大腸菌群測定課件

1、關(guān)于大腸菌群測定第1頁，共23頁，2022年，5月20日，20點5分，星期三大腸菌群的定義 大腸菌群：一群在37，經(jīng)24h能發(fā)酵乳糖，并產(chǎn)酸產(chǎn)氣，需氧或兼性厭氧生長的革蘭氏陰性的無芽孢桿菌。 其中包括有大腸桿菌（也稱大腸埃希氏菌）、腸桿菌屬、枸櫞酸菌屬、克雷伯氏菌屬中的一部分和沙門氏菌屬的第亞屬。P139第2頁，共23頁，2022年，5月20日，20點5分，星期三大腸桿菌的定義大腸桿菌指革蘭氏陰性無芽孢桿菌、乳糖發(fā)酵產(chǎn)酸產(chǎn)氣、IMViC試驗（靛基質(zhì)、MR、V-P、檸檬酸鹽試驗）為+-或-+-的細菌。大腸桿菌（也稱大腸埃希氏菌），分類于腸桿菌科，歸屬于埃希氏菌屬。與人類有關(guān)的大腸桿菌統(tǒng)稱為致瀉性

2、大腸桿菌，包括五種：腸毒素性大腸桿菌（ETEC）、致病性大腸桿菌（EPEC）、出血性大腸桿菌（EHEC）、侵襲性大腸桿菌（EIEC）、黏附性大腸桿菌（EAEC）。第3頁，共23頁，2022年，5月20日，20點5分，星期三大腸菌群和大腸桿菌的關(guān)系耐熱大腸菌群的定義：能在液體乳糖培養(yǎng)基中35/37 培養(yǎng)48h產(chǎn)酸產(chǎn)氣，并在44.5培養(yǎng)24h產(chǎn)酸產(chǎn)氣的細菌（依據(jù)ISO標(biāo)準(zhǔn)）第4頁，共23頁，2022年，5月20日，20點5分，星期三衛(wèi)生學(xué)意義大腸菌群和大腸桿菌作為食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的意義在于，是評價衛(wèi)生質(zhì)量的重要指標(biāo)，作為食品中的糞便污染指標(biāo)。另外，腸道致病菌如沙門氏菌屬和志賀氏菌屬等，對食品安全性威脅

3、很大。經(jīng)常檢驗致病菌有一定困難。而食品中的大腸菌群較容易檢出，腸道致病菌與大腸菌群的來源相同，而且在一般條件下大腸菌群在外環(huán)境中生存時間也與主要腸道致病菌一致所以大腸菌群的另一重要食品衛(wèi)生意義是作為腸道致病菌污染食品的指示菌大腸菌群數(shù)的高低，表明了糞便污染的程度，也反映了對人體健康危害性的大小。第5頁，共23頁，2022年，5月20日，20點5分，星期三大腸桿菌的生物學(xué)特性基本形態(tài)： 此菌為兩端鈍圓的短小桿菌，一般約0.5-0.8m*1.0-3.0 m，多單獨存在或成雙，但不呈長鏈排列。約50%的菌株有周生鞭毛，但多數(shù)只有1-4根，一般不超過10根，故菌體動力弱。多數(shù)菌株有菌毛，有的有莢膜或微

4、莢膜，不形成芽孢，對普通堿性染料著色良好，革蘭氏染色陰性。第6頁，共23頁，2022年，5月20日，20點5分，星期三大腸桿菌的生物學(xué)特性培養(yǎng)特性：大腸桿菌合成代謝能力強，在含無機鹽、銨鹽、葡萄糖的普通培養(yǎng)基上生長良好。最適生長溫度為37，在42-44 條件下仍能生長，生長溫度范圍15-46 。 在普通營養(yǎng)瓊脂上有3種菌落形態(tài)： 1）光滑型：菌落邊緣整齊，表面有光澤、濕潤、 光滑、呈灰色，在生理鹽水中易分散； 2）粗糙型：菌落扁平、干澀、邊緣不整齊，易 在生理鹽水中自凝； 3）黏液型：常為含有莢膜的菌株。第7頁，共23頁，2022年，5月20日，20點5分，星期三 食品中大腸菌群數(shù)是以每100

5、mL（g）檢樣內(nèi)大腸菌群最近似數(shù)（MPN）表示。大腸菌群數(shù)的定義第8頁，共23頁，2022年，5月20日，20點5分，星期三P142第9頁，共23頁，2022年，5月20日，20點5分，星期三 GB/T 4789.3-2010大腸菌群 初發(fā)酵復(fù)發(fā)酵24 2h 48 2h大腸菌群MPN計數(shù)法操作步驟第10頁，共23頁，2022年，5月20日，20點5分，星期三實驗材料檢測樣品：奶粉設(shè)備和材料：恒溫培養(yǎng)箱、天平、搖床、無菌移液管（1ml）、無菌錐形瓶、無菌試管、小倒管、精密pH試紙培養(yǎng)基和試劑：LST肉湯、BGLB肉湯、無菌生理鹽水、1mol/L NaOH 、1mol/L HCl第11頁，共23頁

6、，2022年，5月20日，20點5分，星期三實驗步驟：前期準(zhǔn)備每個小組準(zhǔn)備器材：移液管1mlX6、10mlX2、錐形瓶500mlX2、試管X14準(zhǔn)備試劑：配制：LST肉湯（1000ml）和BGLB肉湯 生理鹽水（500ml） 第12頁，共23頁，2022年，5月20日，20點5分，星期三相關(guān)配方第13頁，共23頁，2022年，5月20日，20點5分，星期三相關(guān)配方生理鹽水：8.5g+1000ml蒸餾水（一錐形瓶瓶裝225ml，剩下的裝在另外一個錐形瓶中）第14頁，共23頁，2022年，5月20日，20點5分，星期三將相關(guān)玻璃儀器進行滅菌前包裝將配制好的LST肉湯加入試管中（注意1），然后小心將

7、小倒管放入肉湯中（注意2）（每組10支）將所有東西包扎好放入滅菌鍋中滅菌20min實驗步驟：前期準(zhǔn)備第15頁，共23頁，2022年，5月20日，20點5分，星期三實驗步驟：檢樣稀釋稱取25g樣品加入225ml生理鹽水中搖床勻質(zhì)制成1:10樣品勻液取一支無菌試管+9ml生理鹽水+1ml1:10樣品制成1:100稀釋液如2方法制成1:1000稀釋液（注意3）分別標(biāo)注好標(biāo)號第16頁，共23頁，2022年，5月20日，20點5分，星期三實驗步驟：初發(fā)酵用1ml無菌移液管分別吸取3個稀釋度的稀釋樣品至LST肉湯發(fā)酵試管中（每一稀釋度3管）加好后塞好試管塞，放進培養(yǎng)箱培養(yǎng)24-48h第17頁，共23頁，2

8、022年，5月20日，20點5分，星期三實驗步驟：復(fù)發(fā)酵將LTS發(fā)酵管取出，觀察倒管是否有氣泡，將初發(fā)酵產(chǎn)氣的管數(shù)種類進行記錄注意：在發(fā)酵試驗工作中，經(jīng)常可以看到在發(fā)酵倒管內(nèi)極微少的氣泡（有時比小米粒還?。袝r可以遇到在初發(fā)酵時產(chǎn)酸或沿管壁有緩緩上浮的小氣泡。實驗表明，大腸菌群的產(chǎn)氣量，多者可以使發(fā)酵倒管全部充滿氣體，少者可以產(chǎn)生比小米粒還小的氣泡。如果對產(chǎn)酸但未產(chǎn)氣的乳糖發(fā)酵如有疑問時，可以用手輕輕打動試管，如有氣泡沿管壁上浮，即應(yīng)考慮可能有氣體產(chǎn)生，而應(yīng)作進一步試驗。 第18頁，共23頁，2022年，5月20日，20點5分，星期三實驗步驟：復(fù)發(fā)酵與結(jié)果準(zhǔn)備BGLB肉湯發(fā)酵管（分裝、滅菌等

9、）用接種環(huán)接一環(huán)產(chǎn)氣的LTS發(fā)酵管至BGLB發(fā)酵管中，并記號放進培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h取出觀察倒管是否產(chǎn)氣，如果兩種發(fā)酵管均產(chǎn)氣則證實為大腸菌群陽性，并根據(jù)管數(shù)查MPN檢測表（P142-143），得出MPN值第19頁，共23頁，2022年，5月20日，20點5分，星期三大腸菌群測定MPN法檢驗幾點說明MPN檢索表： MPN 為最大可能數(shù)(Most Probable Number)的簡稱。這種方法，對樣品進行連續(xù)系列稀釋，加入培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，從規(guī)定的反應(yīng)呈陽性管數(shù)的出現(xiàn)率，用概率論來推算樣品中菌數(shù)最近似的數(shù)值。MPN檢索表只給了三個稀釋度，如改用不同的稀釋度，則表內(nèi)數(shù)字應(yīng)相應(yīng)降低或增加10倍。第20頁

10、，共23頁，2022年，5月20日，20點5分，星期三初發(fā)酵和證實試驗： 1）兩步法進行了兩次乳糖發(fā)酵試驗。初發(fā)酵和證實實驗所用培養(yǎng)基不同，但都是為了證實培養(yǎng)物是否符合大腸菌群的定義，即“在37分解乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣”。 LST中提供了磷酸鹽緩沖體系，氯化鈉可維持滲透壓，月桂基硫酸鈉可抑制非大腸菌群的生長，這個緩沖蛋白胨乳糖肉湯允許“緩慢乳糖發(fā)酵（Slow lactose fermentations）”來促進菌體產(chǎn)氣。BGLB中膽鹽和煌綠可以抑制革蘭氏陽性細菌和除了大腸菌群的很多革蘭氏陰性細菌。 2）初發(fā)酵陽性管，不能肯定就是大腸菌群細菌，經(jīng)過證實試驗后，有時可能成為陰性。有數(shù)據(jù)表明，食品中大腸菌群檢驗步驟的符合率，初發(fā)酵與證實試驗相差較大。因此，在實際檢測工作中，證實試驗是必需的。大腸菌群測定MPN法檢驗幾點說明第21頁，共23頁，2022年，5月2