PCR核酸擴增儀-2解析課件

1、 第十三章 PCR基因擴增儀器 (polymerase chain reaction Gene Amplifier)1 第十三章1內容提要1. PCR基因擴增儀的工作原理 PCR技術的原理及發(fā)展 PCR基因擴增儀的工作原理 2. PCR擴增儀的分類與結構 定性PCR擴增儀實時熒光定量PCR擴增儀 3. PCR擴增儀的性能指標、操作規(guī)程及常見故障的排除 PCR擴增儀的性能指標PCR擴增儀的操作規(guī)程PCR擴增儀常見故障的排除 4. PCR擴增儀的應用2內容提要1. PCR基因擴增儀的工作原理 2第一節(jié) PCR基因擴增儀工作原理 一、PCR技術的歷史發(fā)展及原理 聚合酶鏈反應(polymerase c

2、hain reaction，PCR)是一種體外DNA擴增技術。在它發(fā)明以前，對于檢測對象濃度非常低的標本，人們沒有辦法用常規(guī)方法測定。 1971年，Kleppe等人首次在文章中準確、客觀地闡述了PCR方法。 1985年，美國PE-Cetus公司的Kary Mullis等人發(fā)明PCR技術。它推動了現(xiàn)代醫(yī)學由細胞水平向分子水平、基因水平發(fā)展，是DNA測序的基礎，它成為現(xiàn)代分子生物學發(fā)展過程中的一座里程碑。3第一節(jié) PCR基因擴增儀工作原理 一、PCR技術的歷史發(fā)展PCR技術是在試管中（體外）給DNA的合成提供一種合適條件-模板DNA 、dNTP、寡核苷酸引物、DNA聚合酶、合適的緩沖體系，及讓DN

3、A變性、復性及延伸的溫度和時間，使DNA能夠體外復制。Mullis等因此項技術獲得1993年諾貝爾獎。4PCR技術是在試管中（體外）給DNA的合成提供一種合適條件-PCR原理及其步驟：加熱使雙鏈DNA解開螺旋，在退火溫度條件下加入的引物同模板DNA雜交，在Taq DNA聚合酶、dNTPs、Mg2+和合適pH緩沖液存在條件下延伸引物，重復 “變性退火引物延伸”過程至25-40個循環(huán)，待測樣本中的核酸拷貝數(shù)呈指數(shù)級擴大。5PCR原理及其步驟：加熱使雙鏈DNA解開螺旋，在退火溫度條件其過程1：加熱變性 加熱（通常93左右）可將雙鏈DNA分為兩條單鏈，稱之為“變性”。因為連接堿基之間的氫鍵較弱，它們在

4、高溫下斷裂，而脫氧核糖和磷酸之間的共價鍵結合力較強，在高溫下保持不變。 6其過程1：加熱變性 加熱（通常93左右）過程2 退火，引物與靶序列結合引物是短的、人工合成的單鏈DNA序列，有20-30個堿基，具有標記的5端，便于下一步檢測。它們對于待擴增的靶核酸是特異的。 PCR反應需有兩條引物，每一條都與變性過程中產生的DNA單鏈互補。退火溫度：通常在40-65進行，視引物的長度和堿基序列而定。這樣保證了引物與靶序列退火結合的高度特異性。注意：PCR反應并不是復制整個DNA鏈，而是復制某一段生物體特異的100-600個堿基對的靶序列。7過程2 退火，引物與靶序列結合引物是短的、人工合成的單鏈D88

5、過程3：延伸一旦引物與互補DNA序列退火，溫度即提高至近72，Taq DNA聚合酶被用于復制DNA鏈。 Taq DNA聚合酶是一種來源于嗜熱水生菌（Thermus aquaticus）的重組的熱穩(wěn)定的DNA聚合酶，與一般聚合酶不同的是在高溫狀態(tài)仍具有活性。 Taq DNA聚合酶在引物標記的地方開始合成。它使溶液中自由的互補核苷酸（dNTPs）的摻入和結合，合成與目標DNA區(qū)域原始雙鏈一樣的新的雙鏈DNA分子。 延伸通常起始于引物的3端，從而使得單鏈變?yōu)殡p鏈。Taq DNA聚合酶特定地從5端到3端合成。因此，溶液中的自由的核苷酸僅加于引物的3端，形成靶DNA序列的互補鏈。9過程3：延伸一旦引物與

6、互補DNA序列退火，溫度即提高至近72101030次循環(huán)后靶序列擴增的數(shù)量-（10億）1130次循環(huán)后靶序列擴增的數(shù)量-（10億）11二、PCR核酸擴增儀工作原理與控溫方式在PCR反應中需以變性、退火、延伸三種溫度為一個循環(huán)，因此，設計PCR基因擴增儀就要能精確控制溫度，這對PCR反應十分關鍵。Taq DNA聚合酶的應用大大提高了PCR的效率，無需在PCR反應過程中反復加入新鮮酶。Taq DNA聚合酶酶促反應最適溫度為7075。最早的PCR是利用大腸桿菌DNA聚合酶I的Klenow片段進行核酸擴增。問題是該酶不耐熱，當樣品置于高溫(9495)條件下時不可逆失活，故在退火及延伸時，需再向反應液中

7、加入新鮮酶以供擴增所需，相當繁瑣。12二、PCR核酸擴增儀工作原理與控溫方式在PCR反應中需以變性PCR儀溫度控制，有：水浴鍋控溫 壓縮機控溫 半導體控溫 離心式空氣加熱控溫 PCR溫度控制重要性：從PCR反應基本原理可知，基因擴增儀工作關鍵是溫度控制。 13PCR儀溫度控制，有：水浴鍋控溫 壓縮機控溫 半導體控溫 離水浴鍋控溫以不同溫度的水浴鍋串聯(lián)成一個控溫體系。樣品與水直接無縫接觸，控溫準確，溫度均一性好，無邊緣效應。體積大，自動化程度不高，需人為干預，更換水浴鍋時控溫不穩(wěn)定。14水浴鍋控溫以不同溫度的水浴鍋串聯(lián)成一個控溫體系。14壓縮機控溫由壓縮機自動控溫，金屬導熱，控溫較水浴鍋方便，一

8、臺機器便可完成整個PCR流程。但 壓縮機故障率高，邊緣效應及溫度overshooting現(xiàn)象嚴重。overshooting：升溫過程中，由于一些加熱元件，比如半導體、金屬塊本身會積蓄能量，雖然溫度探頭探測溫度到達了設定溫度，但這些積蓄的能量仍然會傳給PCR體系，造成實際的溫度高于設定的溫度的現(xiàn)象。 15壓縮機控溫由壓縮機自動控溫，金屬導熱，控溫較水浴鍋方便，一臺半導體控溫由半導體自動控溫，金屬導熱，控溫方便，體積小，相對穩(wěn)定性好。缺點：仍有邊緣效應，溫度均一性尚有欠缺，各孔擴增效率可能不一致，也存在溫度overshooting現(xiàn)象。 16半導體控溫由半導體自動控溫，金屬導熱，控溫方便，體積小，

9、相對離心式空氣加熱控溫由金屬線圈加熱，采用空氣作為導熱媒介，溫度均一性好，各孔擴增效率高度一致滿足熒光定量PCR的高要求，直接發(fā)展為離心式的定量PCR儀。17離心式空氣加熱控溫由金屬線圈加熱，采用空氣作為導熱媒介，溫度第二節(jié) PCR擴增儀的分類與結構一、PCR擴增儀的種類 普通PCR擴增儀 實時熒光定量PCR擴增儀 梯度PCR儀 原位PCR儀 18第二節(jié) PCR擴增儀的分類與結構一、PCR擴增儀的種類 一、普通定性PCR擴增儀特點 變溫快、時間準、溫度均一，目前國內仍有應用。儀器一般由三個不同溫度的水浴槽和機械臂組成，采用半導體傳感技術、電子技術和計算機技術進行水浴溫度的測量、顯示和控制，并經

10、計算機控制由機械臂完成樣品在每個水浴槽的置放以及槽間的移動。19一、普通定性PCR擴增儀特點 變溫快、時間準、溫度均一，目前1水浴式PCR儀 一般由三個不同溫度的水浴槽和機械臂組成，采用半導體傳感技術、電子技術和計算機技術進行水浴溫度的測量、顯示和控制，并經計算機控制由機械臂完成樣品在每個水浴槽的置放以及槽間的移動。此類PCR儀體積較大，但變溫快、時間準、溫度均一，目前國內應用較少。2、變溫金屬塊式PCR儀：中心是由鋁塊或不銹鋼制成的熱槽，上有不同數(shù)目甚至不同規(guī)格的凹孔，用來放置樣品管。一般通過半導體加熱和冷卻，并由微機控制恒溫和冷熱處理過程 。裝置比較牢固耐用，溫度變換平穩(wěn)，有利于保持Taq

11、 DNA聚合酶的活性。201水浴式PCR儀 一般由三個不同溫度的水浴槽和機械臂組成3、變溫氣流式PCR儀 這類儀器由機殼、熱源、冷空氣泵、控制器及輔助元件等組成。熱源由電阻元件和吹風機組成，形成熱空氣槍借空氣作為熱傳播媒介，由大功率風扇及制冷設備提供外部冷空氣制冷，精確的溫度傳感器構成不同的溫度循環(huán)。該儀器不用金屬精密加工，成本較低；整個系統(tǒng)沒有液體流動及制冷劑，安全程度高。PCR儀配上微機和軟件，可靈活編程。 213、變溫氣流式PCR儀 這類儀器由機殼、熱源、冷空氣泵、4梯度PCR儀 由普通PCR儀衍生出的具溫度梯度功能的PCR核酸擴增儀。使用梯度PCR儀，多種變性溫度和延伸溫度可在一臺擴增

12、儀上同時完成，既節(jié)省實驗時間、提高實驗效率，又節(jié)約實驗成本。PCR反應能否成功，退火溫度是關鍵，雖然有各種各樣的PCR引物設計軟件或者經驗公式計算最合適的退火溫度，可是模板中堿基的組合千變萬化，經驗公式得到的數(shù)據(jù)不一定都合適。梯度PCR儀每個孔的溫度可以在指定范圍內按照梯度設置，根據(jù)擴增結果，一步就可以摸索出最適反應條件。224梯度PCR儀 由普通PCR儀衍生出的具溫度梯度功能的P5原位PCR儀 即在細胞內進行PCR擴增，而組織細胞的形態(tài)不被破壞，它是原位雜交與PCR技術的結合。以往手工方法操作復雜，擴增效果及實驗結果重復性均不理想。原位PCR儀以其創(chuàng)新的設計，比較好地解決了這些問題。原位PC

13、R儀與普通PCR儀的區(qū)別在于，其樣品基座上有若干平行的鋁槽，每條鋁槽內可垂直放置一張載玻片，每張載玻片面均與鋁槽緊密接觸，溫度傳導極佳，控溫很精確。目前也有在普通PCR儀上增加原位PCR模塊的，就可以進行原位PCR擴增。不少廠家的PCR儀都可以提供原位適配器，配有支持原位PCR模塊的PCR儀可以一機兩用，比較經濟。235原位PCR儀 即在細胞內進行PCR擴增，而組織細胞的形（二）實時熒光定量PCR擴增儀熒光實時定量PCR技術（real-time quantitative PCR,RQ-PCR） 是在PCR反應體系中加入特異性的熒光染料或探針，熒光信號的變化真實地反映了體系中模板的增加，通過檢測

14、熒光信號，從而實時監(jiān)測整個PCR反應過程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析。定量PCR儀通常由兩部分組成，即PCR系統(tǒng)和熒光檢測系統(tǒng)。目前的主流是多色多通道檢測，通道及適用熒光素越多，儀器的適用范圍就越寬。 24（二）實時熒光定量PCR擴增儀熒光實時定量PCR技術（reaTaqMan實時熒光定量PCR原理25TaqMan實時熒光定量PCR原理2526261、金屬板式實時定量PCR儀 即傳統(tǒng)的96孔板式定量PCR儀，由第三代的半導體PCR儀發(fā)展而來。在原有PCR儀的基礎上，增加熒光激發(fā)和檢測模塊，升級為熒光定量PCR儀。 ABI 7500型熒光定量PCR儀的激發(fā)光源為鹵鎢燈，與5色濾光鏡配

15、合，可同時激發(fā)96個樣品；檢測器為超低溫CCD成像系統(tǒng)，可同時多點多色檢測，能有效分辨FAM/SYBR GreenI、VIC/JOE、NED/TAMRA/Cy3等多種熒光染料。隨機配置的定量PCR引物和探針設計軟件Primer Express可以設計定量PCR所需的TaqMan探針。271、金屬板式實時定量PCR儀 即傳統(tǒng)的96孔板式定量各型號均有實時動態(tài)和終點讀板(Plate Read)兩種模式，實時動態(tài)模式能動態(tài)顯示PCR擴增曲線的生成，定量線性范圍大于9個數(shù)量級，區(qū)分5000和10000個拷貝的DNA模板可信度可達99. 7%，用于定量DNA或RNA拷貝數(shù)。終點讀板模式可用于點突變檢測、

16、單核苷酸多態(tài)性(SNP)分析、基因型鑒定等。增強的7900型在96孔模塊的基礎上可更換384孔模塊，大大增強儀器高通量處理數(shù)據(jù)的能力。該類儀器還可作為普通PCR儀使用，有的甚至帶梯度功能，可容納的樣本量大，無需特殊耗材。缺點 溫度均一性欠佳，有邊緣效應，標準曲線的反應條件難以做到與樣品完全一致。28各型號均有實時動態(tài)和終點讀板(Plate Read)兩種模式ABI 7500熒光定量PCR儀 MJ公司Chromo 4熒光定量PCR儀 Bio-rad公司iCycler熒光定量PCR儀 29ABI 7500熒光定量PCR儀 MJ公司Chromo 4熒2、離心式實時定量PCR儀它為滿足定量PCR對溫度

17、的高要求而設計，克服了孔板式PCR儀固有的溫度均一性較差的問題。它的擴增樣品槽被設計為離心轉子的模樣，借助空氣加熱，以空氣為加熱介質，實現(xiàn)與反應體系無縫接觸，加熱均勻，接觸面積大。轉子在腔內旋轉，每個孔均等位，使每個樣品孔間的溫度差小于0. 01，保障了標準曲線和樣品之間反應條件的一致性。儀器激發(fā)光源大多采用使用壽命較長的發(fā)光二極管(light-emitting diode，LED)冷光源，運行前無需預熱，無需校正。由于樣品置于轉子上可移動，所以儀器使用同一個激發(fā)光源和檢測器，隨時檢測旋轉到跟前的樣品，有效減少系統(tǒng)誤差，定量線性范圍可達10個數(shù)量級。但這類儀器離心轉子小，可容納樣品量少，有的需

18、用特殊毛細管作樣品管，增加了使用成本，也不帶梯度功能。302、離心式實時定量PCR儀30Rotor-Gene 3000熒光定量PCR儀 Light CycleTM熒光定量PCR儀 31Rotor-Gene 3000熒光定量PCR儀 Light Light CycleTM熒光定量PCR儀結構示意圖 32Light CycleTM熒光定量PCR儀結構示意圖 323、各孔獨立控溫的定量PCR儀 這種定量PCR儀設計非常獨到，不同樣品槽分別擁有獨立的智能升降溫模塊，各孔獨立控溫，適合多指標快速檢測，但目前在國內應用尚少。 儀器有16個樣品槽，每個溫控模塊控制一個樣品槽，可以在同一臺定量PCR儀上分別進

19、行不同條件的定量PCR反應，隨時利用空置的樣品槽開始其他定量反應，使用效率非常高。 升降溫速度高達10s，控溫精度也高。每個模塊獨立控制的激發(fā)光源和檢測器直接與反應管壁接觸，保證熒光激發(fā)和檢測不受外界干擾。333、各孔獨立控溫的定量PCR儀33該儀器整合成4通道光學檢測系統(tǒng)，能有效分辨FAM/SYBR Green I、Tet/Cy3、Texas Red和Cy5等多種熒光染料，可對同一樣品進行多靶點分析，同時檢測四種熒光信號?？墒褂肨aqman探針、分子信標、Amplifluor引物等多種檢測方法，定量線性范圍可達9個數(shù)量級。其軟件允許一臺儀器同時操作六個樣品模塊，既滿足高速批量要求，又能靈活運

20、用，還可實現(xiàn)任意梯度反應。不足 上樣不如傳統(tǒng)方法方便，需要獨特的扁平反應管，成本高。34該儀器整合成4通道光學檢測系統(tǒng)，能有效分辨FAM/SYBR SmartCycler熒光定量PCR儀 35SmartCycler熒光定量PCR儀 35第三節(jié) PCR擴增儀的性能指標、操作規(guī)程及常見故障的排除 一、PCR擴增儀的性能指標 （一）溫度控制 它是PCR反應能否成功的關鍵。包括： 1、溫度的準確性：指樣品孔溫度與設定溫度的一致性。PCR是一個指數(shù)級擴增的過程，不論是變性、退火還是延伸都需要準確控制溫度，尤其是退火溫度。擴增過程中退火溫度的細微變化會被放大，直接影響結果。 對PCR擴增儀而言溫度控制就意

21、味著質量。36第三節(jié) PCR擴增儀的性能指標、操作規(guī)程及常見故障的排除2、溫度的均一性： 是指樣品孔間的溫度差異，關系到不同樣品孔之間反應結果的一致性。實驗過程中有這樣的情況：用同樣的樣品，同樣的PCR反應程序，最后的結果差異非常明顯，這就可能是因為不同樣品孔的溫度不均一性所致。如果PCR儀的溫度均一性不佳，會影響實驗結果，尤其是最外周的樣品孔，即位置“邊緣效應”影響結果重復性。上圖為同一個標本重復測定96次的擴增曲線均一性例子372、溫度的均一性： 是指樣品孔間的溫度差異，關系到不同樣3、升降溫的速度：升降溫速度快，可以提高工作效率，提高PCR反應特異性，降低非特異性。所以目前PCR擴增儀的

22、溫控方式已經從以前相對穩(wěn)定耐用的壓縮機轉向了升降溫速度更快的半導體。此外，制作承托樣品管的基座模塊材料的導熱性也影響升降溫速度。例如，有升降溫速度高達5s的銀質鍍金基座，還有升降溫速度可達6s和4.5s的銀質模塊。由于樣品管與基座接觸的緊密性、基座的導熱性、鄰近樣品管的相互影響都會影響樣品的實際升降溫速度。所以儀器的升降溫速度和樣品管中樣品的升降溫速度并非一回事。383、升降溫的速度：38目前PCR儀一般都具有模塊溫控模式(block-control)和反應管溫控模式( tube-control)。前者，是儀器控制承載樣品的金屬基座溫度，它由探測器直接探測基座，該模式適用于長時間的靜態(tài)孵育，如

23、連接、酶切、去磷酸化等。后者，是儀器對樣品管內或PCR板孔內樣品液的溫度來進行控制，由計算機在反應管溫控模式下根據(jù)探測器所探測到的溫控模塊的溫度計算出。后者一般更準確，因為反應管溫控模式精確的算法能自動補償時間，確保反應混合物按照程序設定的時間維持預設溫度，適合各種類型的反應管。39目前PCR儀一般都具有模塊溫控模式(block-contro4、不同模式下的相同溫度特性：主要針對梯度PCR儀而言?，F(xiàn)在的PCR儀已可以進行不同功能模式的轉換。帶梯度功能的PCR儀，不僅考慮梯度模式下不同梯度管間溫度的均一性和準確性，還考慮儀器在梯度模式和標準模式下是否具有同樣的溫度特性。否則可能導致在梯度模式下得

24、到最佳反應條件，并以此條件在標準模式下單獨做，但結果卻不如人意。現(xiàn)在已能以同樣的溫度變化速率到達所有設定的梯度溫度，因而在梯度模式下具有恒定的溫度，保證在梯度模式和標準模式下相同的溫度特性。404、不同模式下的相同溫度特性：405、熱蓋溫度目前的PCR儀都帶有熱蓋，可使樣本管頂部溫度達到105左右（控制溫度一般為30110 ），避免蒸發(fā)的反應液凝集于管蓋而改變PCR反應體積，無需再向反應管內添加石蠟油，減少了后續(xù)實驗的麻煩。415、熱蓋溫度目前的PCR儀都帶有熱蓋，可使樣本管頂部溫度達到（二）熒光檢測1Ct值重復性誤差 在熒光定量PCR技術中，有一個很重要的概念-Ct值（cycle thres

25、hold），其含義是，每個反應管內的熒光信號到達設定的域值時所經歷的循環(huán)數(shù)。模板的Ct值與它的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小，因此，Ct值重復性誤差對核酸定量的可靠性和正確性十分重要，一般要求CV2.5%。 2熒光檢測范圍 由于PCR是一個指數(shù)級擴增的過程，不同的起始拷貝數(shù)經過幾十個循環(huán)后，其熒光差別十分巨大，因此，熒光檢測范圍一般要求達到1011010DNA (RNA) copy/ml，這是熒光儀的重要指標。 3儀器檢測通道數(shù)量 復合PCR實驗已成為一種流行趨勢，它能節(jié)省試劑和時間，在短時間內獲得結果，因此要求儀器具備多通道檢測能力。目前以4通道檢測的居多，部分儀器具有6個檢測通道。42（二）熒光檢測1Ct值重復性誤差 在熒光定量PCR技術中（三）其他 1樣品基座容量和樣品數(shù) 多數(shù)PCR儀配備了可更換的多樣化樣品基座，以匹配不同規(guī)格的樣品管(0.2、0.5ml PCR管；8、12聯(lián)排管；96孔微孔板等)，常用0.2ml96孔。有的PCR儀，同一個樣品基座有不同規(guī)