抗生素類藥物和分析課件

1、藥物分析主講: 羅容珍Pharmaceutical Analysis第十一章 抗生素類藥物的分析10/12/2022藥物分析主講: 羅容珍Pharmaceutical AnalContents概 述1-內酰胺類2氨基糖苷類3四環(huán)素類4高分子雜質檢查510/12/2022Contents概 述1-內酰胺類2氨基糖苷類3四環(huán)素類4第一節(jié) 概述1.抗生素（antibiotics） 在低微濃度下即可對某些生物（病原微生物）的生命活動有特異抑制作用的化學物質的總稱2.分類 內酰胺類(青霉素類、頭孢菌素類) 氨基糖苷類(鏈霉素、慶大霉素、依替米星) 四環(huán)素類(四環(huán)素、金霉素、土霉素) 大環(huán)內酯類(紅霉素、

2、螺旋霉素、麥迪霉素) 多烯大環(huán)類(制霉菌素、兩性霉素B) 多肽類(多黏菌素、放線菌素)10/12/2022第一節(jié) 概述1.抗生素（antibiotics）2.分類 第一節(jié) 概述3.來源 生物合成（發(fā)酵） 化學合成或半合成4.特點 化學純度較低 活性組分易發(fā)生變異 穩(wěn)定性差10/12/2022第一節(jié) 概述3.來源 生物合成（發(fā)酵） 4.特點 化學純度較第一節(jié) 概述5.抗生素質量分析生物學法、物理化學法 鑒別：理化方法、微生物法 檢查：水分、pH值、異常毒性、熱原、細菌內毒素、降壓物質等 含量/效價測定： 微生物法 ： 與臨床療效吻合,靈敏度高，結果直觀，適用范圍廣；但操作復雜費時，誤差大 理化方

3、法：準確度與專屬性較高, 且操作簡便；但與臨床療效有偏差10/12/2022第一節(jié) 概述5.抗生素質量分析生物學法、物理化學法 鑒別第二節(jié) 內酰胺類 青霉素(芐青霉素) (penicillins)氨芐西林阿莫西林10/12/2022第二節(jié) 內酰胺類 青霉素(芐青霉素) (penicill第二節(jié) 內酰胺類頭孢氨芐頭孢拉定頭孢羥氨芐頭孢噻吩鈉10/12/2022第二節(jié) 內酰胺類頭孢氨芐頭孢拉定頭孢羥氨芐頭孢噻吩鈉10第二節(jié) 內酰胺類6-aminopenicillanic acid,簡稱6-APA青霉素類7-aminocephalosporanic acid,簡稱7-ACA頭孢菌素類氫化噻唑環(huán)氫化噻

4、嗪環(huán)10/12/2022第二節(jié) 內酰胺類6-aminopenicillanic 第二節(jié) 內酰胺類一、結構與性質1.酸性（羧基） pKa 2.5-2.8，酸性較強。堿金屬鹽水溶性好，有機堿鹽難溶于水。普魯卡因青霉素10/12/2022第二節(jié) 內酰胺類一、結構與性質1.酸性（羧基） pKa 第二節(jié) 內酰胺類2.手性C （旋光性）3.UV青霉素類：苯環(huán)取代基頭孢菌素類：母核有共軛結構260nm10/12/2022第二節(jié) 內酰胺類2.手性C （旋光性）3.UV4. 內酰胺環(huán)(四元環(huán)張力+酰胺鍵 ) 第二節(jié) 內酰胺類干燥條件較穩(wěn)定，溶液不穩(wěn)定某些氧化劑、金屬離子、溫度10/12/20224. 內酰胺環(huán)(

5、四元環(huán)張力+酰胺鍵 ) 第二節(jié) 內酰第二節(jié) 內酰胺類二、Identification(一)色譜法HPLC (tR)TLC (Rf)(二)光譜法IR UVNMR10/12/2022第二節(jié) 內酰胺類二、Identification(一)色第二節(jié) 內酰胺類10/12/2022第二節(jié) 內酰胺類10/10/2022第二節(jié) 內酰胺類10/12/2022第二節(jié) 內酰胺類10/10/2022第二節(jié) 內酰胺類頭孢利定的NMR鑒別法(JP14)取本品50mg溶于0.5ml重水中，測定NMR光譜時，應顯示3.8 附近 6.97.5 7.99.0 單峰信號 多重峰信號 多重峰信號 2 ： 3 ： 510/12/202

6、2第二節(jié) 內酰胺類頭孢利定的NMR鑒別法(JP14)取本品第二節(jié) 內酰胺類(三)呈色反應1）羥肟酸鐵反應內酰胺環(huán)內酰胺類NH2OHHClNaOH羥肟酸 Fe3+ H+顯色（紅、棕、褐）2）茚三酮反應-氨基 茚三酮 藍紫色10/12/2022第二節(jié) 內酰胺類(三)呈色反應1）羥肟酸鐵反應內第二節(jié) 內酰胺類3）雙縮脲反應內酰胺類 堿性酒石酸銅紫色10/12/2022第二節(jié) 內酰胺類3）雙縮脲反應內酰胺類 堿性酒第二節(jié) 內酰胺類4）變色酸-硫酸反應H2SO4 HCHO變色酸（縮合）顯色5）重氮苯磺酸反應酚羥基（偶合）6）銅鹽反應頭孢氨芐的專屬反應10/12/2022第二節(jié) 內酰胺類4）變色酸-硫酸反

7、應H2SO4HCHO變7）硫酸-甲醛反應(BP)第二節(jié) 內酰胺類青霉素鉀和青霉素鈉呈紅棕色(四)焰色反應K+、Na+三、Purity Test(聚合物、有關物質、異構體等)1.聚合物頭孢他啶中聚合物測定10/12/20227）硫酸-甲醛反應(BP)第二節(jié) 內酰胺類青霉素鉀和青霉第二節(jié) 內酰胺類色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗 用葡聚糖凝膠G-10（40120m）為填充劑，玻璃柱內徑1.31.6cm，床體積5060ml；流動相A為含3.5%硫酸銨的0.1mol/L磷酸鹽緩沖液（取磷酸氫二鈉2.19g和磷酸二氫鈉0.54g，加水100ml使溶解，調節(jié)pH至7.0），流動相B為水；流速為0.8ml/min；

8、檢測波長為254nm。以流動相A為流動相，用0.1mg/ml藍色葡聚糖2000溶液進樣200l進行測定，理論板數應不低于900，拖尾因子在0.751.5。兩種流動相系統(tǒng)中藍色葡聚糖的保留時間比應在0.931.07之間。對照品溶液以流動相B為流動相，重復進樣200l，峰面積值的相對標準差應小于5.0%。對照品溶液的制備 取頭孢他啶對照品適量，精密稱定，加水制成每1ml中含頭孢他啶100g的溶液，搖勻10/12/2022第二節(jié) 內酰胺類色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗 第二節(jié) 內酰胺類測定法 取本品適量，精密稱定，加水制成每1ml中約含頭孢他啶20mg的溶液，立即進樣200l，以流動相A為流動相進行測定，

9、記錄色譜圖；另取對照品溶液200l注入液相色譜儀，以流動相B為流動相，記錄色譜圖，按外標法計算，本品含頭孢他啶聚合物以頭孢他啶計不得過0.3% 主成分自身對照法 面積歸一化法 限量法 自身對照外標法10/12/2022第二節(jié) 內酰胺類測定法 取本品適量，精密稱定，加水制成 萄聚糖凝膠立體網狀結構圖原理“分子篩”第二節(jié) 內酰胺類10/12/2022 萄聚糖凝膠原理“分子篩”第二節(jié) 內酰胺類10/10第二節(jié) 內酰胺類2.有關物質與異構體頭孢呋辛酯中有關物質和異構體的檢查 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗：ODS分析柱；0.2mol/L磷酸二氫銨-甲醇（62:38）為流動相，流速1ml/min；檢測波長27

10、8 nm。要求頭孢呋辛酯A，B異構體之間，頭孢呋辛酯A異構體與頭孢呋辛酯2-異構體之間的分離度應大于1.5；理論板數按頭孢呋辛酯A異構體峰計算，應不低于1500異構體 取本品適量，配制成每1ml中約含0.25mg的溶液，取20l注入液相色譜儀，記錄色譜圖。B異構體峰的相對保留時間約為0.85，A異構體峰的相對保留時間為1.0。10/12/2022第二節(jié) 內酰胺類2.有關物質與異構體頭孢呋辛酯中有關物質第二節(jié) 內酰胺類40020600302010時間(min)峰高(mAU)65432113.95411.9192.401供試品色譜圖中A異構體峰的面積與A、B異構體峰的面積和之比應為0.480.55

11、。BA3-EE10/12/2022第二節(jié) 內酰胺類40020600302010時間(min第二節(jié) 內酰胺類有關物質 取本品適量，精密稱定，加流動相制成約含0.25mg/ml的溶液，作為供試品溶液；精密量取適量，加流動相制成2.5 g/ml的溶液，作為對照溶液。取對照溶液20l注入液相色譜儀，調節(jié)儀器靈敏度，使主成分峰高約為記錄儀滿量程的10%，再取供試品溶液和對照品溶液各20l，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖至主峰保留時間的3.5倍，供試品溶液如顯雜質峰，量取各雜質峰面積的和，其中E異構體峰面積不得大于對照溶液主峰面積之和(1.0%)，3-異構體峰面積不得大于1.5倍(1.5%)，其余單個雜質

12、峰面積的和不得大于3倍(3.0%)。(供試品溶液中任何小于對照品溶液主峰面積之和0.05倍的峰可忽略不計)10/12/2022第二節(jié) 內酰胺類有關物質 取本品適量，精密稱定，加流3.UV第二節(jié) 內酰胺類4.有機溶劑5.結晶性第一法(偏光顯微鏡法)第二法(X射線粉末衍射法)四、Assay 碘量法 汞量法 酸堿滴定法 羥肟酸比色法 HPLC法10/12/20223.UV第二節(jié) 內酰胺類4.有機溶劑5.結晶性第一法(偏第二節(jié) 內酰胺類阿莫西林克拉維酸鉀片色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗 用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以磷酸鹽緩沖液(取磷酸二氫鈉7.8g，加水900 ml溶解，用磷酸或10mol/L氫氧化鈉

13、溶液調節(jié)pH值至4.40.1，加水稀釋至1000ml)-甲醇(95:5)為流動相；流速為0.7ml/min；檢測波長為220nm。阿莫西林峰與克拉維酸峰的分離度應大于3.5 測定法 取本品10片，置1000ml量瓶中，加水適量，振搖使溶解，加水稀釋至刻度，搖勻，精密量取10ml，置50ml量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液10l注入液相色譜儀，記錄色譜圖；另取阿莫西林對照品與克拉維酸對照品各適量，加水溶解，制成每1ml中含阿莫西林0.5mg和克拉維酸0.25mg的混合溶液，同法測定。按外標法以峰面積分別計算供試品中C16H19N3O5S和C8H9NO5的含量。10/12/2022第二

14、節(jié) 內酰胺類阿莫西林克拉維酸鉀片色譜條件與系統(tǒng)適用性第二節(jié) 內酰胺類10/12/2022第二節(jié) 內酰胺類10/10/2022第三節(jié) 氨基糖苷類 氨基環(huán)醇+氨基糖苷鏈霉素(Streptomycin)10/12/2022第三節(jié) 氨基糖苷類 氨基環(huán)醇+氨基糖苷鏈霉素10/10/第三節(jié) 氨基糖苷類巴龍霉素(paromomycin)D-葡萄糖胺脫氧鏈霉胺巴龍胺D核糖巴龍霉糖巴龍二糖胺10/12/2022第三節(jié) 氨基糖苷類巴龍霉素D-葡萄糖胺脫氧鏈霉胺巴龍胺D第三節(jié) 氨基糖苷類慶大霉素(gentamycin)絳紅糖胺(紫素胺)2-脫氧鏈霉胺加洛糖胺(N-甲基-3-去氧-4-甲基戊糖胺)10/12/2022

15、第三節(jié) 氨基糖苷類慶大霉素絳紅糖胺(紫素胺)2-脫氧鏈霉胺加第三節(jié) 氨基糖苷類一、結構與性質1）堿性（氨基）：臨床應用其硫酸鹽2）溶解度（氨基、羥基）：水溶性3）旋光性（糖）：多個手性碳4）穩(wěn)定性（苷）：強酸、堿條件均可水解10/12/2022第三節(jié) 氨基糖苷類一、結構與性質1）堿性（氨基）：臨床應用其二、Identification第三節(jié) 氨基糖苷類坂口反應麥芽酚反應N-甲基葡萄糖胺反應10/12/2022二、Identification第三節(jié) 氨基糖苷類坂口反應麥第三節(jié) 氨基糖苷類1.茚三酮反應羥基胺類,-氨基酸2. Molisch 試驗 五碳糖或六碳糖結構紅紫色羥甲基糠醛(含六碳糖結構氨

16、基糖苷類酸性水解產物)10/12/2022第三節(jié) 氨基糖苷類1.茚三酮反應羥基胺類,-氨基酸2第三節(jié) 氨基糖苷類藍紫色3. N-甲基葡萄糖胺反應（Elson-Morgan反應）乙酰丙酮OH-吡咯衍生物對二甲氨基苯甲醛H+紅色10/12/2022第三節(jié) 氨基糖苷類藍紫色3. N-甲基葡萄糖胺反應（Elso第三節(jié) 氨基糖苷類乙酰丙酮OH-對二甲氨基苯甲醛H+10/12/2022第三節(jié) 氨基糖苷類乙酰丙酮OH-對二甲氨基苯甲醛H+10/1第三節(jié) 氨基糖苷類4.麥芽酚反應鏈霉糖特有反應H+5.坂口反應鏈霉胍特有反應鏈霉素OH-水解8-羥基喹啉 NaOBr或-萘酚 鏈霉胍橙紅色6.硫酸鹽反應10/12/

17、2022第三節(jié) 氨基糖苷類4.麥芽酚反應鏈霉糖特有反應H+5.坂7.色譜法8.光譜法第三節(jié) 氨基糖苷類三、Purity Test1.鏈霉素中鏈霉素B（甘露糖鏈霉素）的檢查來源：發(fā)酵中產生方法：TLC中的對照品法2.硫酸奈替米星中西索米星的檢查(TLC)3.慶大霉素C組分的測定10/12/20227.色譜法第三節(jié) 氨基糖苷類三、Purity Test1.鏈第三節(jié) 氨基糖苷類色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗：用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以水冰醋酸甲醇(25:5:70) 配制的0.02mol/L庚烷磺酸鈉溶液為流動相（必要時調節(jié)甲醇的含量）；檢測波長為330nm 。理論板數按C2組分峰計算應不低于200

18、0。C2a 峰和C2峰的分離 度應符合要求。 測定法 取本品適量，精密稱定，加水制成每1ml 中含0.65mg的溶液，精密量取4.0 ml，置10ml量瓶中，加異丙醇2ml與鄰苯二醛試液1.6ml，用異丙醇稀釋至刻度，搖勻，置60水浴中加熱15分鐘，冷卻，濾過，取續(xù)濾液10l 注入液相色譜儀，記錄色譜圖； 另取慶大霉素標準品，同法測定。C組分的保留時間依次為：C1、C1a、C2a、C2。量取C1、C1a、C2a、C2的峰面積。 C1應為2550，C1a應為1540，C2aC2應為2050 。 10/12/2022第三節(jié) 氨基糖苷類色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗：用十八烷基硅烷鍵第三節(jié) 氨基糖苷類慶大

19、霉素無紫外吸收，需進行衍生化處理后再進行HPLC測定。max = 330nm10/12/2022第三節(jié) 氨基糖苷類慶大霉素無紫外吸收，需進行衍生化處理后再進討論第三節(jié) 氨基糖苷類1、柱效：以C2峰計算，理論板數應不低于2000，在此柱效下各組分之間才能達到規(guī)定的分離度。為此色譜柱做適當選擇。2、流動相：流動相極性適當控制(適當調節(jié)甲醇的比例)。 極性過強，出峰快，分離不佳。C1峰與衍生試劑等雜質峰難分析;極性過弱，出峰太慢。實驗表明，C2峰的保留時間控制在20min30min較為適宜。3、衍生化試劑與衍生物的穩(wěn)定性：配制后不能久置，時間久了試劑峰峰高增加并影響組分測定，一般避光保存可使用三天。

20、生成的衍生物不穩(wěn)定。4、離子對試劑濃度影響：離子對試劑濃度對慶大霉素OPA衍生物保留值有影響。10/12/2022討論第三節(jié) 氨基糖苷類1、柱效：以C2峰計算，理論板數應不低第三節(jié) 氨基糖苷類 BP(2005)HPLC-ECD Ch.PHPLC-ELSD4.硫酸鹽測定EDTA滴定四、Assay微生物檢定法HPLC法10/12/2022第三節(jié) 氨基糖苷類 BP(2005)HPLC-ECD4.第四節(jié) 四環(huán)素類ABCD12345678910111210/12/2022第四節(jié) 四環(huán)素類ABCD12345678910111210/一、結構與性質第四節(jié) 四環(huán)素類1）兩性： -OH酸性 N(CH3)2堿性

21、Ca2+、Mg2+生成不溶性鹽；Fe3+形成紅色配合物； Al3+形成黃色配合物 ；pH3 7.5 多價陽離子與酚二酮熒光 與酸、堿均可成鹽； 臨床多用鹽酸鹽； 強酸或強堿中溶解度 2）旋光性3）UV和熒光 4）與金屬離子絡合(酚羥基、烯醇基)10/12/2022一、結構與性質第四節(jié) 四環(huán)素類1）兩性： -OH酸性 弱酸性（pH2-6） A環(huán)C-4異構化 差向四環(huán)素酸性（pH 2） C環(huán)脫水 脫水四環(huán)素 堿性 C環(huán)開環(huán)，形成內酯 異四環(huán)素5）不穩(wěn)定性第四節(jié) 四環(huán)素類A.差向異構化藍色熒光淡黃黑10/12/2022弱酸性（pH2-6） A環(huán)C-4異構化 差向四環(huán)素第四節(jié) 四環(huán)素類AApH2.06

22、.0（氫鍵，土霉素、多西環(huán)素不易差向異構化）10/12/2022第四節(jié) 四環(huán)素類AApH2.06.0（氫鍵，土霉素、多西環(huán)第四節(jié) 四環(huán)素類B.酸性脫水降解max = 445nmmax = 435nmDDDCBBCBC10/12/2022第四節(jié) 四環(huán)素類B.酸性脫水降解max = 445nmmC.堿性脫水降解第四節(jié) 四環(huán)素類OH-10/12/2022C.堿性脫水降解第四節(jié) 四環(huán)素類OH-10/10/2022第四節(jié) 四環(huán)素類二、Identification1、HPLC2、TLC (正相分配薄層色譜)EDTA克服痕量金屬造成的拖尾現象3、IR4、UV5、顯色法濃硫酸三氯化鐵10/12/2022第四節(jié)

23、 四環(huán)素類二、Identification1、HPLC200nm300nm400nmTC第四節(jié) 四環(huán)素類三、Purity Test1.有關物質HPLC2.雜質吸光度UV268nm355nm10/12/2022200nm300nm400nmTC第四節(jié) 四環(huán)素類三、Pur第五節(jié)、高分子雜質的檢查生產過程貯存過程使用不當高分子雜質內源性(藥物自身聚合物 )外源性(蛋白、多肽、多糖及其與藥物的結合物 )發(fā)酵過程控制重點10/12/2022第五節(jié)、高分子雜質的檢查生產過程高分子雜質內源性(藥物自身聚第五節(jié)、高分子雜質的檢查1.基本結構青霉素族多肽（青霉素噻唑多肽）聚合物母核參于反應側鏈參于反應頭孢菌素族

24、與母核有關的N型聚合反應側鏈參與反應的L型聚合反應10/12/2022第五節(jié)、高分子雜質的檢查1.基本結構青霉素族多肽（青霉素噻唑第五節(jié)、高分子雜質的檢查2.特點（1）發(fā)酵中產生的任何蛋白及蛋白碎片均可帶入產品中，相同的蛋白或蛋白碎片上可以結合不同數目的藥物分子，形成青霉素噻唑多肽類雜質。（2）有不同聚合度和不同機理聚合反應形成的聚合物，聚合物發(fā)生不同程度的降解作用。（3）以異構體存在樣品，同聚和異聚反應可同時發(fā)生。（4）高分子雜質的種類、數量與生產工藝密切相關（溶媒結晶、噴霧干燥）10/12/2022第五節(jié)、高分子雜質的檢查2.特點（1）發(fā)酵中產生的任何蛋白及第五節(jié)、高分子雜質的檢查3.雜質

25、控制方法反相高效液相、離子交換色譜和凝膠色譜。葡聚糖凝膠SephadexC10自身對照外標法10/12/2022第五節(jié)、高分子雜質的檢查3.雜質控制方法反相高效液相、離子交Thank You !10/12/2022Thank You !10/10/2022青霉素的降解反應青霉素青霉噻唑酸H2O/OH青霉素酶青霉酸H2OpH2100青霉噻唑?；u胺酸NH2OH青霉烯酸pH4青霉胺CO2青霉醛HgCl210/12/2022青霉素的降解反應青霉素青霉噻唑酸H2O/OH青霉素酶青霉酸10/12/202210/10/20221. 熟悉抗生素類藥物分析的特點及其 常規(guī)檢驗項目。了解抗生素類藥物 的分析現狀

26、，熟悉生物學法與物理 化學法測定效價的原理及優(yōu)缺點。2. 掌握內酰胺類抗生素的結構、 性質、鑒別及含量測定。第十一章 復習內容10/12/20221. 熟悉抗生素類藥物分析的特點及其第十一章 復習內容3. 掌握氨基糖苷類抗生素的結構、性 質及鑒別，了解其檢查及含量測定4. 掌握四環(huán)素類抗生素的結構及性質，了解其鑒別、檢查及含量測定5. 了解抗生素類藥物的質量考察方法10/12/20223. 掌握氨基糖苷類抗生素的結構、性 質及鑒別，了解其檢查99：89下列哪個藥物會發(fā)生羥肟酸 鐵反應 A. 青霉素 B. 慶大霉素 C. 紅霉素 D. 鏈霉素 E. 維生素C 10/12/202299：89下列哪個藥物會發(fā)生羥肟酸10/10/202299m：71中國藥典(2005年版)測定頭 孢菌素類藥物的含量時，多 數采用的方法是 A. 微生物法 B. 碘量法 C. 汞量法 D. 正相高效液相色譜法 E. 反相高效液相色譜法10/12/202299m：71中國藥典(2005年版)測定頭 10/10/295：139屬于-內酰胺類的抗生素藥 物有 A. 青霉素 B. 紅霉素 C. 頭孢菌素 D. 慶大霉素 E. 四環(huán)素