生理實驗2課件

1、實驗二 反射弧分析、刺激強度和刺激頻率與肌肉收縮反應的關系，神經(jīng)干動作電位和神經(jīng)傳導速度的測定反射弧模式圖反射弧分析基礎知識定義 反射是指在中樞神經(jīng)系統(tǒng)參與下，機體對內(nèi)， 外環(huán)境變化所作出的規(guī)律性應答?；窘Y(jié)構 反射的結(jié)構基礎和基本單位是反射弧 感受器 傳入神經(jīng) 反射弧 神經(jīng)中樞 傳出神經(jīng) 效應器實驗目的 通過制備脊蟾蜍的方法，引導出單純的脊髓反射，觀察這些反射，證實反射弧的完整性與反射活動的關系。步驟和方法制備脊蟾蜍標本，分離右側(cè)坐骨神經(jīng)。（探針搗毀腦部不要搗毀脊髓或采用斷頭法制備）分離右側(cè)大腿坐骨神經(jīng)干，并穿線備用肌夾夾住下頜，懸掛在鐵支架上。注意事項毀腦時不可傷及脊髓，以免破壞脊髓反射中

2、樞。分離坐骨神經(jīng)應盡量向上，并盡量剪斷與其相連的分支。每次酸刺激后應立即用清水洗凈腳趾，并用紗布揩干。剝脫腳趾皮膚要完全，若剩留少量皮膚會影響實驗結(jié)果。思考題反射弧有哪幾部分組成，各部分具有什么作用？ 刺激強度和刺激頻率與肌肉收縮反應的關系，神經(jīng)干動作電位和神經(jīng)傳導速度的測定 圖5-4 蛙脛骨肌肉背面觀1-腓腸肌、2-腓骨肌肉（Peroneus ）圖5-5 蛙脛骨肌肉腹面觀1-腓腸肌、2-脛骨深肌（Tibialis posticus）3-Extensor cruris、4-Tibialis anticus longus 5-脛腓骨閾刺激閾下刺激閾上刺激有效刺激1.刺激強度與肌肉收縮反應的關系閾

3、強度(threshold stimulus)能引起組織發(fā)生反應的最小刺激強度，又稱為閾值。具有閾強度的刺激稱為閾刺激（threshold stimulus）。一條骨骼肌纖維“全或無” (all-or-none)達到閾值 肌纖維收縮超過閾值 收縮力不增加一塊骨骼肌一定范圍內(nèi)，肌肉收縮力的大小與刺激強度成正比閾下刺激 無肌肉興奮收縮刺激強度最適強度最適強度 收縮力不增加刺激強度達到一定的數(shù)值少數(shù)興奮性最高的肌纖維產(chǎn)生收縮肌纖維被興奮數(shù)肌肉收縮力所有的肌纖維均興奮肌肉收縮反應最大由許多骨骼肌纖維組成的不同的肌纖維興奮性不同強直收縮(tetanus)骨骼肌受較高頻率連續(xù)刺激,新收縮過程與上次尚未結(jié)束的

4、收縮過程發(fā)生總和不完全強直收縮(incomplete tetanus)總和過程發(fā)生于前一次收縮過程的舒張期完全強直收縮(complete tetanus)總和過程發(fā)生于前一次收縮過程的收縮期在生理條件下,支配骨骼肌的傳出神經(jīng)總是發(fā)出連續(xù)的沖動,所以骨骼肌的收縮都是強直收縮;靜息狀態(tài)下,中樞神經(jīng)也經(jīng)常發(fā)放低頻率神經(jīng)沖動至骨骼肌,產(chǎn)生一定程度的強直收縮,稱為肌緊張(muscle tone) 1933年美國科學家 Gasser和 Erlanger用示波器對外周神經(jīng)活動進行研究性總結(jié)，并發(fā)表了著名的論文Electric signals of Nervous Activity（1939年）。用示波器做蛙

5、坐骨神骨干動作電位實驗陰極射線示波器，1922年美國人發(fā)明。細胞外記錄（ Extracellular Recording）實驗階段 劍橋大學Hodgkin和Huxley應用金屬微電極 對烏賊巨神經(jīng)纖維電活動進行系統(tǒng)研究， Hodgkin和 Katz提出離子假說。 1949年，凌寧和Gerard 發(fā)明玻璃微電極。電壓鉗和膜片鉗將電生理研究推向分子水平。用玻璃微電極做細胞電生理實驗尖端直徑0.5m的玻璃微電極細胞內(nèi)記錄（ intracellular Recording）實驗階段動作電位（Action potential, AP）概念：是指可興奮細胞受到刺激時，在靜息電位基礎上產(chǎn)生快速的可傳播的一過

6、性電位波動。 單相動作電位(Monophasic Action Potential)損傷區(qū)興奮區(qū)細胞外引導電極檢流計雙相動作電位( Biphasic Action Potential)興奮區(qū)細胞外引導電極檢流計（引導電極距離小于動作電位波長） 動作電位的傳導 Conduction of AP 動作電位以局部電流的形式傳導 局部電流利用朗飛氏結(jié)的跳躍傳導朗飛氏結(jié)動作電位傳導速度的測定 (Measurement of Conduction Velocity of AP)+St傳導速度測定=SACt刺激器輸入通道R1- Rr1+ R2- R2+刺激偽跡(Stimulus artifact)刺激偽跡A

7、P刺激器放大器+地刺激電流i-i+R+R-地刺激偽跡是刺激電流通過導電介質(zhì)擴散至兩引導電極而形成的電位差信號。影響神經(jīng)纖維興奮性的因素(Factors Affecting Nerve Fibers Excitability)神經(jīng)纖維的直徑有無髓鞘物種溫度藥物（如普魯卡因）、離子（K）等的影響 目的（objective）1掌握蟾蜍坐骨神經(jīng)腓腸肌標本的制備方法2觀察不同刺激強度和頻率刺激對肌肉收縮的影響3.測定蟾蜍坐骨神經(jīng)干復合動作電位（compound action potential,CAP） ，研究蟾蜍坐骨神經(jīng)干的特性、雙相動作電位形成機制及神經(jīng)損傷對神經(jīng)興奮傳導的影響以及神經(jīng)干動作電位的傳

8、導速度的測定。實驗難點實驗重點實驗重點1.材料和方法 (Materials and methods )1.1實驗動物（laboratory animal) 蟾蜍（中華蟾蜍指名亞種，Zhuoshan Toad） 雄性蟾蜍皮膚光滑，前肢趾上有黑色婚墊，會鳴叫。雌性蟾蜍皮膚粗糙，無婚墊，不會鳴叫。1.材料和方法 (Materials and methods )1.2藥品(drug) 任氏液任氏液由無機鹽和蒸餾水配置而成，每升溶液含NaCl 6.5g、KCl 0.14g、CaCl2 0.12g,、NaHCO3 0.20g、NaH2PO4 0.01g。任氏液的理化特性與蛙的組織液近似?？捎糜谕艿慕M織、器

9、官潤濕和營養(yǎng)。1. 3器材( Experimental apparatus)BL420 E+/BL420 F生物機能實驗系統(tǒng)BL420E+生物機能實驗系統(tǒng)可以同時采集、放大、顯示、記錄、分析四路生物信號及一路刺激輸出，12導聯(lián)心電圖輸入記錄，可用于人體和動物實驗。儀器參數(shù)全程控設置，有多種數(shù)據(jù)分析功能和數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換輸出功能。 神經(jīng)干標本盒。 S+ S- E R1 - R1+ R2- R2+S+、S-刺激電極，E接地電極，r1- 、r1+和r2- 、r2+引導電極，蛙類手術器材一套（蛙板、蛙釘、粗剪刀、手術剪、鑷子、刺蛙針、玻璃分針；鋅銅弓；滴管、培養(yǎng)皿、500ml燒杯）張力傳感器1.4制備坐骨神經(jīng)

10、干（ preparation of sciatic nerve trunk ） 蟾蜍毀腦脊髓，去上肢和內(nèi)臟，下肢剝皮浸于任氏液中。 蟾蜍下肢背面向上置于蛙板上，剪去尾椎；標本腹面向上，用玻璃分針分離脊柱兩側(cè)神經(jīng)叢，用線在近脊柱處結(jié)扎，剪斷神經(jīng)；將神經(jīng)干從腹面移向背面。標本背面向上固定，從大腿至跟腱分離坐骨神經(jīng)。坐骨神經(jīng)標本置任氏液中備用。正確持握找到枕骨大孔刺入搗毀腦及脊髓 (觀察反應)剪除上肢及內(nèi)臟剝皮 (剪去肛周一圈)任氏液 5 min; 洗手腹側(cè)朝上 穿線/結(jié)扎/剪斷/輕提剪分支背側(cè)朝上 肌間勾出游離至膝搭 刮 剪(可在后一步做)跟腱扎 剪制備坐骨神經(jīng)干（ preparation of

11、sciatic nerve trunk ）關鍵：游離坐骨神經(jīng)取一條腿放于蛙板上。將標本背側(cè)向上放置，剪斷梨狀肌及其附近的結(jié)締組織，沿坐骨神經(jīng)溝(股二頭肌及半膜肌之間的裂縫處)，找出坐骨神經(jīng)之大腿部分，用玻璃針小心剝離，在神經(jīng)完全暴露后，用粗剪刀剪下與神經(jīng)相連的從脊柱，用鑷子提起小塊脊柱，用手術剪剪斷坐骨神經(jīng)的所有分支，并將神經(jīng)一直游離至膝關節(jié)處。坐骨神經(jīng)腓腸肌制作坐骨神經(jīng)小腿標本 制作坐骨神經(jīng)腓腸肌標本將游離干凈的坐骨神經(jīng)搭于腓腸肌上，在膝關節(jié)周圍剪掉全部大腿肌肉并用粗剪刀將股骨刮干凈，后在股骨中部剪去上段股骨，保留的部分為坐骨神經(jīng)小腿標本。在跟腱處穿線結(jié)扎后剪斷跟腱。游離腓腸肌至膝關節(jié)處，然

12、后沿膝關節(jié)將小腿其余部分全部剪掉，制得個具有附著在股骨上的腓腸肌并帶有支配腓腸肌的坐骨神經(jīng)的標本。殘留股骨坐骨神經(jīng)脊柱片用鋅銅弓檢查標本腓腸肌肌腱上的結(jié)扎線與張力換能器另一端相連張力換能器一端與BL420生物機能實驗系統(tǒng)相連接坐骨神經(jīng)腓腸肌標本的股骨頭固定在肌槽的股骨固定孔內(nèi)earth刺激電極記錄電極1.5 儀器連接標本的放置與固定1.6 記錄動作電位( Record action potential) 神經(jīng)干標本置于標本盒的電極上，神經(jīng)與電極接觸良好，調(diào)節(jié)刺激電壓，記錄動作電位。神經(jīng)干標本肌肉神經(jīng)實驗項目設置刺激強度與反應關系實驗參數(shù)子菜單設置刺激頻率與反應關系實驗參數(shù)子菜單觀察刺激強度與收

13、縮反應的關系 觀察刺激頻率與收縮波形的關系實驗項目菜單項2.1刺激強度與肌肉收縮反應的關系2.2 刺激頻率與收縮反應的關系2. 觀察（observations)連接實驗裝置：實驗項目模塊選擇 刺激器參數(shù)設置：波寬.ms 刺激強度從零開始漸增； 刺激頻率改變可從1Hz漸增為25Hz。實驗觀察： 單收縮的分析 復合收縮實驗注意事項： 1實驗過程中要經(jīng)常用任氏液濕潤標本，每次刺激后應使肌肉休息30秒，連續(xù)刺激不可超過10秒。 2不要用手握住或接觸神經(jīng)。2.3 測定中樞端引導的雙相動作電位（biphasic action potential, BAP) 用1.0V電壓，波寬0.1ms的單個方波激刺激神

14、經(jīng)干末梢端，測定中樞端BAP正、負向振幅(amplitude，A)和時程(duration，D） + - R1-R1 +R2-R2 +中樞端引導的動作電位Central endPeripheral endAc1Dc1Ac2Dc22.4 測定末梢端引導的雙相動作電位 用1.0V電壓，波寬0.1ms的單個方波激刺激神經(jīng)干中樞端，測定末梢端BAP正、負相振幅和時程。Dp1Dp2Ap1Ap2Ap1Ap2+ - R1-R1 +R2-R2 +Peripheral endCentral end2.5興奮傳導速度的測定 用1.0V電壓，波寬0.1ms的單個方波激刺激神經(jīng)干中樞端，測定第1和第2對引導電極引導C

15、AP起點的時間差t ，根據(jù) S R1- R2- / t 計算出AP的傳導速度。S R1- R2- t=S R1- R2-t+ - R1-R1 +R2-R2 +Peripheral endCentral end2.6 觀察刺激強度（U）與動作電位振幅的關系 刺激波寬0.1ms，刺激電壓從0.1V開始， 按步長0.05V增加，刺激電壓每增加一次刺激神經(jīng)干一次，并記錄刺激電壓和MAP振幅。 圖 刺激強度與動作電位振幅的關系A（mV)U(V)Maximal stimulusThreshold stimulus要求：測定閾強度和最大刺激強度，刺激強度與動作電位振幅的關系曲線神經(jīng)干引導所獲得復合動作電位（

16、 compound action potential (CAP）與單神經(jīng)纖維引導的動作電位的性質(zhì)有所不同。AmDm條件：刺激電壓1V, 刺激波寬0.1ms2.7 測定單相動作電位（monophasic action potential，MAP） 用鑷子夾傷對1對引導電極間的神經(jīng)干，然后用1.0V電壓，波寬0.1ms的單個方波激刺激神經(jīng)干中樞端，測定末梢端MAP振幅和時程。+ - R1-R1 +R2-R2 +Peripheral endCentral end2. 觀察項目（observations)2.1 刺激強度與肌肉收縮反應的關系2.2 刺激頻率與收縮反應的關系2.3 測定中樞端引導的雙相動

17、作電位（biphasic action potential, BAP)。用1.0V電壓，波寬0.1ms的單個方波激刺激神經(jīng)干末梢端，觀察中樞端BAP正、負向振幅(amplitude，A)和時程(duration，D） 2.4 測定末梢端引導的雙相動作電位。用1.0V電壓，波寬0.1ms的單個方波激刺激神經(jīng)干中樞端，測定末梢端BAP正、負相振幅和時程。2.5 興奮傳導速度的測定。用1.0V電壓，波寬0.1ms的單個方波激刺激神經(jīng)干中樞端，測定第1和第2對引導電極引導CAP起點的時間差t ，根據(jù) S R1- R2- / t 計算出AP的傳導速度。2.6 觀察刺激強度（U）與動作電位振幅的關系 刺激

18、波寬0.1ms，刺激電壓從0.1V開始， 按步長0.05V增加，刺激電壓每增加一次刺激神經(jīng)干一次，并記錄刺激電壓和MAP振幅。2.7 測定單相動作電位（monophasic action potential，MAP）。用鑷子夾傷對1對引導電極間的神經(jīng)干，然后用1.2V電壓，波寬0.1ms的單個方波激刺激神經(jīng)干中樞端，測定末梢端MAP振幅和時程。3.1 刺激強度與肌肉收縮反應的關系閾強度閾刺激閾上刺激最適強度分析閾強度和最適刺激強度？3.結(jié)果 （results）3.2 刺激頻率與收縮反應的關系單收縮不完全強直收縮完全強直收縮骨骼肌單收縮分析分析三個時期？臨界融合刺激頻率？3.3 刺激波寬？時，閾

19、刺激Uth為？；最大刺激Umaxs V，刺激電壓1.0V時，動作電位的傳導速度為 s （m/s)見表1。nUth (v)Umax (V) (m/s)123xs表1 蟾蜍坐骨神經(jīng)干閾刺激、最大刺激和傳導速度3.4 刺激電壓1.0V，刺激波寬0.1ms時，中樞端引導的動作電位正相和負相振幅分別為Ac1s mV和Ac2s mV; 末梢端引導的動作電位正相振幅Ap1s mV大于負相振幅Ap2s mV， 兩者有（或無）顯著性差異（p0.05)；見圖1。 3.5 用1.0V電壓，波寬0.1ms的單個方波激刺激神經(jīng)干中樞端，測定第1和第2對引導電極引導CAP起點的時間差t ，根據(jù) S R1- R2- / t

20、 計算出AP的傳導速度。3.6 刺激電壓1.0V時，單相動作電位振幅Ams mV大（小)于雙相動作電位正相振幅Ap1s mV，兩者有（或無）顯著性差異（p0.05)；單相動作時程Dms ms顯著長于雙相動作電位正相Dp1s ms，兩者有（或無）顯著性差異（p0.05)，見圖1、圖2。Ap1Ap2Dp1Dp1t圖1 蟾蜍坐骨神經(jīng)干雙相動作電位圖2 蟾蜍坐骨神經(jīng)干單相動作電位AmDm3.7在刺激電壓低于Uthreshold時，測不到動作電位；刺激電壓從Uthreshold增加至Umaximal，動作電位振幅呈曲線增長，刺激電壓高于Umaximal動作電位振幅不再增長，見圖3。A（mV)圖3 刺激強

21、度與動作電位振幅的關系U(V)0.51.01.52464. 討論(discussion)4.4 在兩引導電極間夾傷神經(jīng)，神經(jīng)沖動傳導被阻斷，雙相動作電位負相波消失，形成一相正波，于此可見，雙相動作電位是神經(jīng)沖動先后通過兩個引導電極形成的，沖動通過第1個電極，形成動作電位的正相波，沖動通過第2個電極，形成動作電位的負相波。4.1 刺激電壓從Uth增加至Umax，神經(jīng)干動作電位振幅隨刺激電壓增加而增高。神經(jīng)干動作電位不具有“全或無”性質(zhì)。坐骨神經(jīng)干為不同類型的神經(jīng)纖維組成，各個類型纖維的興奮性水平不同1，在一個有限的范圍內(nèi)神經(jīng)干動作電位的大小與刺激的強度成比例2 。4.2 蛙神經(jīng)沖動的傳導速度在20時約為每秒30米 3 ，本實驗所測得的蟾蜍坐骨神經(jīng)干動作電位的傳導速度為.4.3 刺激蟾蜍坐骨神經(jīng)干中樞端，可在其末梢端引導出動作電位，反之也然，由此可以證明離體蟾蜍坐骨神經(jīng)具有雙向傳導興奮的能力。4.5 刺激神經(jīng)干中樞端在其末梢端引導所得BAP和刺激神經(jīng)干末梢端在其中樞端引導所得BAP，正相振幅均大于等于負相振幅，正相時程均小于負相時程，由此表明在蟾蜍坐骨神經(jīng)干AP引導時，兩引導電極處神經(jīng)纖維的多寡不是形成BAP正相振幅大于負相振幅和正相時程小于負相時程的主要原