.973硫酸鉛：乙腈=3：1nd0.796010.6990.355044.604=1：1nd0.803210.3410.728090.643.4說明：nd 表示未檢出。樣品檢測結(jié)果將制備好的樣品用所建立的樣品處理和高效液相色譜方法測定3 所示。由表3 法測定，說明市場上蒙牛液態(tài)奶質(zhì)量保證可能較好。3 樣品檢測結(jié)果n=1樣品提取劑體積比10.656nd10.947

13、nd9.786nd10.656nd10.947nd9.786nd2乙酸鋅：乙腈=3：110.620nd10.835nd3硫酸鉛：乙腈=3：19.393nd4三氯乙酸：乙腈=1：110.773nd保存時間/min 9.38910.347測得值/(mg/mL)ndnd說明：nd 表示未檢出。References邵靜群,溫家琪,徐世文.三聚氰胺毒理學(xué)進展J.現(xiàn)代畜牧獸醫(yī),2022,12:52-54.國家質(zhì)量監(jiān)視檢驗檢疫總局.GB/T 22388-2022 原料乳與乳制品中三聚氰胺檢測方法S.北京: 中國標(biāo)準出版社,2022.全國飼料工業(yè)標(biāo)準化技術(shù)委員會.NY/T 1372-2022 飼料中三聚氰胺的

14、測定S.北京:中國標(biāo)準出版社,2022.王浩,劉艷琴,曹紅,等.固相萃取與高效液相色譜聯(lián)用測定寵物食品中三聚氰胺J.分析化學(xué),2022,2(36):273.馬麗莎,鄭光明,朱平,等.食品中三聚氰胺與三聚氰酸殘留檢測爭辯進展J.中國獸藥雜志,2022,44(8):48-51.ERICA E G. Detection of melam ine using commercial enzym elinkedimm unosorbent a ssaytechnologyJ. Journal of Food Protection,2022, 71(3): 590-594.于超,馬軍秋,白素琴.乳及乳制品中三聚氰胺檢