質(zhì)粒大抽步驟

1、4/4質(zhì)粒大抽（手提）步驟資料來自網(wǎng)絡(luò),適當改進試劑配制:ffr QBT（000ml）：分別稱取al4。83g，MO 1。4g,加入600ml 雙蒸水,用NaH調(diào)節(jié)pH值為7。,然后加入1ml 異丙醇,定容至1000ml.Bfer QC(1000ml）：分別稱取N 5。44，MS 10.46,加入600 雙蒸水，用NaOH調(diào)節(jié)H值為7。0,然后加入0m異丙醇,定容至100ml.Buffr F(1000l):稱取Nl 7.05，量取M Ts-H 25ml,加入8ml 雙蒸水，用NO調(diào)節(jié)p值為85，然后加入50m異丙醇，定容至100。1M NaOH (40l ）:分子量：0，秤取16g NaOH，

2、溶于40l 雙蒸水中。2Mi-HCl (00）：分子量為1211，秤取121.1g Tris，溶于40 ml雙蒸水中，用HCl調(diào)節(jié)值為.0,定容至0。10TBfer：量取MTri-HC（p8.）100，50mM EDTA（8.0) 20ml，加入800ml雙蒸水，均勻混合后定容至1L。Bffe 1 （000ml）：用0ml離心管量取20ml 0.5M的TA，然后量取25ml2的TrisHC，加入70 雙蒸水，用HC調(diào)節(jié)pH值為8.0,定容至1000。 ffer P2(000ml）：稱取0g SDS，放入100m的玻璃瓶中,然后加入750ml 雙蒸水,最后加入00 ml M的NaOH，混勻，室溫

3、放置過夜，使其自溶.(注：不需要定容，嚴格按步驟操作)Buffer P3(1000ml）：秤取294。g乙酸鉀,溶于0m 雙蒸水中，用冰醋酸調(diào)節(jié)pH值為55,定容至000l。配制RNse：（1） 將RNae粉末溶于10的乙酸鉀（即Bffr P3）,配制成濃度為10mg/ml的溶液。（2)將配好的ase溶液100加熱10min, 隨后冷卻至室溫.（） 用1M 的TrsHl調(diào)節(jié)pH值至7.，大約需要0。1體積的Tsl。（) 分裝RNase溶液于1.ml管中，-2保存。使用前注意事項:在提lo-cpy(低拷貝)質(zhì)粒時，增加ysisbufr（裂解液)體積可以提高堿性裂解的效率以及DN的產(chǎn)量。uffer

4、 P1在使用前加RNe A slution（RA酶溶液)，一瓶Buer P加入一小瓶Nae A（用前瞬時離心），終濃度為10u/ml。檢測Bfr 2是否有因低溫儲存而引起的SD沉淀。如有必要,將DS在37溶解。Buer P3在下預冷。在選擇平板上挑選一個單克隆,在含有相應(yīng)抗性的5ml中液體B培養(yǎng)基初培養(yǎng)：搖床00-00pm下培養(yǎng)約8h。 （使用的管子或燒瓶至少是培養(yǎng)體積的4倍）將初培養(yǎng)菌液用選擇性L培養(yǎng)基稀釋到1500到100。ihp plasmid（高拷貝質(zhì)粒)：用10000ul初培養(yǎng)液接種00ml介質(zhì)。Lowcoyplasmid(低拷貝質(zhì)粒）:用250-5l初培養(yǎng)液接種00ml。37搖床3

5、00rpm下初培養(yǎng)約11。OD60=5，此時培養(yǎng)細胞濃度可達到約34個/ml。 (使用的燒瓶或容器至少是培養(yǎng)體積的4倍,最好使用錐形瓶搖菌)、離心機000g離心min收集細菌細胞。（如果想在此步驟停止以后再做，把細胞-20凍存）10Bufer P重懸細菌細胞。（確保Bufer P里已經(jīng)加入Rse A)（為使細菌完全重懸，用振蕩器充分溶解菌液沉淀）加入10mufer,輕輕上下顛倒封蓋的管子6次徹底混合溶液，室溫(15-5)下放置5min.(不要渦旋，因為渦旋能導致基因組DN機械斷裂。裂解液會有粘性.溶解反應(yīng)不要超過mi。裝有Buffer 的瓶子用后要立即蓋緊，以免被空氣中的C2酸化).加0l預冷

6、的uffe P3，立即輕輕上下顛倒4次混勻,冰上放置20in。 （預冷的Bufer P3和冰上放置能促進沉淀。加入uer P3后有乳白色的物質(zhì)形成且裂解液粘性減少.沉淀物中含有基因組NA、蛋白質(zhì)、細胞殘渣) 。20 mn后，600 g 4離心25mn。同時,向柱子中加入ml uffr QB，使其全部流過柱子,平衡柱子。剪一小塊紗布,折疊4層,放于柱子上部。將離心后的液體緩慢倒入紗布中,最后擠壓紗布使其中的液體全部直接過濾到柱子中,使其充分流過柱子.（如果此步不只1個質(zhì)粒時,擠壓不同質(zhì)粒的紗布時,一定要換手套，避免污染質(zhì)粒）。用30mBufeQ （wsh fer)洗柱子。 （BfferQC通過重

7、力流通過柱子。第一次清洗就足夠去除大部分質(zhì)粒NA沉淀中的污染物。但是，當培養(yǎng)體積較大或者菌種會產(chǎn)生大量的糖類時第二次清洗是必要的）10、洗脫質(zhì)粒：向柱子中加15Bufr QF，靠重力作用使其全部通過柱子,收集洗脫液。(注：要收集到一個新的管中。)11、沉淀質(zhì)粒:向收集的液體中,加入0。倍體積（即10.5 m)異丙醇,輕輕混勻,0 離心25 mi。（異丙醇可以充分沉淀質(zhì)粒,但同時會沉淀很多鹽分）12、清洗質(zhì)粒:離心后，注意質(zhì)粒貼壁的方向，應(yīng)從其側(cè)面倒掉廢液。用ml70室溫保存的乙醇洗滌顆粒，將含有DNA的乙醇轉(zhuǎn)移到5ml的P管中, 6000 g4離心10,輕輕吸棄廢液。（殘留的乙醇會影響后續(xù)反應(yīng)中的酶活性)。將EP管倒扣于吸水紙上,空氣干燥5-10min，用適當體積的TE溶解DN.柱子回收: (1）先用自來水沖洗柱子內(nèi)外；再用蒸餾水和雙蒸水沖洗柱子內(nèi)外。 (2）2ml1M Hl流過柱子一遍，流完后再加1ml的1 M HCl，使其部分流出，最后剩余78m