臨床免疫測定技術(shù)課件

1、臨床免疫測定技術(shù)（各論）臨床免疫測定技術(shù)課件1臨床免疫測定技術(shù)（各論）臨床免疫測定技術(shù)課件1凝集試驗(yàn)Widal reactionWeil-felix reactionWright test:布魯菌病交叉配血試驗(yàn)臨床免疫測定技術(shù)課件凝集試驗(yàn)Widal reaction臨床免疫測定技術(shù)課件相關(guān)幫助需要相關(guān)抗體試劑的可以訪問Fantibody全球抗體搜索引擎fantibody全球抗體搜索引擎是一個(gè)供公共檢索的抗體數(shù)據(jù)庫，其抗體信息數(shù)據(jù)來源于全球范圍的研究機(jī)構(gòu)與商業(yè)公司。該引擎由商品化抗體數(shù)據(jù)庫與抗體應(yīng)用評(píng)價(jià)數(shù)據(jù)庫兩部分組成，以幫助研究者更高效的尋找并評(píng)估該抗體的性能。全球抗體搜索引擎是繼基因與蛋白數(shù)

2、據(jù)庫之后更為復(fù)雜的應(yīng)用型檢索平臺(tái)需要相關(guān)的實(shí)驗(yàn)室儀器設(shè)備、生物試劑、醫(yī)療器械、制藥設(shè)備、醫(yī)藥原料、體外診斷試劑及耗材與技術(shù)服務(wù)信息的，可以訪問探生網(wǎng)biomean進(jìn)行咨詢，期待您的加入臨床免疫測定技術(shù)課件相關(guān)幫助需要相關(guān)抗體試劑的可以訪問Fantibody全球抗體Widal reaction（試管內(nèi)凝集反應(yīng)）?。海?：10）待檢血清3.0ml 生理鹽水 3.0ml/管 釋度1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 臨床免疫測定技術(shù)課件Widal reaction（試管內(nèi)凝集反應(yīng)）?。?待測血清的抗體效價(jià)（滴度）： 即出現(xiàn)“+”凝集的最終血清稀釋度臨床免疫測定技術(shù)課件 待

3、測血清的抗體效價(jià)（滴度）：臨床免疫測定血型鑒定（玻片凝集反應(yīng)）（直接）YYY+抗A標(biāo)準(zhǔn)血清YYY+抗B標(biāo)準(zhǔn)血清 待測RBC待測RBCA型 B型臨床免疫測定技術(shù)課件血型鑒定（玻片凝集反應(yīng)）（直接）YYY+抗A標(biāo)準(zhǔn)血清YYY 乳膠凝集試驗(yàn)(間接)帶現(xiàn)象Zone phenomenon前帶prezone后帶postzone臨床免疫測定技術(shù)課件 乳膠凝集試驗(yàn)(間接)帶現(xiàn)象臨床免疫測定技術(shù)課件臨床免疫測定技術(shù)課件臨床免疫測定技術(shù)課件 1）正向間接凝集試驗(yàn) (用抗原致敏載體-檢測Ab) 2）反向間接凝集試驗(yàn)間接凝集(用抗體致敏載體-檢測Ag） 3）間接凝集抑制試驗(yàn) 4) 協(xié)同凝集試驗(yàn) (SPA抗體致敏-測抗

4、原)臨床免疫測定技術(shù)課件 1）正向間接凝集試驗(yàn)臨床免疫測定技 反向間接血凝試驗(yàn)(測Ag)1/21/41/81/161/321/641/1281/2561/5121/1024Pos.Neg.Titer648512232128324Patient12345678臨床免疫測定技術(shù)課件 反向間接血凝試驗(yàn)(測Ag)1/21/41/8抗球蛋白抗體試驗(yàn)- commbs （抗RBC不完全抗體）A（間接法游離）B（直接法結(jié)合）：臨床免疫測定技術(shù)課件抗球蛋白抗體試驗(yàn)- commbsA（間接法游離）B（直(In fluid phase )絮狀沉淀試驗(yàn)：AgAb環(huán)狀沉淀試驗(yàn)臨床免疫測定技術(shù)課件(In fluid ph

5、ase )絮狀沉淀試驗(yàn)：AgAb(In gel phase )single gel diffusion test 抗原濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線操作：抗體混于凝膠中 抗原加入孔內(nèi) 抗原自由擴(kuò)散 測定沉淀環(huán)直徑 在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查找 相應(yīng)抗原濃度臨床免疫測定技術(shù)課件(In gel phase )single gel dif影響因素:1.抗原分子量：與擴(kuò)散速度、沉淀環(huán)反相關(guān)2.抗體種類：兔抗血清優(yōu)于馬、羊3.抗體稀釋度：抗體濃度大沉淀環(huán)小4.擴(kuò)散時(shí)間：抗原含量高，擴(kuò)散時(shí)間長5.擴(kuò)散溫度：437內(nèi)溫度與擴(kuò)散速度正相關(guān)6.瓊脂板厚度：與沉淀環(huán)反相關(guān)臨床免疫測定技術(shù)課件影響因素:1.抗原分子量：與擴(kuò)散速度、沉淀環(huán)反相關(guān)

6、臨床免疫測double gel diffusion test原理:將可溶性抗原和抗體置于瓊脂凝膠板的對(duì)應(yīng)孔中，兩者各自在凝膠中向四周自由擴(kuò)散，當(dāng)抗原與抗體相遇，在比例合適時(shí)形成沉淀線。臨床免疫測定技術(shù)課件double gel diffusion test原理:臨床瓊脂雙向擴(kuò)散試驗(yàn)的應(yīng)用1.檢測未知抗原或抗體2.抗原性質(zhì)分析 3.抗體效價(jià)滴定4.抗原或抗體純度鑒定臨床免疫測定技術(shù)課件瓊脂雙向擴(kuò)散試驗(yàn)的應(yīng)用1.檢測未知抗原或抗體臨床免疫測定技術(shù)1.檢測未知抗原或抗體臨床免疫測定技術(shù)課件1.檢測未知抗原或抗體臨床免疫測定技術(shù)課件A: 濃度Ag、Ab及擴(kuò)散率近似；B：濃度Ag、Ab近似，擴(kuò)散率AgAb

7、 ；C：濃度Ag、Ab近似，擴(kuò)散率AgAbD：濃度AgAb，擴(kuò)散率近似；E：濃度AgAb，擴(kuò)散率AgAb ；F：濃度AgAb，擴(kuò)散率AgAb ；臨床免疫測定技術(shù)課件A: 濃度Ag、Ab及擴(kuò)散率近似；臨床免疫測定技術(shù)課件2.抗原性質(zhì)分析臨床免疫測定技術(shù)課件2.抗原性質(zhì)分析臨床免疫測定技術(shù)課件3.抗體效價(jià)滴定臨床免疫測定技術(shù)課件3.抗體效價(jià)滴定臨床免疫測定技術(shù)課件4.抗原或抗體純度鑒定臨床免疫測定技術(shù)課件4.抗原或抗體純度鑒定臨床免疫測定技術(shù)課件免疫濁度試驗(yàn)(略)免疫球蛋白的檢測（簡）臨床免疫測定技術(shù)課件免疫濁度試驗(yàn)(略)臨床免疫測定技術(shù)課件年 齡 IgG IgA IgM臍血 6.516.0 0.

8、010.04 0.251月 2.59.0 0.020.5 0.200.829月 2.09.0 0.040.8 0.251.01012月 2.910.7 0.150.9 0.351.515歲 3.412.4 0.151.6 0.452.0612歲 6.516.0 0.352.5 0.502.51260歲 6.516.0 0.403.5 0.503.0 健康人血清Ig含量（g/L）臨床免疫測定技術(shù)課件年 齡 IgG 免疫固定電泳（測M蛋白）臨床免疫測定技術(shù)課件 免疫固定電泳（測M蛋白）臨床免疫測定技術(shù)課件CH50(complement hemolysis 50%).原理：組分和功能完整的補(bǔ)體系統(tǒng)能

9、使抗體致敏的羊紅細(xì)胞（SRBC）發(fā)生溶血反應(yīng)。在一定范圍內(nèi)，SRBC溶血程度與補(bǔ)體總活性成正相關(guān)。以溶血百分率作縱坐標(biāo)，相應(yīng)的血清量為橫坐標(biāo)繪圖，在一個(gè)適當(dāng)?shù)?、穩(wěn)定的反應(yīng)體系中，溶血程度與補(bǔ)體劑量依賴呈一個(gè)S形曲線 臨床免疫測定技術(shù)課件CH50(complement hemolysis 5Enzyme linked immunosorbent assay （ELISA）原理（Principle）：將抗原或抗體結(jié)合到某固相載體表面，保持其免疫活性，測定時(shí),把被測sample和conjugate按不同的步驟與固相載體上的immunosorbent反應(yīng)。用洗滌的方法使與固相載體上形成的immunoc

10、omplex與其他物質(zhì)分開，再加入酶反應(yīng)substrate，經(jīng)酶的催化作用后substrate變?yōu)橛猩a(chǎn)物。產(chǎn)物的量與標(biāo)本中被檢物的量直接相關(guān)。臨床免疫測定技術(shù)課件Enzyme linked immunosorbent asELISA操作的基本步驟：標(biāo)本的收集、運(yùn)送和保存試劑準(zhǔn)備加樣溫育洗板顯色比色結(jié)果判斷結(jié)果報(bào)告及解釋臨床免疫測定技術(shù)課件ELISA操作的基本步驟：標(biāo)本的收集、運(yùn)送和保存臨床免疫測定1、標(biāo)本的收集、運(yùn)送和保存ELISA檢測分析用標(biāo)本 血清（漿） 特殊項(xiàng)目用： 唾液、腦脊液、尿液、糞便等ELISA檢測分析的對(duì)象 病原體抗原/抗體 Tumor mark、hormone、cytoki

11、ne et al采集、運(yùn)送與保存的注意點(diǎn)： 采集時(shí)間、運(yùn)送條件、暫存點(diǎn)溫度臨床免疫測定技術(shù)課件1、標(biāo)本的收集、運(yùn)送和保存ELISA檢測分析用標(biāo)本 血可能影響測定結(jié)果的標(biāo)本因素一、內(nèi)源性（標(biāo)本內(nèi)） 類風(fēng)濕因子（rheumatoid factor） 補(bǔ)體（complement） 異嗜性抗體（heterophilic antibody） 治療或診斷用鼠抗體（抗鼠抗體） 自身抗體或溶菌酶等二、外源性（操作） 溶血、反復(fù)凍融 細(xì)菌污染 儲(chǔ)存時(shí)間過長 標(biāo)本凝固不全臨床免疫測定技術(shù)課件可能影響測定結(jié)果的標(biāo)本因素臨床免疫測定技術(shù)課件對(duì)策： 1、稀釋標(biāo)本 2、改變選用的酶標(biāo)抗體 3、預(yù)封閉（變性IgG） 4、加

12、入某些還原劑 5、血清標(biāo)本的補(bǔ)體滅活（5630min） 6、選擇包被或標(biāo)記抗體如F(ab)2片段 7、用理化方法解離自身抗體 8、標(biāo)本中添加Cu2+離子或卵白蛋白 等等臨床免疫測定技術(shù)課件對(duì)策：臨床免疫測定技術(shù)課件 2、試劑準(zhǔn)備1、實(shí)驗(yàn)開始前，將試劑盒從冰箱取出置室溫放置20min以上啟用，謂平衡（balance）目的： 1）保證反應(yīng)溫度的一致性 2）去濕化，保證試劑濃度2、稀釋液的質(zhì)量和特殊試劑配制的要求臨床免疫測定技術(shù)課件 2、試劑準(zhǔn)備1、實(shí)驗(yàn)開始前，將試劑盒從冰箱取出置室臨床3、加樣原則：量準(zhǔn) 操作規(guī)范量準(zhǔn)移液槍的狀態(tài)與正確使用操作規(guī)范 正確使用加樣器臨床免疫測定技術(shù)課件3、加樣原則：量

13、準(zhǔn)臨床免疫測定技術(shù)課件3、加樣操作規(guī)范 掌握操作要領(lǐng) 吸頭與加樣器上吸頭套密閉 吸頭進(jìn)入液體的深度要適宜 放送液體注意角度（1040） 位置（下1/3） 速度（不宜太快） 關(guān)注加樣器的狀態(tài)臨床免疫測定技術(shù)課件3、加樣操作規(guī)范 掌握操作要領(lǐng)臨床免疫測定技術(shù)課件臨床免疫測定技術(shù)課件臨床免疫測定技術(shù)課件4、溫育（incubation）溫育是ELISA檢測反應(yīng)中可能影響其檢測結(jié)果的最為關(guān)鍵的一個(gè)因素。液相的待測抗原/抗體與固相的抗體/抗原反應(yīng)需要一定的溫度與時(shí)間，以保證結(jié)合反應(yīng)充分。溫育所需要的時(shí)間與反應(yīng)溫度成反比。溫育溫度：37、室溫、43和28避免“邊緣效應(yīng)”。臨床免疫測定技術(shù)課件4、溫育（inc

14、ubation）溫育是ELISA檢測反應(yīng)中可5、洗板（washing）通過洗滌將特異性結(jié)合與固相的抗原或抗體與反應(yīng)溫育過程中可能非特異吸附及游離的成分分離，完成固相免疫檢測程序保證測定的特異性。洗滌液 :0.05% tween-phosphate-buffer saline pH7.4吐溫-20(山梨醇-20)一種非離子去垢劑含親水/疏水基團(tuán)臨床免疫測定技術(shù)課件5、洗板（washing）通過洗滌將特異性結(jié)合與固相的抗原或在洗滌中的作用是通過其疏水基團(tuán)與被動(dòng)吸附于固相載體上蛋白的疏水鍵相互作用以削弱之；同時(shí)通過其親水基團(tuán)結(jié)合液相中水分子的作用，促使非特異的蛋白質(zhì)吸脫。吐溫-20的濃度（2%）洗滌

15、用量與次數(shù)臨床免疫測定技術(shù)課件在洗滌中的作用是通過其疏水基團(tuán)與被動(dòng)吸附于固相載體上蛋白的疏例：選擇4條8孔的已包被抗原（HBsAg）ELISA板條每2條分別加同一份弱陽性和陰性樣本然后按試劑盒的操作說明加conjugate、溫育洗滌：1排4孔洗1次 4排4孔洗4次 2排4孔洗2次 3排4孔洗3次 8排4孔洗8次加底物，顯色，比色評(píng)判原則- 陽性/陰性值保持最大不變的次數(shù)臨床免疫測定技術(shù)課件例：臨床免疫測定技術(shù)課件6、顯色(Color is appeared)添加酶特異性底物(HRP- TMB/OPD)保證底物溶液的有效性(無色、避光、顯色)反應(yīng)溫度（37、室溫）反應(yīng)時(shí)間（2530min）終止反

16、應(yīng)（酸溶液-2mol/L sulfate acid）及時(shí)比色臨床免疫測定技術(shù)課件6、顯色(Color is appeared)添加酶特異7、比色 (By the plate reader)加酸終止顯色反應(yīng)后，比色測定前應(yīng)振蕩混勻測定時(shí)，要注意酶標(biāo)儀的波長是否已調(diào)至合適比較好的酶標(biāo)儀可選擇單波長或雙波長比色測定 所謂雙波長比色，即在敏感波長（此時(shí)對(duì)所顯色 具最大光吸收）如450 nm和非敏感波長（所測得 的光吸收為微孔板上的劃痕、污跡以及指紋等所 致），最后從儀器得到的讀數(shù)為在敏感波長測得 的吸光度與非敏感波長測得的吸光度之差。臨床免疫測定技術(shù)課件7、比色 (By the plate reade

17、r)臨床免8、結(jié)果判斷臨床ELISA檢測的結(jié)果報(bào)告形式 定性（陰/陽） 定量（量值） ELISA定性測定的“陰性”和“陽性”的判斷依據(jù)是試劑盒所確定的陽性判斷值（cut-off）。ELISA定量測定的“量值”依據(jù)是試劑盒中所帶標(biāo)準(zhǔn)品同時(shí)測定出的劑量反應(yīng)曲線（標(biāo)準(zhǔn)曲線）。cut-off的建立(略)S/CO1時(shí)判為陽性S/N或P/N2.1陽性為臨床免疫測定技術(shù)課件8、結(jié)果判斷臨床ELISA檢測的結(jié)果報(bào)告形式 定性（陰/陽“灰區(qū)”（例-HBsAg）臨床免疫測定技術(shù)課件臨床免疫測定技術(shù)課件9、結(jié)果報(bào)告及解釋結(jié)果報(bào)告根據(jù)測定性質(zhì)，定性-陰性/陽性 定量-具體數(shù)值結(jié)果解釋結(jié)合所測項(xiàng)目的相關(guān)知識(shí)（臨床意義）

18、，考慮各種可能影響的因素（關(guān)注測定操作中的各環(huán)節(jié)，尤其是加樣、溫育和洗滌）臨床免疫測定技術(shù)課件9、結(jié)果報(bào)告及解釋結(jié)果報(bào)告根據(jù)測定性質(zhì)，定性-陰性/陽例舉：臨床可能出現(xiàn)的問題及原因現(xiàn)象：1、相同的標(biāo)本兩次測定的結(jié)果不一致原因：加樣/試劑量不準(zhǔn)，板孔間有差異 加樣過快，孔間發(fā)生污染 加錯(cuò)樣本 加樣/試劑時(shí)，落在非包被區(qū) 不同批號(hào)的試劑混用 溫育、洗滌及反應(yīng)時(shí)間不一致 孔內(nèi)污染雜物 酶標(biāo)儀濾光片不正確 血清分離不充分，纖維蛋白原或血細(xì)胞入孔 臨床免疫測定技術(shù)課件例舉：臨床可能出現(xiàn)的問題及原因現(xiàn)象：1、相同的標(biāo)本兩次測定的現(xiàn)象：2、弱陽性質(zhì)控樣本檢測不出原因：溫育時(shí)間或溫度不夠，顯色反應(yīng)時(shí)間過短， 配

19、置緩沖液（洗滌液）的蒸餾水有問題現(xiàn)象：3、陽性對(duì)照不顯色原因：漏加酶結(jié)合物 洗滌液配置？（含有酶抑制物-NaN3） 漏加顯色劑，錯(cuò)加（將終止液誤為顯色液）現(xiàn)象：4、全部孔都有顯色原因：洗滌不夠 顯色液變質(zhì) 底物或洗滌液被酶污染臨床免疫測定技術(shù)課件現(xiàn)象：2、弱陽性質(zhì)控樣本檢測不出臨床免疫測定技術(shù)課件 臨床ELISA測定的常用模式一、雙抗體夾心檢測抗原二、競爭法檢測抗原三、間接法檢測抗體四、競爭法檢測抗體五、固相捕獲法檢測抗體六、雙抗原夾心檢測抗體七、ABS- ELISA及其他臨床免疫測定技術(shù)課件 臨床ELISA測定的常用模式一、雙抗體夾心檢測抗原臨床免一、雙抗體夾心檢測抗原例：ELISA雙抗體夾

20、心法定性檢測乙型肝炎表面抗原原理：臨床免疫測定技術(shù)課件一、雙抗體夾心檢測抗原例：ELISA雙抗體夾心法定性檢測乙型AbAgAb* Ab Ag Ab* Ab Ag Ag Ab*Ab* Ag Ab* a b c d臨床免疫測定技術(shù)課件AbAgAb* Ab Ag Ab* Ab Ab Ag Ab Ag （b復(fù)合物） (1) Ab AgAb* Ab Ag Ab* （a復(fù)合物） (2)臨床免疫測定技術(shù)課件Ab Ag Ab Ag （b復(fù)合物） HooKS效應(yīng)（鉤狀效應(yīng)）臨床免疫測定技術(shù)課件HooKS效應(yīng)（鉤狀效應(yīng)）臨床免疫測定技術(shù)課件評(píng)價(jià)： 被檢測的抗原具有兩個(gè)以上抗原決定族（全抗原） 標(biāo)本中RF會(huì)充當(dāng)抗原

21、分子（干擾） 一步法簡便、快捷；存潛在缺陷(hooks effect) 其他- 判斷時(shí)OD值落在“灰色區(qū)”？ 假陰性？（ hooks effect /變異） 假陽性? 臨床免疫測定技術(shù)課件評(píng)價(jià)：臨床免疫測定技術(shù)課件二、競爭法檢測抗原 例:T3、T4等激素或地高辛、茶堿等藥物濃度檢測臨床免疫測定技術(shù)課件二、競爭法檢測抗原 例:T3、T4等激素或地高辛、茶堿等藥物評(píng)價(jià)： 結(jié)合于固相的酶標(biāo)記抗原量與被測抗原量呈反比 檢測對(duì)象為小分子蛋白（半抗原） 檢測中需獲得酶標(biāo)記的小分子半抗原（制備難） 運(yùn)用于儀器的自動(dòng)化檢測 臨床免疫測定技術(shù)課件評(píng)價(jià)：臨床免疫測定技術(shù)課件三、間接法檢測抗體例:ELISA間接法檢

22、測各類病原體特異性抗體（IgG）臨床免疫測定技術(shù)課件三、間接法檢測抗體例:ELISA間接法檢測各類病原體特異性抗評(píng)價(jià)： 通用性大。只要更換固相抗原，同一種酶標(biāo)記體 體（IgG/IgA、M）可用以各種與抗原相應(yīng)的抗體檢 測。 標(biāo)本高濃度時(shí)易受非特異IgG的干擾（稀釋） 易受其他因素的影響（包被抗原的純度） 臨床免疫測定技術(shù)課件評(píng)價(jià)：臨床免疫測定技術(shù)課件四、競爭法檢測抗體抗體的檢測一般不選用競爭法。當(dāng)已知抗原難以純化或抗原/抗體的結(jié)合特異性不穩(wěn)定時(shí) 實(shí)例-ELISA競爭法檢測乙型肝炎病毒核心抗體 （基因工程表達(dá)的HBcAg） 固相板（包被HBcAg ）+ 待測標(biāo)本 + 酶標(biāo)記抗-HBc 待測標(biāo)本中抗- HBc /酶標(biāo)記抗-HBc （競爭）固相板（包被HBcAg ） |酶標(biāo)記抗-HBc與固相板