免疫組化技術(shù)1課件

1、免疫組織化學(xué)染色技術(shù)Email:免疫組織化學(xué)染色技術(shù)Email:組織化學(xué)染色技術(shù) Histochemistry Technique 觀察對象組織、細胞 使用工具普通顯微鏡 熒光顯微鏡形態(tài)與結(jié)構(gòu)組織化學(xué)染色技術(shù) Histochemistry Techni蘇木素曙紅蘇木素曙紅免疫組織化學(xué)染色技術(shù) Immunohistochemistry Technique指用標(biāo)記的特異性抗體在組織細胞原位通過抗原抗體反應(yīng)和組織化學(xué)的呈色反應(yīng)，對相應(yīng)抗原（目的蛋白）進行定性、定位、定量測定的一項免疫檢測方法。免疫組織化學(xué)染色技術(shù) ImmunohistochemistrImmunohistochemistry Tec

2、hnique特定蛋白（抗原）Immunohistochemistry Technique（透膜）（透膜）授課提綱 基質(zhì)標(biāo)本的制作 熒光免疫組化技術(shù) 酶免疫組化技術(shù) 相關(guān)問題與解決方案授課提綱 基質(zhì)標(biāo)本的制作授課提綱 基質(zhì)標(biāo)本的制作 熒光免疫組化技術(shù) 酶免疫組化技術(shù) 相關(guān)問題與解決方案授課提綱 基質(zhì)標(biāo)本的制作標(biāo)本類型 組織標(biāo)本 冰凍切片 石蠟切片 細胞標(biāo)本 體外培養(yǎng)細胞（單層細胞、懸浮細胞） 體液細胞（涂片）標(biāo)本類型 組織標(biāo)本固定與保存 固定的目的防止細胞自溶，保持細胞形態(tài)與機構(gòu)；保存組織細胞抗原性；防止標(biāo)本脫落；防止滋生微生物，預(yù)防組織腐敗 標(biāo)本固定以不損傷細胞形態(tài)、不損傷抗原特異性為基本原則

3、固定與保存 固定的目的固定與保存 固定劑 蛋白類乙醇或甲醇 微生物類丙酮、三氯化碳 多糖類10%福爾馬林固定與保存 固定劑抗原修復(fù) 目的：充分暴露抗原表位，利于抗體識別。 方法： 酶（無花果蛋白酶，胰蛋白酶）消化法； 鹽酸水解 微波處理 煮沸法抗原修復(fù) 目的：授課提綱 基質(zhì)標(biāo)本的制作 熒光免疫組化技術(shù) 酶免疫組化技術(shù) 相關(guān)問題與解決方案授課提綱 基質(zhì)標(biāo)本的制作標(biāo)記物 熒光素 異硫氰酸熒光素（FITC） 四乙基羅丹明（RB200） 藻紅蛋白（PE） 藻紅蛋白花青苷（PE-Cy5）標(biāo)記物 熒光素技術(shù)類型 直接染色法熒光素直接標(biāo)記在特異性抗體（Ab1) 間接染色法熒光素標(biāo)記第二抗體（Ab2)第二抗體

4、針對第一抗體種屬特異性的表 位（如羊抗鼠Ig或羊抗人Ig）技術(shù)類型 直接染色法直接法直接法實例：細胞鑒定 免疫細胞及其亞群（流式細胞術(shù)） T細胞 CD3+ CD4+ CD8+ B細胞 NK細胞實例：細胞鑒定 免疫細胞及其亞群（流式細胞術(shù)）免疫細胞分類與計數(shù)18Suppressor T cellR1T cell / B cellHelper T cell免疫細胞分類與計數(shù)18Suppressor T cellR1間接法間接法實例：檢測抗核抗體 檢測原理已知抗原肝細胞/HEp-2待檢抗體第二抗體熒光標(biāo)記兔抗人Ig實例：檢測抗核抗體 檢測原理實例：檢測病原體（病毒、細菌）檢測原理待檢病毒（抗原）已知

5、抗體單抗或多抗第二抗體熒光標(biāo)記羊抗鼠（或兔）Ig實例：檢測病原體（病毒、細菌）檢測原理熒光顯微鏡（落射式）關(guān)鍵汞燈光源激發(fā)濾片暗場聚光鏡吸收濾片熒光顯微鏡（落射式）關(guān)鍵熒光顯微鏡（落射式）熒光顯微鏡（落射式）熒光顯微鏡（落射式）熒光顯微鏡（落射式）THANK YOUSUCCESS2022/10/225可編輯THANK YOUSUCCESS2022/10/22授課提綱 基質(zhì)標(biāo)本的制作 熒光免疫組化技術(shù) 酶免疫組化技術(shù) 相關(guān)問題與解決方案授課提綱 基質(zhì)標(biāo)本的制作主要類型 酶標(biāo)記抗體同熒光免疫組化 非酶標(biāo)記抗體酶-抗酶系統(tǒng)生物素-鏈霉親和素系統(tǒng)主要類型 酶標(biāo)記抗體技術(shù)特點以酶作為抗原，制備抗酶抗體；

6、酶（抗原）與抗酶（抗體）結(jié)合制備酶-抗酶復(fù)合物；通過橋聯(lián)抗體與識別系統(tǒng)（待檢抗原-特異性抗體）連接；技術(shù)特點以酶作為抗原，制備抗酶抗體；酶橋法酶橋法常用酶和相應(yīng)底物 過氧化物酶Peroxidase（P）二氨基聯(lián)苯胺（DAB） 堿性磷酸酶（AP）alkaline phosphatase（AP）溴氯羥吲哚磷酸鹽（BCIP） 常用酶和相應(yīng)底物 過氧化物酶過氧化物酶-抗過氧化物酶（PAP）法PAPPAP復(fù)合物過氧化物酶-抗過氧化物酶（PAP）法PAPPAP復(fù)合物抗體選擇 第一抗體識別抗原 第二抗體（橋聯(lián)抗體）能同時與第一、第三抗體結(jié)合 第三抗體抗酶抗體與第一抗體同源抗體選擇 第一抗體PPPAAA 圖

7、雙酶雙底物(復(fù)合物法)雙重酶標(biāo)染色原理兔PAPGAR IgG兔抗Ag鼠APAAPGAM. IgG鼠抗PPPAAA 實例：淋巴瘤輕鏈雙重染色法 一抗兔抗鼠抗 二抗羊抗兔羊抗鼠 顯色系統(tǒng) PAP APAAP實例：淋巴瘤輕鏈雙重染色法 一抗 顯色系統(tǒng)親和素-生物素-過氧化物酶復(fù)合體（ABC） 生物素（Biotin） 親和素（Avidin） 生物素標(biāo)記抗體（B-Ab） 生物素標(biāo)記過氧化物酶（B-P）親和素-生物素-過氧化物酶復(fù)合體（ABC） 生物素（Biot親和素-生物素-過氧化物酶復(fù)合體（ABC）親和素-生物素-過氧化物酶復(fù)合體（ABC）EnVisionEnVision授課提綱 基質(zhì)標(biāo)本的制作 熒光

8、免疫組化技術(shù) 酶免疫組化技術(shù) 相關(guān)問題與解決方案授課提綱 基質(zhì)標(biāo)本的制作免疫組化技術(shù)1課件識別抗體（第一）選擇 單克隆抗體（McAb）特異性強敏感性差 多克隆抗體（McAb）特異性差敏感性強識別抗體（第一）選擇 單克隆抗體（McAb）識別（第一）抗體選擇構(gòu)象 糖基化碳水化合物識別（第一）抗體選擇構(gòu)象 糖基化碳水化合物第二抗體選擇第二抗體選擇選擇顯色系統(tǒng) 熒光免疫組化 酶免疫組化PAPAPAAPABCLAB？選擇顯色系統(tǒng) 熒光免疫組化？封閉非特異性結(jié)合封閉非特異性結(jié)合特異性顯色 具備特定部位顯色特定組織、特定細胞、特定結(jié)構(gòu)不均一顯色 特異性顯色 具備非特異性顯色主要原因內(nèi)源性酶內(nèi)源性生物素抗體特異性不強漂洗不充分基質(zhì)制作 非特異性顯色主要原因非特異性背景顯色 預(yù)先處理加底物消耗正常血清封閉非特異性背景顯色 預(yù)先處理The EndThe End經(jīng)常不斷地學(xué)習(xí),你就什么都知道。你知道得越多,你就越有力量Study Constantly, And You Will Know Everything. The More You Know, The More Powerful You Wi